Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

Finite Element (FE) la modélisation est une technique d'ingénierie qui peut informatiquement calculer et cartographier l'ampleur et la localisation des souches agissant sur une structure ^1. Le modèle est constitué de la structure en 3D, représentée par un maillage de "éléments finis", et le résultat de l'analyse finale est régi par un certain nombre de facteurs, dont la structure et le nombre des éléments du maillage, l'ampleur et la localisation de la mécanique les charges et les propriétés des matériaux. Les propriétés des matériaux décrivent certains aspects du comportement d'un matériau dans un type donné de charge; Le module de Young (E) décrit l'élasticité du matériau tandis que le coefficient de Poisson décrit la diminution proportionnelle de la largeur d'un matériau à sa longueur lorsqu'un échantillon est étiré. la modélisation FE peut être utilisé pour calculer une variété de variables, y compris le déplacement, le stress, la pression et la contrainte agissant sur le modèle en prenant en compte les données d'entrée uniques sur la structure '; Forme s, l'emplacement et l'ampleur des charges et les propriétés des matériaux spécifiques.

La modélisation FE est largement utilisé dans l' ingénierie ² et de plus en plus pour des applications orthopédiques ³ et paléontologiques ^4. Dans le développement des forces biomécaniques sont connus pour agir comme un stimulus dans de nombreuses cellules pour activer les réponses des cellules ^5-8 et il est utile de prévoir deux positions relatives et des amplitudes des stimuli mécaniques à l' intérieur le développement de systèmes d'organes, cependant, actuellement de modélisation FE a été peu utilisé pour le développement du poisson zèbre.

Deux cartilages et des os se sont avérés être des matières mécanosensibles. Par exemple, une compression in vitro a été trouvé pour activer les voies chondrogéniques, tandis que la tension a été démontré que nécessaire pour la formation d'os ^neuf. FE analyse (FEA) a été exploitée pour modéliser les souches agissant sur des échantillons biologiques, y compris ceux qui agissent sur les éléments du squelette lors de l'os formation ^10. D' autres applications de développement comprennent son utilisation pour prédire la forme d'un joint après qu'il a été exposé à des forces biomécaniques théoriques ^11,12 et de montrer le modèle des souches présentes au cours de poussin genou morphogenèse joint ^8.

Ce protocole vise à partager l'expérience de générer des surfaces en 3 dimensions, mailles et modèles d'éléments finis à partir d'images confocale en vue de comprendre la mécanique des tissus en développement. Nous montrons aussi des moyens de valider les modèles FE si la capture réelle information de déplacement conjoint in vivo. Alors que nous utilisons la mâchoire zebrafish en tant qu'exemple les mêmes techniques peuvent être utilisées sur un petit système biologique pour lequel des informations sur la structure 3D du système musculo-squelettique peut être obtenu par imagerie confocale ou multiphotonique.

Toutes les étapes du protocole suivent l'Université du soin des animaux de Bristol et les lignes directrices de bien-être et ceux de la Home Office du Royaume-Uni.

1. Visualisation de l'appareil locomoteur Anatomie

NOTE: Pour visualiser la forme des éléments du squelette, de quantifier le muscle et d'identifier l'emplacement exact des attaches musculaires, immunocoloration (section 1.1) du poisson à l'âge approprié pour la myosine squelettique (qui révèle le muscle) et collagène de type II (pour visualiser cartilage). Vous pouvez également visualiser l'anatomie musculo - squelettique en utilisant des lignes de rapporteurs fluorescents transgéniques tels que le collagène a1 reporter COL2A1: mCherry ^13,14 pour visualiser le cartilage et la lente chaîne lourde de myosine reporter smyhc: GFP ¹⁵ pour visualiser la position des attaches musculaires (section 1.2).

lignes alternatives qui marquent le cartilage et les muscles peuvent fonctionner aussi bien.

1. fluorescent Immunostaining
   1. Fixer les larves au-delà de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) pendant 1 heure. Laver dans du PBS avec 0,1% de Tween 20 (PBT) et déshydrater dans 50% de methanol (MeOH) dans du PBT et 100% de methanol pendant 5 min, respectivement.
      Attention: PFA est toxique et doit être traité conformément à la fiche de sécurité matérielle.
      REMARQUE: Larve peut être stocké dans 100% de methanol jusqu'à ce que nécessaire.
   2. Réhydrater larve dans 50% de MeOH dans du PBT pendant 5 min. Laver à PBT pendant 5 min.
   3. Perméabiliser larve dans 0,25% de trypsine dans PBT sur la glace pendant 5-6 min. Laver à 4x PBT pendant 5 minutes chacun.
   4. Bloquer pendant 2-3 heures dans le sérum de 5% en PBT.
   5. Incuber les larves dans la dilution recommandée d'anticorps anti-lapin de type 2 du collagène et des anticorps anti-myosine souris dans 5% de sérum dans du PBT pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
      NOTE: La gamme de dilution recommandée est normalement sur la feuille de données d'anticorps. Choisissez des anticorps qui sont élevés contre les espèces différentes les unes aux autres et qui sont également diffélouer au tissu.
   6. Laver 6x larva pendant 15 minutes en PBT.
   7. Bloquer pendant 1-2 heures dans le sérum de 5% en PBT.
   8. Incuber dans les anticorps secondaires dans l'obscurité. Utiliser anti-souris marqué par fluorescence (550) et anti-lapin (488) des anticorps secondaires à une dilution appropriée dans 5% de sérum et PBT pour l'anticorps spécifique.
   9. Laver 6X pendant 10 minutes chacun en PBT et de l'image sur un microscope confocal 10X le plus tôt possible.
2. Imagerie musculosquelettique Géométrie
   1. Monter les larves ventral sur une lamelle en tiède 0,3-0,5% à faible point de fusion (LMP) agarose dans une solution de Danieau ^16.
      NOTE: Les poissons transgéniques devront être sous sédation dans 0,02% MS222 (Tricaine méthanesulfonate, pH 7) avant le montage et lors de l'imagerie.
   2. Prenez une pile d'image confocale de la région d'intérêt en utilisant le 10X objectif et le zoom numérique 2.5X environ. Préparer des images du canal vert et rouge en utilisant 488 nm et 561 nm lasers respectivement. L'image à une résolution de pixels de 512 x 512 avec un intervalle entre z plans de 1,3 pm et 3 moyennes de lignes. La pile résultante comprendra environ 100 z tranches.
   3. Exporter les données comme une série de tiff. Des projections maximales des éléments musculaires et du cartilage à partir d' une larve de poisson zèbre 5dpf sont représentés sur la figure 1.

2. Création d'une surface 3D

1. Choisissez un ensemble de données représentant pour chaque point de temps à 3, 4 et 5 dpf (choisir après la visualisation de plusieurs échantillons).
2. Ouvrez pile tiff 3 dimensions et sélectionnez tous les canaux dans le logiciel d'analyse. Faites un clic droit sur le canal du cartilage et sélectionnez le filtre d'image et de lissage: gaussien (figure 2B).
3. En vue du projet clic droit sur l'image filtrée et sélectionnez «segmentation d'image», puis «modifier nouvelle étiquette. Créer une nouvelle étiquette pour chaque matériau, à savoir, le cartilage et joint. Sélectionnez la région du cartilage de l'image (figure 2C, le signal blanc, contour violet) en utilisant l'outil de baguette magique. Utilisez l'outil de brosse pour éliminer le bruit des contours.
   NOTE: Si vous utilisez l'outil de baguette magique, cliquez sur "Tous les tranches».
4. Sélectionnez la région conjointe avec l'outil pinceau et affecter à un élément d' articulation (figure 2C, contour bleu)
5. plusieurs tranches lisses à la fois en sélectionnant la segmentation dans le menu supérieur et les étiquettes lisses. Faites un clic droit sur l'image et sélectionnez générer surface pour produire de rendre une surface 3D du composant (figure 2D).
6. Cliquez sur la surface et enregistrer des données sous forme de fichier hmascii pour l'importation dans le logiciel de maillage.

3. Calcul des Forces musculaires à être utilisé dans le modèle FE

1. Comptez le nombre de fibres musculaires à partir d' images confocale de smyhc: zebrafish transgénique GFP (Figure 1A, Arrowhead, 1C) et mesurer le diamètreeter des fibres pour calculer leur zone de section transversale ⁽² πr).
2. Identifier force appropriée par muscle unité de surface de la littérature. La force musculaire maximale générée par unité de surface pour les muscles squelettiques (40 larves de poisson zèbre nN / um ²⁾ ont été utilisés ^17.
3. Calculer les forces pour chaque groupe musculaire anatomique en multipliant le nombre de fibres et de leur région par la force par unité de surface. Voir le tableau 1.

4. Génération d'un maillage

1. Importez le modèle 3D généré dans la section 2 (ci-dessus) dans un logiciel capable de générer un maillage d'éléments finis.
2. Générer A2D mailles du cartilage et des surfaces articulaires en utilisant l'outil de pellicule rétractable dans le menu 2D. Choisissez une taille de l'élément approprié.
   Remarque: Utilisez une taille de l'élément entre 1,5-2,5. Si nécessaire, générer une gamme de surface 2D de taille différente maillages pour réaliser l'optimisation du maillage 3D (section 4.4).
3. Effectuer des contrôles de qualité de maillage trouvés sous les «2D> Outils> Vérifier éléments de panneau pour vérifier les éléments dupliqués, des insertions et des pénétrations dans le maillage. Fixer les angles dièdres en utilisant l'onglet utilitaire dans l'arbre du modèle.
4. Générer un maillage 3D des maillages surfaciques 2D de différentes taille de l'élément à l'aide du sous-panneau 3D> Tetramesh.
   REMARQUE: Comparer les résultats des différentes tailles de mailles et sélectionnez le modèle FE avec la plus faible taille de maille qui converge après de nouvelles simulations et ne compromet pas la définition de la fonction. L'exemple de la figure 3 contient 1,5 million d' éléments tétraédriques de cartilages de la mâchoire inférieure et a une taille d'élément 2D de 2,0.
5. Transformer le maillage donc le modèle de la mâchoire est à l'échelle comme par pile confocale en utilisant la géométrie> Distance panneau secondaire.
   REMARQUE: Vérifiez que le cartilage et les composants communs sont connectés dans le modèle par l'exportation d'un modèle fusionné ou en utilisant des liens.

5. Finite Element Model Construction

1. En utilisant des éléments finis (FE) des logiciels commerciaux, créer un modèle FE. Utilisation du muscle 3D et cartilage marqué piles confocaux générées dans la section 1 comme un guide, d'attribuer des noeuds qui correspondent à des points d'attache des muscles. Créer un vecteur entre deux noeuds représentant l'origine et l' insertion de chaque muscle (figure 3).
2. Créer un collecteur de type 'histoire de charge pour appliquer une «charge de C' pour chaque muscle. Précisez l'ampleur en Newtons (calculé à l' étape 3.3) et affecter le vecteur associé. La figure 3 montre les points de fixation pour la mandibule adductor (AM), protractor hyoïdien (PH) et intermandibularis (IM).
   NOTE: Pour les muscles de la mâchoire, la force contractile maximale est répartie entre l'origine et l'insertion de sorte que seulement 50% de chaque charge est appliquée à chaque site.
3. Affecter les propriétés du matériau isotrope élastiques appropriées tel que déterminé par la littérature. Le module de Young pour le cartilageet l'interzone dans ce modèle était de 1,1 MPa et 0,25 MPa , respectivement , et le coefficient de Poisson était de 0,25 pour les deux ^18,19.
4. Créer un collecteur de charge de type 'limite' pour appliquer des contraintes initiales sur le modèle. Allez à l'onglet Analyse> Contraintes et dans le sous-panneau créer, choisir les noeuds sur le modèle que vous voulez restreindre. Sélectionnez les degrés de liberté (DOF) que de limiter le mouvement du modèle à la meilleure approximation de son aire de répartition naturelle du mouvement.
   NOTE: Le modèle de la figure 3 a été limitée dans tous les axes de mouvement (DOF: 1, 2, 3 représentent x, y et z, respectivement) au ceratohyal pour l' ancrer dans l' espace à un point médian dans le modèle et dans le l' axe y et z au point où la palatoquadrate relie au reste du crâne du poisson zèbre (Figure 3, Tableau 1). Le modèle doit être limité dans les trois DOF ​​dans un seul nœud moins.
5. Créer une «étape de charge», pour chaque type de mouvement que vous souhaitez simulmangé (ie, ouverture, fermeture), sous le menu d'analyse et sélectionnez toutes les charges pertinentes (faites à la section 5.2) et les contraintes (faite à la section 5.4) pour simuler ce mouvement. Sélectionnez 'Static' dans le menu déroulant quand il apparaît.
6. modèle d'exportation, y compris les mailles, les charges, les contraintes et les propriétés des matériaux dans un format de fichier approprié, dans ce cas, le format ".inp".
7. Modèle de charge dans le logiciel d'analyse par éléments finis. Créer et exécuter un travail pour le modèle en utilisant le module d'emploi.
8. Analyser la sortie pour le stress, la tension, le déplacement, etc. trouvés dans les résultats onglet et le menu de visualisation (Figure 4 et 5).

6. Validation des Jaw Déformation / Déplacement Distances

1. Sélectionnez 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mcherry) zebrafish transgénique.
2. Légèrement anesthésier les larves avec 0,02% MS222 jusqu'à ce qu'ils cessent de répondre au toucher, mais leurs cœurs sont toujours en fouettant.
3. Monterles larves latéralement (tout anesthésié) sur des lamelles dans tiède 1% d'agarose LMP (composé dans une solution de Danieau).
4. Retirer l'agarose à partir autour de la tête et de la mâchoire avec une pince.
5. Rincer la solution fraîche Danieau (sans MS222) sur la tête de la larve d'enlever l'anesthésie à l'aide d'une pipette Pasteur jusqu'à ce que les mouvements de la bouche normales reprennent.
6. Utilisez un logiciel de capture vidéo pour prendre champ clair des vidéos à haute vitesse de mouvements de la bouche. Prenez des films d'environ une durée de minutes à la vitesse de trame la plus élevée, soit suffisante pour enregistrer plusieurs cycles d'ouverture de la mâchoire.
7. Choisissez les cadres qui montrent la mâchoire ouverte à son déplacement maximal. Mesurer la distance entre l'extrémité antérieure du cartilage de Meckel et la mâchoire supérieure (pointe de la plaque ethmoïde) en um.
8. Calculer le déplacement moyen de larves de poissons multiples.
9. Extraire des données de déplacement du modèle. Utilisez le déplacement moyen calculé 6.8 pour vérifier le comportement de déplacement modèle (

Immunocoloration pour le muscle (figure 1A) et le cartilage (figure 1B) ou l' imagerie de reporters transgéniques (figure 1C) permet à la structure 3D de la mâchoire à visualiser, ainsi que la masse musculaire associée. En imagerie à haute résolution , il était possible de construire un modèle qui reflète à la fois la forme en trois dimensions de la mâchoire (Figure 2) et l'emplacement et l' emplacement des charges (Figure 3). Utilisant des déplacements in vivo vus à travers la capture vidéo haute vitesse (Figure 4) nous avons vérifié que l'amplitude du mouvement dans le modèle était dans une fourchette réaliste.

Les modèles FE une fois l' exécution peuvent être utilisés pour afficher une série de données, tels que le stress (figure 5A), minimum et déformation principale maximale (figure 5B - K). Ces résultats sont trois dim ensional de sorte que le modèle peut être agrandie pour voir des motifs fins de détail (Figure 5E, 5I) tourné pour obtenir des points de vue pertinents (Figure 5F, 5G, 5J, 5K) et numériquement sectionnés (Figure 5E ', 5E' ', 5I', 5I '') pour montrer comment les modèles de contrainte, déformation ou changement de pression dans l'ensemble du modèle. Il est également possible d'extraire des données quantitatives à partir du modèle (non représenté). En vérifiant le modèle et en utilisant les propriétés des matériaux les plus précis, les charges les mailles et la forme du modèle FE peut être utilisé pour explorer la meilleure estimation de l'environnement mécanique vécue par les cellules pendant cette fenêtre de développement. Les résultats du modèle peuvent être directement comparés aux changements dans le comportement cellulaire et l' expression des gènes 20.

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Figure 1:. Des images représentatives des éléments musculo - squelettiques de la mâchoire inférieure zebrafish à 5 dpf piles confocaux représentatifs de la mâchoire inférieure des larves 5dpf tous montré avec antérieure vers le haut (A) immunocoloration pour A4.1025 qui colore tout myosine squelettique (B) immunocoloration pour collagène de type II qui marque tout le cartilage (C) Stack à partir d' une larve vivant exprimant les journalistes transgéniques COL2A1: GFP muscle lent (vert): cartilage (rouge) et smyhc marquage mCherry. IA: intermandibularis antérieure, PH: protractor hyoïdien, AM: adductor mandibulae, HI: hyoïdien inférieure, HI: hyoïdien supérieure, CH: sternohyoideus, MC: cartilage de Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: maillages représentatifs montrant les contraintes et les vecteurs de force maillages représentatifs pour une larve de 5 dpf pour (A) la fermeture de la bouche et.(B) ouverture de la bouche. Les points blancs représentent les endroits où le modèle est contraint et dans lequel les dimensions (par exemple, x et y ou x, y et z). des lignes blanches indiquent les positions des muscles, avec le vecteur de la force musculaire représenté par des flèches blanches. Rouge montre cartilage et jaune l'interzone. Ce chiffre a été modifié depuis le matériel supplémentaire précédemment publié dans Brunt et al. 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4:. Tests de sensibilité FE-modèle simulant la mâchoire déplacement dans zebrafish 5dpf pour le cartilage différent et des modules de Young interzones. Mâchoires déplacement (ouvert à fermé en um) est marqué sur la mâchoire; enregistré à l'aide de la touche de couleur. Chaque modèle (A - L) a une combinaison différente de cartilage (c = 1,1, 3,1 ou 6,1 MPa) ou interzone (i = de 0,25, 0,5, 0,75, ou 1 MPa) propriétés. Horizontal flèche noire met en évidence la valeur de la mâchoire de déplacement à l'extrémité du cartilage de Meckel (représenté par la flèche noire verticale). M et N images fixes à partir de vidéos 5 dpf larves montrant au minimum, à savoir, la mâchoire fermée (M) et maximum, à savoir, mâchoire complètement ouvert (N) avec les deux superposée (O) - ligne blanche sur O représente le déplacement (de 43 um). Dans ce cas , par rapport propriétés du cartilage de 1,1 avec une interzone de 0,25 (A) meilleur match les déplacements observés dans les poissons vivants (O). Panneaux AL de cette figure ont été publiées antérieurement dans Brunt et al. 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.

Figure 5: Les données représentatives des modèles EF simulation FE-modèle de tous les muscles appliqués dans un 5 dpf larve (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) de déformation minimum principal (E min. P, μɛ) (C) déformation principale maximale (E max. P., μɛ). simulation FE-modèle de souches principales maximales et minimales lors de l'ouverture de la mâchoire. (D - K): déformation principale maximale (. E Max P., μɛ) en (D) vue de la mâchoire ventral et (E) ventral vue commune (E) montre l' emplacement des sections proximale-distale à travers le cartilage de Meckel articulaire et l'interzone (E ') et (E'), respectivement. (F): latéralmâchoire vue. (G): vue latérale commune. (H - K): la souche principale minimale (. E Min P, μɛ) dans (H) vue de la mâchoire et ventrale (I) ventrale de vision commune. (I) montre l' emplacement des sections proximale-distale à travers l'articulation du cartilage de Meckel et interzones en (I ') et (I' ') respectivement (J): vue latérale de la mâchoire. (K): vue latérale commune. Ce chiffre a été publié précédemment dans Brunt et al. 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Muscle quantification. Calculées forces musculaires moyennes pour la Intermandibularis Anterior, Adductor mandibule et Protractor hyoïdien à 5 dpf utilisant 40 nN / um 2 (valeur par unité de surface prise de la référence 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Quelques données sur les figures 3-5 a été tiré à part de J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., La modélisation par éléments finis prédit des changements de forme conjointe et le comportement des cellules due à la perte de la souche musculaire dans le développement de la mâchoire, 3112-22. 2015, avec la permission de Elsevier ^15.