Summary
نحن هنا وصف طريقة للحصول على وتحديد جزء من السكان تتميز حديثا من البالعات عملاق المستمدة من العدلات. هذه الخلايا تنمو في الثقافة من العدلات الدم البشري الطازج، وتتميز البلعمة، الالتهام الذاتي، وحجم كبير جدا، وعمر ممتد. هذا الأسلوب هو ضروري لمواصلة التحقيق هذا فريدة من نوعها حيوانية المستمدة من العدلات.
Abstract
العدلات (السوداء) واشتهر مهامهم أكلة ضد غزو الجراثيم والميكروبات. لديهم أقصر فترة نصف العمر بين الكريات البيض وفي حالتها غير المفعلة ملتزمون بشكل جوهري إلى موت الخلايا المبرمج. عندما تجنيدهم للمواقع التهابات حل التهاب، فإنها تنتج مجموعة واسعة من الجزيئات السامة للخلايا مع قتل المضادة للجراثيم قوية. ومع ذلك، عندما يتم إطلاق هذه الجزيئات السامة للخلايا قوية بطريقة غير المنضبط أنها يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة بها. في السنوات الأخيرة ومع ذلك، ويتجلى تعدد العدلات على نحو متزايد، من خلال إظهار وظائف اللدونة وimmunoregulatory. لقد حددنا مؤخرا جزء من السكان المستمدة من العدلات الجديد، الذي يتطور من تلقاء أنفسهم في ظروف ثقافة القياسية بدون إضافة عوامل السيتوكينات / النمو مثل محببة عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) / انترلوكين (IL) -4. قدراتهم أكلة من بقايا العدلات تسهم إلى حد كبير في زيادة قدرتهاحجم هائل. البالعات العملاقة بالتالي فإنها وصفت بأنها (Gφ). على عكس العدلات، وعاش Gφ طويل في الثقافة. وهي تعبر عن مجموعة من التمايز (CD) علامات العدلة CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / الميلوبيروكسيديز (MPO) / الإيلاستاز العدلات (NE)، وتكون خالية من الوحيدات علامات النسب CD14 / CD16 / CD163 وشجيري علامات CD1c / CD141 . كما أنها تأخذ ما يصل اللاتكس وزيموزان، والاستجابة من قبل انفجار التأكسدي للتحفيز مع opsonized-زيموزان وسلطة النقد الفلسطينية. Gφ أيضا أن أعرب عن زبال مستقبلات CD68 / CD36، وعلى عكس العدلات، استيعاب أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة (oxLDL). وعلاوة على ذلك، على عكس العدلات جديدة، أو وحيدات مثقف، والرد على oxLDL امتصاص عن طريق زيادة إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الخلايا البالعة تحتوي المرتبطة أنيبيب بروتين-1 سلسلة ضوء 3B (LC3B) فجوات المغلفة، مما يدل على تفعيل الالتهام الذاتي. باستخدام مثبطات معينة فمن الواضح أن كلا من البلعمة والالتهام الذاتي هي prerequisiقسم التدريب والامتحانات لتنميتها وNADPH المرجح أوكسيديز ROS يتوقف. نحن هنا وصف طريقة لإعداد هذه حيوانية جديدة من الخلايا البلعمية المستمدة من العدلات طويلة الأجل في الثقافة والهوية وخصائصها المعروفة حاليا. هذا البروتوكول هو ضروري للحصول على وتميز Gφ من أجل مواصلة التحقيق في أهمية وظائفها.
Introduction
العدلات النوى (السوداء) تشكل أكبر عدد الكريات البيض في الدم، بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الجراثيم من خلال إنتاج مجموعة واسعة من الجزيئات السامة للخلايا. وكانت وجهة النظر التقليدية منذ فترة طويلة أن تعميم الدم، يدم طويلا، البالعات المهنية، والتي هي أول من يصل إلى مواقع التهابات حادة لمكافحة العدوى والمساعدة في إزالة مسببات الأمراض والجزيئات الضارة. 1 في دولتهم غير المفعلة، العدلات ملتزمة بشكل جوهري إلى موت الخلايا المبرمج. عند الانتقال من الدم إلى مواقع التهابات، والعدلات تخضع تفعيل لحل التهاب. هم أن phagocytose وقتل الكائنات الحية الدقيقة الغازية، من خلال إنتاج مجموعة واسعة من الجزيئات السامة للخلايا أنواع الاكسجين التفاعلية مثل (ROS)، والأنزيمات التحللي كالإيلاستاز العدلات (NE) وcathepsins مع نشاط ميكروبات قوية. من أجل مسببات الأمراض فخ، العدلات أيضا إطلاق سراح الفخاخ خارج الخلية (المستجدة) والتي تتكون من المواضيع ونين النووية التي تحتوي على الببتيدات المضادة للبكتيريا والإنزيمات المختلفة التحللي. ومع ذلك، جامحا لهذه الجزيئات السامة للخلايا من العدلات يمكن أيضا إدامة الاستجابات الالتهابية وحمل الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها. 2 لذلك، وإزالة فعالية العدلات أفكارك الضامة (Mφ) والخلايا الجذعية (DC) أمر حاسم لحل التهاب. 3، 4، 5، 6
في السنوات الأخيرة ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن العدلات هي غاية خلايا متعددة الاستعمالات، التي تذهب إلى ما هو أبعد البلعمة وقتل الممرض وظائف. 6 و 7 بواسطة تمر فتيلة أو التنشيط، العدلات اللدونة تكتسب اهتماما تدريجيا. عرضت العدلات على سبيل المثال، تحدى البكتيريا والمتفطرات لتفرز انترلوكين (IL) -10 والسيطرة على الاستجابة الالتهابية، مما يشير إلى وجود استجابات المناعية التنظيمية. وقد أظهرت 8 العدلات بعد الإنقسامية إلى عبر التمايز إلى خلايا Mφ تشبه، أو خلايا DC-مثل قبل هضم وعرض أجزاء المستضد عندما تعامل مع السيتوكينات وعوامل النمو، 9، 10 وبالتالي، يخدم دورا حاسما في دمج الفطرية والتكيفية الردود. 3 و 6 تنشيط عوامل النمو الترويج ابتلاع العدلات أفكارك أو الحطام الخلية، وبالتالي، تسهيل إزالة الأنقاض في مواقع التهابات وحل التهاب، 3، 9 خاصة عندما يكون نظام التخليص Mφ / DC غير كاف أو طغت، 11، 12 مما يشير إلى احتمال "التنظيم الذاتي" للمساعدة في إعادةحل الاستجابة الالتهابية. هذا، منذ موت الخلايا المبرمج هو شكل من أشكال التنظيم الموت الذاتي التي يمكن أن تحول دون الإفراج خارج الخلية من المركبات السامة للخلايا وبالتالي منع إصابة الأنسجة المحيطة بها. 6
البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة هو ميزة أخرى لتفعيل العدلات وتجلى عن طريق العلاج مع مختلف العوامل المضيفة المشتقة مثل محببة عامل تحفيز مستعمرة (G-CSF)،-محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF)، السيتوكينات الالتهابية مثل الانترفيرون ( IFN) -γ، عامل نخر الورم (TNF) -α و / أو الممرض المنتجات المشتقة، وبالتالي السماح العدلات لتعدل استجابة بقائهم على قيد الحياة. 6 في الواقع، بقاء العدلات هو شرط أساسي ليونة، وكان مرتبطا مع قدرتها على أداء البلعمة. 6، 13 وبناء على ذلك، فقد تبين أن أشرك في المظهرية والوظيفية التغييرات التي depenدائرة التنمية الاقتصادية على التعبير الجيني upregulated عن طريق حفز تركيب البروتينات الجديدة تشارك في تمديد عمر العدلات، وتتضاءل موت الخلايا المبرمج. 10
على عكس العدلات التي هي قصيرة الأجل وجوهري الخضوع لموت الخلايا المبرمج في الثقافة، أو العدلات تنشيط عوامل السيتوكينات / النمو، المذكورة أعلاه، والتي قمنا بمد عمر، حددنا مؤخرا، حيوانية صغيرة جديدة من العدلات الذي يتطور بشكل عفوي في الثقافة المعيارية لفترات طويلة الشروط من العدلات الدم الإنسان المعزولة حديثا دون إضافة خارجيا السيتوكينات أو عوامل النمو. 14 البالعات العملاقة وتسمى هذه الخلايا المشتقة العدلات، والتي لم توصف من قبل في الأدب (Gφ). وGφ قمنا بمد عمر في الثقافة، ويتم تطويرها بالكامل في حدود 5-7 أيام، وتتميز ملامح شكلية فريدة من نوعها، والتعبير المظهري وظائف. يتم تكبير أنها إلى حد كبير نتيجة لautophagocytosis من بقايا المتعادلة الميتة، ظهور تجاويف، ويحتوي على جسيم حال بلعمي. وGφ تعبير عن حبيبات العدلات علامة محددة - مجموعة من التمايز (CD) 66B، علامات حبيبات أليف اللازورد - CD63 والميلوبيروكسيديز (MPO) وعلامات العدلات إضافية مثل CD11b، NE، CD15، مفارز NADPH أوكسيديز gp91- phox وp22- phox، و-LC3BII الالتهام الذاتي علامة. 14، 15 وظيفيا، وبنشاط اتخاذ المتابعة حبات اللاتكس والجسيمات زيموزان، وتوليد ROS ردا على زيموزان وphorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) التحفيز. ومن المثير للاهتمام، على عكس العدلات جديدة، Gφ أيضا عن بكثافة مستقبلات زبال CD68 و CD36، اتخاذ المتابعة أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة (oxLDL)، وتوليد ROS ردا على التحفيز مع oxLDL. بالإضافة إلى ذلك، Gφ تخلو من علامات نسب الوحيدات CD14، CD16 وCD163 أو علامات شجيري CD1c وCD141. وعلاوة على ذلك، فاgocytosis والالتهام الذاتي، ومن المرجح الوظيفي أوكسيديز NADPH هما شرطان أساسيان لتنميتها. هذه منذ، البلعمة المانع cytochalsin باء، ومثبطات الالتهام الذاتي 3-methyladenine (3-MA) وbafilomycin (BafA1) وNADPH أوكسيديز المانع - diphenylene iodonium (DPI) - منع تطورها. بالإضافة إلى ذلك، وحيدات / العدلات المشترك الثقافات وكذلك التعرض لنقص الأكسجين المتقطع يعوق تنميتها، في حين أن التكيف العدلة لنقص الأكسجين المستمر واضحا. 14،15 ويتضح منها تطوير المقترحة في الثقافة في الشكل 1 البروتوكول. وفي هذه الورقة تصف خطوة بخطوة إعداد Gφ من المعزولة حديثا تعميم العدلات الدم البشرية وتطورها، وتحديد وبعض الخصائص الأساسية. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لمواصلة التحقيق والكشف عن طيف واسع وأدوار هذه صفها حديثا وفضول العدلة المستمدة Gφ من أجل characterizالبريد أهميتها ووظائفها المحتملة.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتنمية الخلايا العملاقة في 7 الثقافات يوم العدلات. ويقترح أن في مواقع التهابات (1) العدلات الخضوع موت الخلايا أفكارك، و(2) طوقت غشاء الإفراج شظايا تحتوي على الحطام النووي، حبيبات (الأخضر والنقاط الحمراء)، وغيرها من المكونات الخلوية التي تؤدي آليات الالتهام الذاتي. (3) البالعات العملاقة (Gφ) وضع في الثقافات العدلات على المدى الطويل خالية من السيتوكينات أو عوامل النمو من خلال استيعاب الهيئات أفكارك والحطام العدلات، مع الحفاظ على وظيفية oxidase.They NADPH تتميز مختلف النيتروفيل CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / علامات NE، جسم بلعمي كبيرة تضم حبيبات والحطام الخلية، ومستقبلات زبال CD36 و CD68. جيجابايت1؛ هي خلايا mononucleated في الغالب، قادرة على استيعاب أيضا العديد من الأجسام وLDL المؤكسد وتوليد ROS. الأغشية من فجوات ملء Gφ تحتوي LC3B (ملحوظ في الزرقاء الداكنة)، علامة غشاء autophagosomal، مما يشير إلى وجود ارتباط بين صارمة الالتهام الذاتي وتشكيل بلعمية العملاقة. Gφ لا تتطور في المتوسط تحتوي على GM-CSF / IL-4. أيضا، مثبطات مثل أوكسيديز المانع NADPH - diphenylene iodonium (DPI)، ومثبطات الالتهام الذاتي 3-methyladenine (3-MA) وbafilomycin (BafA1) والبلعمة المانع مثبط حركة الخلايا B (. خلوي ب) بإلغاء تشكيلها. (4) ويمكن أن تشمل وظائف Gφ المحتملة في الجسم الحي خصائص مضادة للأو الموالية للالتهابات والمشاركة في عمليات تصلب الشرايين (ويستند هذا الرقم على النتائج التي توصلنا إليها 14 و 15 و تم تعديلها من التحرير المصاحب التي كتبها Berton 20). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة حقوق الإنسان المحلية وفقا لإعلان هلسنكي، ووقع جميع المشاركين استمارة الموافقة المسبقة.
1. العدلات عزل وتطوير Gφ في الثقافة
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام معقم lipopolysaccaride الصف الأنسجة (LPS) حلول خالية في غطاء تدفق الحيوية السلامة رقائقي. لا تقم بإضافة المضادات الحيوية، والسيتوكينات أو عوامل النمو للمعهد حديقة النصب التذكاري روزويل (RPMI) -1640 المتوسطة.
- الحصول على 40 مل على الأقل الدم الوريدي من البالغين الأصحاء الصغار باستخدام مجموعة المنوال فروة الرأس العقيمة. سحب الدم في أنابيب تحتوي على vacutainer الإيثيلين رباعي حمض الخليك K 3 الملح (K 3 EDTA) وتخلط بلطف. إبقاء الدم في درجة حرارة الغرفة.
- عزل العدلات من قبل اثنين من خطوة متدرجة الكثافة متقطع باستخدام polysucrose في 1.119 و 1.077 غرام / مل. تقديم حلول لدرجة حرارة الغرفة قبل استخدام.
ملاحظة: أثناء الطرد المركزي، الدم الحمراءيتم تجميع الخلايا (كرات الدم الحمراء) التي polysucrose والرواسب بسرعة. تم العثور على الخلايا وحيدة النواة (وحيدات / الخلايا الليمفاوية) بين البلازما العلوي / polysucrose -1077 واجهة، في حين تم العثور على العدلات فقط فوق كرات الدم الحمراء، في polysucrose -1077 / 1119 واجهة (انظر الشكل 2). وتسمح هذه الطريقة فصل وقت واحد من الخلايا وحيدة النواة والعدلات من نفس الشخص.
الشكل 2: عزل العدلات من الدم الجامع الإنسان. Polysucrose في 1.077 غرام / والطبقات مل بعناية على رأس polysucrose-1.119 غرام / مل لتشكيل التدرج متقطع. ثم الطبقات الدم كله المخفف على رأس polysucrose-1.077. وتتعرض أنابيب مباشرة إلى الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 30 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة دون فرامل. لاحظت ثلاثة نطاقات مختلفة. (أ) الخلايا وحيدة النواة، (ب) خلايا النوى (السوداء)،و (ج) خلايا الدم الحمراء (RBC) في الجزء السفلي من الأنبوب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إضافة 12 مل polysucrose-1119 على الجزء السفلي من 50 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين المخروطية.
- طبقة بعناية 12 مل من polysucrose-1077 على polysucrose -1119.
- تمييع 10 - الدم 12 مل كله إلى الحجم النهائي من 24 مل من الدم مع أيون الحرة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 2٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين (مرحبا-FCS). طبقة بعناية 24 مل من الدم الكامل المخفف على التدرج العلوي من الأنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-24 درجة مئوية) دون فرامل.
ملاحظة: الطرد المركزي في درجات حرارة منخفضة قد يؤدي إلى تراكمها الخلية وضعف الانتعاش. - بعناية إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي withouر تعكير التدرج. ينبغي مراعاة طبقتين مبهمة (A: خلايا وحيدة النواة وباء: PMN، مبين في الشكل 2).
- نضح وتجاهل السائل يصل إلى 0.5 سم فوق طبقة A. نقل (أو تجاهل) خلايا من هذه الطبقة إلى أنبوب علامة "وحيدات النوى".
- نضح وتجاهل السائل يصل المتبقية إلى 0.5 سم فوق طبقة B. نقل الخلايا من هذه الطبقة إلى أنبوب المسمى "PMN".
- تجمع PMN من كل اثنين من أنابيب التدرج ويغسل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ مرحبا-FCS إلى الحجم النهائي من 30 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 200 x ج، وإزالة طاف وتجاهل.
- للتخلص من تلوث خلايا الدم الحمراء (RBC)، إضافة 3 مل من ناقص التوتر 0.2٪ المثلج كلوريد الصوديوم العقيمة حين إعادة التعليق على بيليه عن طريق رسم بلطف والخروج مع 1 مل العقيمة طرف الماصة. الحفاظ على الجليد لمدة 30 ثانية.
- بعد 30 ثانية، واستعادة تساوي التوتر وذلك بإضافة 3 مل من معقم 1.6٪ الجليد كلوريد الصوديوم البارد إلى أنبوب.
- إلى 6 مل من المياه المالحة متساوي التوتر، إضافة 6 ملتر من قبل تحسنت (37 ° C) RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 2٪ مرحبا-FCS وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 12 دقيقة. تجاهل طاف. بيليه PMN يجب أن تكون نظيفة من التلوث RBC.
ملاحظة: إذا الملوثة RBC، يظهر بيليه PMN المحمر. - إذا تبقى بعض RBC تلويث، كرر الخطوات من 9 و 10 مرة أكثر.
- Resuspend وبيليه خلية في 4 مل RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مرحبا-FCS وعدد الخلايا لتحديد تركيز والجدوى من الاستبعاد التريبان الأزرق.
- ضبط تركيز إلى 1،25 حتي 1،5 × 10 6 PMN / مل (اعتمادا على احتياجات التجريبية)، ولوحة 1.0 مل / جيد في 24 لوحة جيدا.
ملاحظة: نقاء العدلات في عدد السكان محببة تجاوز دائما 95٪، وفقا لتقييم مايو GRÜNEWALD بالغيمزا تلطيخ والمجهر الضوئي. - بعد الغرس، ووضع الخلايا في ترطيب 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- استبدال المتوسط كل 3 أيام بواسطة الشفط بلطف نصفعلى المدى المتوسط وإضافة نفس الحجم من متوسطة RPMI-1640 جديدة تستكمل مع 10٪ مرحبا-FCS. استخدام LPS حلول حرة والمركبات وانخفاض مستويات LPS في مرحبا-FCS (0.05 نانوغرام / مل أو أقل).
ملاحظة: تغيير المتوسطة لطيف لا بد منذ Gφ، التي تنمو في ثقافة لا نعلق بحزم إلى الطبق الثقافة وغسل قوية قد غسل أيضا على خلايا النامية. ظهور Gφ ملحوظ في 3-4 أيام بعد زراعة PMN، اعتمادا على التبرع بالدم. يتم تنفيذ معظم التحليلات والمقايسات وصفها هنا بين 6-7 أيام في الثقافة، عندما Gφ تكون كبيرة جدا في الحجم. وتجدر الإشارة إلى أن إضافة 1-10 LPS مل / الحرس الوطني إلى وسيلة RPMI-1640 لم يؤثر على نمو Gφ في الثقافة. 14
2. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهر
- إعداد cytospins 16 من العدلات المعزولة حديثا، ومن 7 ضعت اليوم الثقافات Gφ(المعد في القسم 1).
ملاحظة: لزيادة تركيز Gφ في طبق للتحليلات مختلفة، بلطف إزالة نصف المتوسط. تأكد من أن Gφ لا المكتشفة في المتوسط إزالتها عن طريق فحص المتوسطة تحت المجهر الضوئي. ثم، بشكل مكثف الماصة المتوسطة المتبقية لإزالة الالتزام على محمل الجد Gφ. الطرد المركزي متوسطة لمدة 10 دقيقة في 200 x ج، و resuspend بيليه في 100-120 المتوسطة ميكرولتر.- استخدام 100-120 ميكرولتر من المتوسط تحتوي على خلايا لكل شريحة. إعداد الشرائح مكررة أو ثلاث نسخ من كل معاملة. تدور لمدة 7 دقائق عند 84 ز س.
- تجف الخلايا نسج وإصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة تحت غطاء الكيميائية. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني (~ 100 ميكرولتر لبضع ثوان في غسل). لتلطيخ الخلايا، permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ويغسل 5X مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: في جميع المراحل، استخدم عازلة / volu الحل المناسبلي لتغطية محيط الخلايا على الشريحة. استخدام قلم حاجز مسعور لتحديد خلايا محيط.
تحذير: لامتصاص العرق هي سامة. تجنب ملامسة الجلد والعينين. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - خلايا كتلة مع 10٪ مصل الماعز العادي في RPMI-1640 المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. يغسل مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الأجسام المضادة واحد (أب) أو مزيج من الماوس والأجسام المضادة الأولية أرنب (عبس) في 1: 100 التخفيف (~ 100 ميكرولتر). احتضان بين عشية وضحاها (18-20 ساعة) في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هنا، وشملت الماوس وحيدة النسيلة عبس: مكافحة CD14، ومكافحة CD63، ومكافحة CD66b، ومكافحة CD1c، CD15 المضادة، ومكافحة السيتوكروم ب 245 سلسلة الخفيفة (تحديد phox p22-). وشمل الأرنب بولكلونل القيمة المطلقة: مكافحة CD68، ومكافحة CD36، ومكافحة LC3B، ومكافحة الميلوبيروكسيديز، الإيلاستاز مكافحة العدلات (NE)، ومكافحة Nox2 / gp91- phox عبس. وتضمنت الضوابط نمط إسوي IgG1 النقي الماوس وIgG2، ومفتش أرنب. Preparه الحصول وتقاسم المنافع وفقا لتعليمات الشركة الصانعة واستخدام حجم مناسب (حوالي 100 ميكرولتر) لتغطية محيط الخلايا. - غسل الخلايا واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية 1/400 Cy2-CF (488A) الماعز -conjugated المضادة للأرنب مفتش (الأخضر) و / أو Cy5 (CF 647) الماعز -conjugated المضادة للماوس مفتش (الحمراء) في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: تمييع وإعداد عبس وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. - بعد الغسيل، جبل الشرائح مع قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة، تحتوي على 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) لتلطيخ النووي، ثم وضع على الفور انزلاق الغطاء.
- تحليل الشرائح من خلال نظام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر باستخدام المجهر مضان وخطة آبو 40X الهدف النفط الغمر. إجراء تحليل في غضون 30 دقيقة إلى 2 ساعة بعد إعداد الشرائح أو الحفاظ على 4 درجات مئوية خلال الليل.
- حساب مساحة الخلية وكثافة مضان باستخدام برامج التصوير (مثل J صورة). للمشاركة في توطين، لا غنى عنهntify من قبل البرامج باستخدام Manders التداخل معامل (وزارة التجارة) (17).
ملاحظة: فقط الخلايا مع وزارة التجارة> 0.6 يمكن اعتباره الخلايا مع كبير شارك في التعريب.
- حساب مساحة الخلية وكثافة مضان باستخدام برامج التصوير (مثل J صورة). للمشاركة في توطين، لا غنى عنهntify من قبل البرامج باستخدام Manders التداخل معامل (وزارة التجارة) (17).
3. التهجير من PMN عبر الخلايا البطانية: آثار IL-8 على بلعمية العملاق (Gφ) تشكيل
ملاحظة: إدراج استخدام 24-جيدا ثقافة خلية منفذة لفحص الخلايا التهجير.
- معطف الغرفة العليا للإدراج مع 150 ميكرولتر فبرونيكتين في تركيز 50 ميكروغرام / مل، والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أضف إلى الغرفة العليا 5 × 10 4 EA.hy926 الخلايا البطانية / جيد، معلق في 150 ميكرولتر من صيغ معدلة المتوسطة Dulbecco والنسر (متوسطة النمو الكامل).
ملاحظة: تأكد من أن أحادي الطبقة البطانية هي متكدسة قبل الاستخدام. - لمجلس النواب، إضافة 700 ميكرولتر من متوسط النمو الكامل.
- ضع قابلة للاختراقإدراج ثقافة خلية في صواني العنقودية والثقافة الخلايا البطانية EA.hy926 لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
ملاحظة: في موازاة ذلك، في اليوم الثاني تحضير PMN الطازجة (كما هو موضح في المادة 1). - بعد 2 أيام، استبدال المتوسطة في الغرف السفلية والعلوية للإدراج.
- لمجلس النواب، إضافة المتوسطة RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ IH-FCS وانترلوكين (IL) -8 بتركيز نهائي 50 نانومتر / مل. لا تقم بإضافة IL-8 للتحكم في الغرف السفلية.
- لكل غرفة العليا، إضافة 10 6 PMN العذبة في 100 ميكرولتر من المتوسط RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ IH-FCS.
- احتضان صواني الكتلة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 90 دقيقة.
- بعد 90 دقيقة الحضانة، وإزالة الخلايا من الجزء العلوي والسفلي غرف منفصلة وتعول مجموعة حيوانية. وأضافت خلايا صريحة في كل غرفة كنسبة مئوية من مجموع الخلايا.
ملاحظة: إزالة بعناية الخلايا من تعمدت العلويإيه من قبل pipetting بلطف لتجنب إزالة الخلايا البطانية ونقل إلى أنبوب العقيمة. إزالة الخلايا من مجلس النواب قبل pipetting وغسل النواب مع 500 ميكرولتر ونقل إلى أنبوب معقم الثاني. - تجمع 10 6 خلايا من عدة آبار transmigrating (النواب) وغير المهاجرة (الغرفة العليا) كسور PMN وثقافة كل لمدة 7 أيام دون عوامل النمو على النحو المحدد في الخطوات 14-16 (القسم 1).
- تدور الخلايا على الشرائح 16 و تحليل الخلايا المتقدمة في كل حالة الثقافة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر كما هو موضح في القسم 2.
Representative Results
العدلات Autophagocytosis والتنمية في الثقافة
ويرد autophagocytosis العدلة وتنميتها في Gφ غضون 7 أيام في الثقافة في أرقام 3 و 4. قبل أيام 4-7، وكان حجمها الموسع إلى حد كبير، 15 وكان autophagosytosis واضحا منذ 90 دقيقة بعد العدلات مع بقع غشاء فلوري (PKH-26، أحمر، PKH-67 والأخضر) زراعة المشترك. 14 كعنصر تحكم في هذا حيوانية العدلة، تم علاج بعض الثقافات العدلات أيضا مع GM-CSF / IL-4. زادت الخلايا المعالجة خلوى في حجم ضمن 7-14 أيام في الثقافة كما هو موضح سابقا. 18، 19 ولكن، كانت أصغر من Gφ وكان التوقعات هيولي تشبه DC-مثل الخلايا (الشكل 5)، كما ذكرت سابقا ب ذ أولر وآخرون. 19 أيضا، كانت GM-CSF / IL-4 الخلايا المعالجة السلبية أو كان التعبير CD66b منخفض، 15 مما يدل بوضوح الاختلافات الشكلية ويحتمل أن تكون وظيفية أيضا.
الشكل (3): Autophagocytosis في تطوير العملاق البالعات (Gφ) في الثقافة. وصفت العدلات النقاء المعزولة حديثا مع PKH-67 (الأخضر) أو PKH-26 (الأحمر) غشاء الأصباغ الفلورية في وقت الصفر، ثم شارك في تربيتها ومتابعتها لمدة سبعة أيام. وقد نسج الخلايا على الشرائح الزجاجية، كانت ملطخة النوى مع دابي وتم تحليل العينات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. Autophagocytosis بالفعل ملحوظ بعد 90 دقيقة من الثقافة المشتركة. دمج من الأحمر والأخضر إلى الأصفر والبرتقالي ويتضح ذلك بجلاء في Gφ النامية. ملفات / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تطوير العملاق البالعات (Gφ) في الثقافة. وتلت العدلات النقاء المعزولة حديثا يصل إلى 7 أيام في الثقافة. وقد نسج الخلايا على الشرائح الزجاجية في فترات الزمنية المشار إليها، ملطخة مايو GRÜNEWALD بالغيمزا، وتحليلها مع المجهر مشرق الميدان. وتقدم الفرد مع قليل من الحمضات للمقارنة. لاحظ أن حجم الحمضات لم يتغير في الثقافة. النفط التكبير 100X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الرقم 5: مقارنة بين تنمية العملاق البالعات (G φ) وGM-CSF / IL المعالجة العدلات في الثقافة. (A) مايو جرونوالد بالغيمزا العدلات الملون مثقف دون (Gφ) ومع GM-CSF / IL-4 لمدة 7 أيام. وقد تم تحليل عينات مع المجهر مشرق الميدان. التكبير، X40. خلايا المتقدمة في الثقافات مع المتوسط تستكمل مع GM-CSF / IL-4 تظهر التوقعات هيولي على نطاق واسع ولكن هي أصغر من Gφ. وصفت (ب) العدلات معزولة طازجة مع PKH-26 (الأحمر) صبغ والمثقف في المتوسط خالية من خلوى لمدة 7 أيام أو المسمى مع 67 PKH (الأخضر) صبغ والمثقف في المتوسط تستكمل مع GM-CSF / IL-4 ل 7 أيام. ثم، كانت مختلطة الخلايا المتقدمة في نسبة 1: 1، وشارك في تربيتها لمدة 2 ساعة. تم إصلاح الخلايا وتحليلها بواسطة ميكر متحد البؤر oscopy. تم تعديل هذا الرقم من المرجعية. 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لمزيد من التحقيق في مسار التنمية Gφ، وتلت التغييرات الخاصة بهم الشكلية أيضا بواسطة المجهر مرور الزمن. فيديو-1 (يوم 3 إلى يوم 4) والفيديو-2 (يوم 4 إلى 5 أيام) تثبت تنميتها في الثقافات العدلات تنقيته. هذه Gφ هي غير ملتصقة أو تمسكا باستخفاف مع قدرة الحركة محدودة واستيعاب بنشاط المحيطة بقايا العدلات والحطام. في الفيديو 3، تتم مقارنة حركة الوحيدات المستمدة-Mφ وGφ في ثقافة الوحيدات / العدلات مختلطة. يزحف على Mφ بنشاط (يسار الخلية غير المسماة). وGφ (يمين)، هو مشرق PKH-26 خلية المسمى.
ether.within صفحة = "دائما"> 
فيديو-1: يوضح تنمية البالعات العملاق في الثقافات تنقية PMN في أيام 3-4 بواسطة الميكروسكوب الوقت الفاصل. تم متابعتها العدلات في الثقافة من يوم 3 إلى يوم 4 قبل الوقت الفاصل بين microscopy.The نظام المجهري الوقت الفاصل يتكون من مقلوب المجهر الفلورسنت الآلية، وكاميرا عالية الدقة CCD B / W، مع على خشبة المسرح الحاضنة. وقد اتخذ صورة اكتساب القبض على الوقت الفاصل بين كل 10 دقيقة. نشرت أصلا في اشارة 14 الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو.
الفيديو 2: يوضح تنمية البالعات العملاق في تنقية PMN الثقافة في أيام 4-5 مشاركات Tiالمجهر لي الفاصل. تم متابعتها العدلات في الثقافة من يوم 4 إلى 5 أيام بواسطة المجهر مرور الزمن. ويتكون نظام الفحص المجهري الوقت الفاصل بين مقلوب المجهر الفلورسنت الآلية، وارتفاع القرار B / W اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا، مع على خشبة المسرح الحاضنة. وقد اتخذ صورة اكتساب القبض على الوقت الفاصل بين كل 10 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو.
الفيديو 3: بلعمية العملاق وبلعم وضعت في المشارك الثقافة. وأعقب المتابعة حيدات / العدلات ثقافة مشتركة من يوم 4 إلى 5 أيام بواسطة المجهر مرور الزمن. بلعم المستمدة من الوحيدات (يسار)؛ مشرق (PKH-26 الملون الخلية) بلعمية العملاقة المستمدة من العدلات (يمين). ويتكون نظام الوقت الفاصل بين المجهري للفيديو من المقلوب ميكر الفلورسنت الآليةoscope، وارتفاع القرار B / W اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا، مع على خشبة المسرح الحاضنة. وقد اتخذ صورة اكتساب القبض على الوقت الفاصل بين كل 10 دقيقة. نشرت أصلا في اشارة 14 الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو.
التعبير عن علامات في البالعات العملاق
تم التحقق من أصل العدلات من Gφ من التعبير الإيجابي من علامات العدلة التالية CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (الشكل 6). وأعرب Gφ أيضا أوكسيديز NADPH، ومستقبلات زبال oxLDL - CD68 و CD36، والواردة فجوات المغلفة LC3B والركام (التي تم تحديدها من قبل الغرب النشاف كما LC3BII 15)، مما يدل على وجود علامة الالتهام الذاتي. إلا أنها كانت سلبية للنسب الوحيدات (CD14، CD16 وCD163) وdendritخلايا جيم (CD1c وCD141) علامات، مما يوحي بأن Gφ لم تنشأ من وحيدات تلوث.
الشكل 6: التعبير عن علامات مختلفة لالعدلات، وحيدات والخلايا الجذعية في العملاق البالعات (Gφ) بعد 7 أيام في الثقافة. التعبير الإيجابي للالعدلات محددة الحبيبية علامة CD66b، ولازوردية حبيبات علامات CD63 والخطة الرئيسية للعمليات، الإيلاستاز العدلة وCD15. التعبير السلبي للشجيري CD1c وCD141 علامات وعلامات نسب الوحيدات CD14، CD16 وCD163. بالإضافة إلى ذلك، أعرب Gφ والالتهام الذاتي علامة LC3B، ومستقبلات زبال CD68 و CD36 ومفارز NADPH أوكسيديز مفارز gp91-phox / P22-phox. كانت ملطخة النوى مع دابي، وتم تحليل العينات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. تم تعديل هذا الرقم من المراجع. 14 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وظائف Gφ - NADPH أوكسيديز التنشيط، ROS إنتاج والبلعمة:
وكانت البلعمة من الخرز اللاتكس وزيموزان opsonized اضحة في Gφ. وحققت Gφ القاعدية ROS (الشكل 7A)، وأجاب على زيموزان والتحفيز سلطة النقد الفلسطينية من قبل الأكسدة انفجار (الشكل 7B-D). ولكن، خلافا حيدات أو العدلات، ولدت Gφ ROS أيضا ردا على التحفيز oxLDL وكانت ملطخة بالزيت الأحمر O (الشكل 7B، F). من المذكرة، والعلاج من العدلات جديدة مع المانع NADPH أوكسيديز - إدارة شؤون الإعلام، مستعمل ليس فقط إنتاج ROS، ولكن أيضا صتشكيل Gφ revented في الثقافة، مما يوحي بأن ROS إشارات ضرورية لتشكيل Gφ. 14، 15
الرقم 7: انفجار التأكسدي، البلعمة، وoxLDL امتصاص من قبل البالعات العملاق (Gφ). إنتاج (A) بصل ROS هو واضح في الجسيمات الحالة من Gφ. (ب) إنتاج ROS ردا على LDL المؤكسد (oxLDL)، (ويلاحظ الجسيمات زيموزان بوضوح) سلطة النقد الفلسطينية وزيموزان. (C) تترازوليوم نتروبلو (NBT) اختبار في Gφ تبين النشاط انفجر الجهاز التنفسي دون ومع سلطة النقد الفلسطينية (الشرائح غير ملوثين، ولكن هي ملطخة يدرج مع مايو جرونوالد بالغيمزا). (د) اختبار NBT ومايو GRÜNEWALD بالغيمزا ملطخة Gφ مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية / DPI التي تحول دون أوكسيديز NADPH وROS. (E) البلعمة من LATEX وزيموزان opsonized مفتش في PKH-26 (الأحمر) الخلايا الملون. (F) زيت الأحمر يا تلطيخ في oxLDL غير المعالجة أو المعالجة Gφ. تم تعديل هذا الرقم من المراجع. 14، 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تناسخ PMN عبر الخلايا البطانية
من أجل تحديد العدلات المحتملة السكان الفرعي التي قد تتطور الى Gφ، تم تحديد هجرة العدلات من خلال الطبقات الوحيدة الخلية البطانية (الشكل 8A). بعد 90 دقيقة، 62.3 ± 12.2٪ من العدلات transmigrated من خلال الخلايا البطانية نحو IL-8 في المقصورة أقل. وتجدر الإشارة، كانت Gφ إيجابية لCD66b / CD15 / LC3B وضعت فقط من السكان transmigrated العدلات في حين أن الخلايا التي وضعت من غير المهاجرة-العدلات جزء أصغر في الحجم والسلبية للعلامات العدلة CD66b / CD15 (الشكل 8B، 8C) .
الرقم 8: آثار IL-8 التي تعتمد PMN التهجير من خلال الخلايا البطانية على العملاق بلعمية (Gφ) تشكيل. (أ) مخطط يوضح العدلات التهجير فحص عبر الطبقات الوحيدة الخلية البطانية (ECS) نحو IL-8. ويمكن اعتبار هذا الاختبار كنموذج للالعدلات التوظيف إلى مواقع الالتهابية الحادة. (B - C) في مقايسة الهجرة الخلية (المحددة في البروتوكول 3)، transmigrating (ب) وغير المهاجرة (C) العدلات فارككان المثقف ستعقد لمدة سبعة أيام دون عوامل النمو (كما هو الحال في البروتوكول 1). ثم، كانت تغزل الخلايا على الشرائح الزجاجية وتحليلها بواسطة المجهر متحد البؤر. كانت ملطخة خلايا ثابتة لCD66b (الحمراء)، LC3B (الخضراء) وCD15 (الحمراء). كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
البالعات العملاقة (Gφ) هي جزء من السكان المعرفة حديثا من الخلايا المشتقة العدلات معربا عن علامات أساسية ومحددة عدلة مثل CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. لم يكن وصف هذا النوع من بلعمية المستمدة من العدلات في الأدب من قبل. على عكس العدلات التي هي قصيرة الأجل والخضوع لموت الخلايا المبرمج، Gφ هي Annexin-V-السلبي وعرض عمر الموسعة. ومع ذلك، ومثل العدلات، Gφ أيضا استيعاب جزيئات وإنتاج ROS NADPH أوكسيديز التي تعتمد استجابة لهذه الجزيئات وسلطة النقد الفلسطينية. ومع ذلك، قدراتهم على استيعاب OxLDL وبالتالي إلى إنتاج ROS هي ميزات فريدة من Gφ. 14
وقد أظهر عدد من العوامل التي تؤثر على تنميتها في الثقافة. عدم وجود السيتوكينات خارجية أو عوامل النمو في متوسط النمو ضروري (على وجه التحديد GM-CSF / IL-4). ومع ذلك، أثبتت العدلات الهجرة نحو IL-8 عامل تميز بين تلك التي ديفهربت إلى Gφ وتلك التي لم تفعل ذلك. أيضا، واستيعاب من الحطام الناجم عن العدلات أفكارك، والتعبير عن البروتينات الالتهام الذاتي (LC3B) وظيفية أوكسيديز NADPH، وعرضت كل أمرا حتميا لتنميتها، منذ تثبيط على منع تشكيل Gφ (الشكل 1). على ما يبدو، وتطوير هذه الخلايا العملاقة الناشئة من العدلات تختلف عن تلك التي تميز تشكيل خلية عملاقة في الوحيدات / النسب بلعم. شكل متعددة الأنوية خلايا عملاقة الأخيرة المرتبطة بالأمراض المختلفة المزمنة التهابات و 20 و 21 في حين أن Gφ العدلات وصفها هنا تطوير عبر autophagocytosis، التي تجتاح بقايا الخلايا وتبقى في الغالب أحادي الأنوية في جميع أنحاء تنميتها، 14 (نادرا ومع ذلك، في بعض الأحيان ثانية نواة يمكن ملاحظة). وعلاوة على ذلك، أنشأ عدد من الضوابط أصلهم العدلات: (1) expression من علامات neutropilic محددة وغياب شجيري ونسب الوحيدات علامات، (2) تعوق التنمية في حيدات / PMN المشترك الثقافات، (3) أنماط المختلفة من الحركة في الثقافة من الضامة (كما يتضح من تصوير الخلايا الحية والوقت المجهر -lapse)، 14 (4) الالتزام الضوء على الأطباق البلاستيكية و (5) تنميتها من CD15 النقي + / CD14 - PMN التي حصل عليها التدفق الخلوي.
بعض المهام المحددة في المختبر قد تعطينا أدلة إلى الوظائف المحتملة في الجسم الحي. على سبيل المثال، قدرات Gφ تستهلك كميات كبيرة من حبيبات العدلات والحطام، وجود فجوات كبيرة، وLC3B التعبير - وهو البروتين الالتهام الذاتي الذي يساهم في تقليل الالتهاب من خلال التفاعلات التنظيمية مع الفطرية مسارات الإشارات المناعة، 22 - جميعها قدرات الدعم الكسح. كما، تشير هذه النتائج أيضا أن Gφ يمكن أن تعمل في مواقع التهابات حيث نظام Mφ / DC غير كاف أو طغت، وبالتالي تسهم في حل الالتهابات. قد تكون معتمدة هذه الفكرة من خلال حقيقة أن يعيش فيه خليط الثقافات الوحيدات / العدلة ويعوق تنمية Gφ. 14 أيضا، بالنظر إلى أن Gφ التعبير عن مستقبلات oxLDL زبال (CD36، CD68)، استيعاب oxLDL، وإنتاج روس ردا على ذلك، قد يشير إلى أنهم يشاركون في عمليات تصلب الشرايين لحل التهاب. منذ Gφ وضعت فقط من العدلات التي هاجرت نحو IL-8، وهجرة العدلات "عبر الطبقات الوحيدة البطانية نحو IL-8 يمثل تجنيد العدلات إلى مواقع الالتهابية الحادة، هذه النتيجة أيضا يمكن أن تدعم وظائف المضادة للالتهابات. على العكس من ذلك، فإن أداء Gφ في بعض حالات الالتهابات قد تمكينهم من أداء المكونات الحبيبية وROS، وبالتالي المساهمة في فيالتهاب sistent وتلف الأنسجة. 20 ومع ذلك، عموما، تشير قدراتهم ذاتية البلعمة أن Gφ ويشارك على الأرجح في تناقص الاستجابة الالتهابية بدلا من إدامة ذلك.
ومن المثير للاهتمام حددنا مؤخرا وجود Gφ في لويحات تصلب الشرايين الإنسان. (قيد التحضير). ومع ذلك لا يزال هناك عدد كبير من الأسئلة التي يتعين انحلت. على سبيل المثال، هي Gφ المؤيدة أو المضادة للالتهابات؟ ما هي العوامل التي تحدد تشكيل وظيفة في المختبر أو في الجسم الحي؟ الذي محددة العدلات حيوانية هو خلية سلائفها التي تسهل تنميتها في Gφ؟ هم المرتبطة ببعض الأمراض والتي؟ بشكل جماعي، يطرح أسئلة مثيرة للاهتمام على أساس الأصل والوظائف المحتملة.
يجب أن تبقى الخطوات والعثرات ولكن حاسمة في البروتوكول في الاعتبار. خطوة حاسمة في تطوير Gφ طالصورة زراعة العدلات نقية في تخلو المتوسط السيتوكينات وعوامل النمو أو المضادات الحيوية. خطوة حاسمة أخرى هي يستبعد أن Gφ تطوير من حيدات تلويث والتأكد من أصل العدلات من Gφ. وهكذا، بعد فصل الدم عن طريق التدرج متقطع، تعرضوا العدلات أبعد إلى خطوة إضافية لتنقية التدفق الخلوي باستخدام النابضة محببة وCD15 + / CD14 - علامات. وGφ المتقدمة التي تم الحصول عليها من العدلات التي تم تنقيتها من جراء التدفق الخلوي الانفصال لم تختلف عن تلك التي لم تتعرض لهذه الخطوة من تنقية. لذلك، أجريت معظم التجارب دون التدفق الخلوي خطوة لتنقية بسبب فقدان الخلايا إضافية. وتجدر الإشارة، في بعض الحالات النادرة لوحظت بعض الحمضات في الثقافة. بقي حجمها دون تغيير طوال الفترة الثقافة. يجب أن نلاحظ أيضا أنه على الرغم من أن هناك عددا من الطرقلفصل العدلات من الدم البشري، والطريقة الموصوفة هنا هو الأسلوب الوحيد الذي يعمل، وبالتالي فإننا لا يمكن مقارنة التطور Gφ عن طريق وسائل أخرى متاحة للانفصال العدلة.
والمعضلة الأساسية في التحقيق Gφ النتائج من عدم القدرة على الحصول على عدد كاف من السكان Gφ النقي مناسبة لمختلف فحوصات البيوكيميائية. فمن المستحيل أساسا في الظروف أجريت تجاربنا. أولا، العائد من Gφ منخفض. من 1.0 × 10 6 المصنف PMN حول 100-200 Gφ تطوير بعد سبعة أيام في الثقافة، وهذا يتوقف على التبرع بالدم. ثانيا، فمن الصعب أساسا في الوقت الراهن لفصل Gφ نموا في الثقافة من تحت الانقاض العدلات المتبقية في طبق. جعلت هذه القيود من المستحيل عمليا لتحليل الخلايا عن طريق أساليب البيولوجيا الحيوية أو الجزيئية. ولذلك، يركز هذا البروتوكول في واصفا تحديد Gφ وظيفة باستخدام الضوءوالفحص المجهري متحد البؤر. وأعقب على التحول الصرفي من العدلات إلى Gφ في الثقافة أيضا تصوير الخلايا الحية والفاصل الزمني المجهر. 14 ما يبدو، قد تكون هناك حاجة إلى كميات الدم أكبر من ذلك بكثير من أجل تنفيذ طرق البيولوجيا الحيوية أو الجزيئية والتغلب على العائد المنخفض التي تم الحصول عليها والتي تفصل بين Gφ قابلة للحياة من تحت الانقاض العدلات "في الطبق.
باختصار، لقد وصفنا مؤخرا لأول مرة تطوير Gφ في الثقافة، وجزء من السكان من الخلايا البالعة طويلة الأجل من أصل العدلات. لذلك، هذا هو الأسلوب الوحيد المتاح حاليا للحصول على Gφ في الثقافة، على الرغم من أن اثنين من القيود الرئيسية المذكورة أعلاه يجب التغلب عليها (العائد المنخفض للGφ الحصول في الثقافة وعدم القدرة على فصل Gφ المتقدمة من تحت الانقاض العدلات في الثقافة طبق). لا يزال، وإعداد وتحديد الهوية، وقدمت في هذا البروتوكول، هو ESSENTIAل للعلماء المهتمين في الاستجابات الالتهابية والبيولوجيا العدلة واللدونة، من أجل مواصلة التحقيق في أهمية والوظائف المحتملة للGφ.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب أشكر الدكتور إديث سوس-توبي لها مساعدة لا تقدر بثمن مع دراسات المجهر مبائر. وأيد هذه الدراسة من قبل وزارة الاستيعاب ولجنة التخطيط والميزانية في مجلس التعليم العالي في إطار برنامج KAMEA (LD وا ف ب). نحن أيضا الامتنان الدعم للزميل باحث من السيدة ديفيس مؤسسة ما بعد الدكتوراه زمالة أبحاث (أو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile scalp vein set (21GX3/4) | Bio Diagnostics Ltd. | # 20080312 | A strile needle for venipancture |
| VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP | Greiner Bio-One | # 450263 | For securing during venipuncture |
| VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL) | Greiner Bio-One | # 455036 | Sterile tube for blood collection |
| Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml) | Thermo Scientific | # 142475 | |
| Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) | Greiner Bio-One | # E14103PJ | |
| Transwell-24 well (transmigration assay) | Corning | # CA-3415 | Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) |
| RPMI-1640 medium | BioIndustries | # 01-100-1A | Do not add antibiotics |
| EA.hy926 (ATCC CRL2922) | BioIndustries | # CRL-2922 | |
| ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | BioIndustries | # 302002 | complete growth medium |
| Polysucrose - Histopaque1119 | Sigma-Aldrich | # 1119-1 | Tissue culture grade |
| Polysucrose - Histopaque1077 | Sigma-Aldrich | # 1077-1 | Tissue culture grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) - ion free | BioIndustries | # 02-023-1A | Cell biology and molecular biology grade |
| Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) | BioIndustries | # 04-121-1B | Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS |
| NaCl | Sigma | # S3014 | Molecular biology grade, suitable for cell culture |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | # 15710 | Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | # 9002-93-1 | Molecular biology grade |
| Normal Goat Serum | BioIndustries | # 04-009-1 | Cell biology and molecular biology grade |
| Trypan blue | BioIndustries | # 031021B | Tissue culture grade |
| May-Grünwald | Sigma-Aldrich | # MG500 | Cell biology grade-(procedure No GS-10) |
| Giemsa stain Kit | Sigma | # 48900 | Cell biololgy grade-(procedure No GS-10) |
| Fibronectin | BioIndustries | # 03090105 | |
| Human Interleukin-8 (CXCL8) | PeproTech | # 200-08-5 | |
| Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-58951 | Mouse IgG2b; expressed by monocytes |
| Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-5275 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
| Anti-CD66b (clone 80H3) | AbD Serotec | # MCA216 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
| Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-090-695 | Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells |
| Anti-CD15 (clone MY-1) | Abcam | # ab754 | Mouse IgM; expressed by neutrophils |
| Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) | BioLegend | # 650001 | Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex |
| Anti-CD68 | Protein Tech | # 16192-1-AP | Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor |
| Anti-LC3B | Sigma | # L7543 | Rabbit IgG |
| Anti-Myeloperoxidase | Abcam | # ab45977 | Rabbit IgG |
| Anti-Neutrophil elastase | Calbiochem | # 481001 | Rabbit IgG |
| Anti-NOX2 (gp91-phox) | Abcam | # ab131083 | Rabbit IgG |
| Anti-CD36 (SR-B3) | Novus Biologicals | # NB400-144 | Rabbit IgG |
| Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) | BioLegend | # 401401 | Antibody used as isotype control |
| Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) | BioLegend | # 400263 | Antibody used as isotype control |
| Normal rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-2027 | Antibody used as isotype control |
| CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20012 | Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A |
| CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20043 | Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647 |
| CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20010 | Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A |
| CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20040 | Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647 |
| Fluorescent Mounting Medium with DAPI | Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. | # E19-18 | Nuclear staining |
| Confocal laser scanning microscope (LSM 700) | Carl Zeiss | Ser.# 3523000380 | Plan Apo 40X immersion oil objective |
| Zeiss CLSM software (ZEN 2010) | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 6.0 | For colocalization analysis |
| ImageJ software | Wayne Rasband, NIH, USA | version 1.49k | For determination of cell areas and fluorescence intensity |
| Light microscope (Axiovert 25) | Carl Zeiss | Ser.# 201060153 | Examination of cells in culture |
| Centrifuge (Megafuge 1.0 R) | Heraeus Instruments | # D-37520 | Cells separation from blood; cytospins preparation |
| Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) | Carl Zeiss | Ser.# 3834001470 | Demonstration of giant phagocytes development |
| Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) | Life Imaging Services | Temperature control system for microscopes | |
| High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) | Carl Zeiss | Ser.# 117090279 | For capturing high-contrast image data from an examined cell objects |
| Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen) | Diagnostic Biosystems | # K039 | For defining cell perimeter for immunoflourescence staining |
References
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Silva, M. T., Correia-Neves, M. Neutrophils and macrophages: the main partners of phagocyte cell systems. Front. Immunol. 3, 174 (2012).
- Cowburn, A. S., Condliffe, A. M., Farahi, N., Summers, C., Chilvers, E. R. Advances in neutrophil biology: clinical implications. Chest. 134, 606-612 (2008).
- Duffin, R., Leitch, A. E., Fox, S., Haslett, C., Rossi, A. G. Targeting granulocyte apoptosis: mechanisms, models, and therapies. Immunol. Rev. 236, 28-40 (2010).
- Silva, M. T. Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: a cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation. J. Leukoc. Biol. 89, 675-683 (2011).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Cassatella, M. A., Locati, M., Mantovani, A. Never underestimate the power of a neutrophil. Immunity. 31, 698-700 (2009).
- Zhang, X., Majlessi, L., Deriaud, E., Leclerc, C., Lo-Man, R. Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils. Immunity. 31, 761-771 (2009).
- Araki, H., et al. Reprogramming of human postmitotic neutrophils into macrophages by growth factors. Blood. 103, 2973-2980 (2004).
- Iking-Konert, C., et al. Up-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease. Clin. Exp. Immunol. 130, 501-508 (2002).
- Rydell-Tormanen, K., Uller, L., Erjefalt, J. S. Neutrophil cannibalism--a back up when the macrophage clearance system is insufficient. Resp. Res. 7, 143 (2006).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J. Leukoc. Biol. 90, 271-284 (2011).
- Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, L. The development of giant phagocytes in long-term neutrophil cultures. J. Leukoc. Biol. 96, 511-521 (2014).
- Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, P., Lavie, L. Intermittent Hypoxia Affects the Spontaneous Differentiation In Vitro of Human Neutrophils into Long-Lived Giant Phatocytes. Oxid. Med. Cell. Longev. , 9636937 (2016).
- Mihalache, C. C., et al. Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events. J. Immunol. 186, 6532-6542 (2011).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of Colocalization of Objects in Dual-Color Confocal Images. J. Microsc. 169, 375-382 (1993).
- Matsushima, H., et al. Neutrophil differentiation into a unique hybrid population exhibiting dual phenotype and functionality of neutrophils and dendritic cells. Blood. 121, 1677-1689 (2013).
- Oehler, L., et al. Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics. J. Exp. Med. 187, 1019-1028 (1998).
- Berton, G. Editorial: Gigantism: a new way to prolong neutrophil life. J. Leukoc. Biol. 96, 505-506 (2014).
- Milde, R., et al. Multinucleated Giant Cells Are Specialized for Complement-Mediated Phagocytosis and Large Target Destruction. Cell. Rep. 13, 1937-1948 (2015).
- Deretic, V., Saitoh, T., Akira, S. Autophagy in infection, inflammation and immunity. Nat. Rev. Immunol. 13, 722-737 (2013).
