Summary
A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.
Abstract
I (pMHC-I) tetrámeros de histocompatibilidad de clase péptido-principal han sido una herramienta muy valiosa para estudiar las respuestas de células T CD8 +. Debido a que estos reactivos se unen directamente a receptores de células T en la superficie de las células CD8 + T-linfocitos, tetrámeros pMHC-I marcados con fluorocromos permiten la detección precisa de antígeno (Ag) + específicos de células T CD8 sin la necesidad de re in vitro -estímulo. Por otra parte, cuando se combina con multi-color de citometría de flujo, pMHC-I tinción tetrámero puede revelar aspectos clave de las células T CD8 + Ag-específicas, incluyendo etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación. Estos tipos de análisis han sido especialmente útiles en el campo de la inmunología del VIH en las células T CD8 + pueden afectar la progresión a SIDA. La infección experimental de macacos rhesus con virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) proporciona una valiosa herramienta para estudiar la inmunidad celular contra el virus del SIDA. Como resultado, progre considerabless se ha hecho en la definición y la caracterización de las respuestas de células T en este modelo animal. Aquí presentamos un protocolo optimizado para el recuento de células T SIV-CD8 + específicas en macacos rhesus por pMHC-I tinción tetrámero. Nuestro ensayo permite la cuantificación y la memoria simultánea fenotipificación de dos poblaciones de células T pMHC-I tetrámero + CD8 + por prueba, que podrían ser útiles para el seguimiento de las respuestas de SIV específicos de células T CD8 + generadas por vacunación o infección SIV. Teniendo en cuenta la relevancia de primates no humanos en la investigación biomédica, esta metodología es aplicable para el estudio de las respuestas de células T CD8 + en múltiples contextos de enfermedades.
Introduction
Las células T CD8 + comprenden un componente crucial del sistema inmune adaptativo ya que participan en la vigilancia inmune del tumor y contribuyen a la erradicación de patógenos intracelulares 1. En términos simples, las células T CD8 + expresan receptores de células T (TCR) que reconocen específicamente de histocompatibilidad de clase complejo de péptido-major I (pMHC-I) moléculas presentes en la membrana plasmática de las células huésped. Dado que estos péptidos se derivan de la proteólisis de las proteínas sintetizadas endógenamente, pMHC-I de la superficie celular complejos proporcionan una ventana en el medio ambiente intracelular. Tras la infección por el virus, por ejemplo, las células infectadas se mostrarán moléculas MHC-I que contienen péptidos derivados de virus que pueden servir como ligandos para los TCR expresadas por patrullando las células T CD8 +. En el caso de un CD8 + de células T específica del virus se encuentra con una célula infectada presentar su ligando pMHC-I, compromiso TCR resultará en la activación de células T CD8 + y ultiinstancia conducir a la lisis de las células diana. Dada la naturaleza crítica de estas interacciones TCR / pMHC-I, la determinación de la magnitud, la especificidad y el fenotipo de la respuesta de células T CD8 + a menudo puede revelar pistas importantes sobre las enfermedades humanas.
Hasta principios de 1990, la cuantificación de las células T CD8 + específicas de Ag-basó en el ensayo técnicamente exigentes dilución limitante (LDA) 2,3. No sólo se le requiere la LDA varios días para completarse, también se pudo detectar células que carecían de potencial proliferativo. Como resultado, la LDA enormemente subestimó la frecuencia real de las células T antígeno (Ag) específicos de CD8 + que participan en una respuesta inmune. Aunque el desarrollo de ELISPOT y ensayos de tinción intracelular de citoquinas mejora en gran medida la capacidad de medir la inmunidad celular, estos métodos aún requieren la estimulación in vitro para la cuantificación de células T específicas de Ag-4. No fue hasta 1996 que Altman, Davis, y coleagues publicaron su artículo de referencia informar el desarrollo de la tecnología de tetrámeros pMHC-I 5. Crítica para el éxito de esta técnica fue la multimerización de las moléculas pMHC-I, que se extendían la vida media de las interacciones TCR / pMHC-I, lo que reduce la probabilidad de tetrámeros pMHC-I que caen fuera durante las etapas de lavado de ensayos de citometría de flujo. La principal ventaja de tetrámeros pMHC-I en los ensayos mencionados anteriormente es la capacidad para detectar con precisión las células T Ag-CD8 + específicas directamente ex vivo sin la necesidad de re-estimulación in vitro en. Por otra parte, la combinación de pMHC-I tinción tetrámero con multi-color de citometría de flujo ha permitido un análisis detallado de la etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación de + células T CD8 específicas de Ag-2-4. A la luz de los recientes avances técnicos para la caracterización de los repertorios de células T CD8 + por pMHC-I tinción multímero 6, la amplitud de las aplicaciones for esta metodología es probable que continúe en expansión.
Pocas áreas de la investigación biomédica han beneficiado más de pMHC-I tinción tetrámero que el campo de la inmunología del VIH 7. A pesar de que las células T CD8 + se habían asociado temporalmente con el control inicial de la viremia del VIH en el momento de la publicación por Altman, Davis y sus colegas 8,9, el uso de tetrámeros pMHC-I en los años siguientes se expandió significativamente nuestra comprensión de el VIH-específica respuesta de células T CD8 +. Por ejemplo, pMHC-I tinción tetrámero ayudó a confirmar el tamaño robusta de las respuestas de células T específicas del virus CD8 + en la mayoría de las personas infectadas por el VIH 10-12. Esta metodología también facilitó la caracterización del VIH y las respuestas de células T CD8 + específicas SIV-restringidos por moléculas MHC-I asociados con el control de la replicación viral espontánea en ausencia de terapia antirretroviral, un fenómeno conocido como "control de la élite"
La infección experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) sigue siendo el mejor modelo animal para la evaluación de las intervenciones inmunológicas contra el VIH / SIDA 18,19. En los últimos 25 años, se ha hecho un progreso sustancial en la identificación y caracterización de las células T SIV-CD8 + específicas en esta especie de monos, incluyendo el descubrimiento de alelos MHC-I y la definición de la unión de péptidos motivos 13,20-27 . Como resultado, tetrámeros pMHC-I se han desarrollado para el análisis de específica SIV + de células T CD8respuestas en este modelo animal 28. La mayoría de estos reactivos se hacen de los productos génicos de cuatro macacos rhesus alelos MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, y Mamu-B * 017: 01. Es de destacar que los macacos rhesus no expresan un locus MHC-C 29. La gran mayoría de los tetrámeros pMHC-I utilizados en los presentes experimentos se produjeron en el Centro de NIH tetrámero Núcleo de la Universidad Emory. Sin embargo, algunos de estos reactivos, incluyendo Mamu-A1 * 001 tetrámeros con destino a la inmuno epítopo Gag CM9, sólo puede obtenerse de fuentes comerciales, debido a los acuerdos de licencia. Utilizando tetrámeros pMHC-I de los cuatro alelos macacos rhesus enumerados anteriormente, hemos registrado con éxito las células T CD8 + contra un total de 21 epítopos SIV (Tabla 1), que fueron inducidos por la vacunación o infección primaria SIV 30,31 (Martins et al., observaciones no publicadas).
El presente manuscrito proporciona unaprotocolo de tinción de tetrámero optimizado pMHC-I para la determinación del fenotipo de frecuencia y la memoria de las células T CD8 + específicas de SIV en macacos rhesus. El ensayo comienza con una electiva 30 min de incubación con un inhibidor de la proteína quinasa (PKI; aquí, se utiliza dasatinib) con el fin de disminuir TCR internalización y con ello mejorar pMHC-I tetrámero tinción 32. Como se describe a continuación, este tratamiento es especialmente útil cuando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. También se proporcionan instrucciones sobre cómo marcar las células con tetrámeros pMHC-I conjugados con fluorocromo y anticuerpos monoclonales (MAB). Este protocolo también incluye una etapa de permeabilización celular para la detección intracelular de la citolisis asociada molécula de granzima B (Gzm B). El mAb contra CD3 se añade en este paso también para mejorar la detección de esta molécula de señalización del TCR. Como referencia, se enumeran todos los fluorocromos utilizados en este panel de tinción.
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Protocol
Las muestras de sangre periférica de células mononucleares (PBMC) utilizados en este manuscrito se obtuvieron de los macacos rhesus de la India con sede en el Centro de Investigación Nacional de Primates de Wisconsin. Estos animales se cuidaron de acuerdo con el Informe Weatherall bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Wisconsin Escuela de Cuidado de Animales y el empleo Comisión 33. Todos los animales procedimientos se realizaron bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento potencial.
1. Tratamiento PKI
NOTA: Esto es opcional, pero se recomienda para Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. Ver Resultados y Discusión.
- Resuspender PBMC en medio R10 a una concentración de 1,6 x 10 7 células / ml.
- Añadir 50 l de esta suspensión de células al flujo correspondiente citometría de tubos. Añadir 50 l de una solución 100 nM de PKI a cada tubo.
- Vórtice cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 30 min. Al final de estepaso, cada tubo debe tener 100 l de una suspensión de células que contiene 8,0 x 10 5 PBMC y 50 nM de PKI.
- Proceder a la etapa de tinción tetrámero pMHC-I.
2. Tinción con marcadas con fluorocromo tetrámeros pMHC-I
- Antes de preparar el pMHC-I tetrámero mezcla maestra, centrifugar los tubos tetrámero pMHC-I a 20.000 xg durante al menos 15 min a 4 ° C. El objetivo de este paso es para sedimentar los agregados de proteína en la solución de tetrámero pMHC-I que puede aumentar la tinción de fondo. Una vez que la etapa de centrifugación se realiza, evitar de pipeteado de la parte inferior del tubo donde se han acumulado los agregados de proteína.
- Preparar suficiente mezcla maestra tetrámero pMHC-I para teñir todos los tubos experimentales. Preparar un exceso de 15% del volumen total de esta mezcla maestra a la cuenta de error de pipeteo.
- Diluir tetrámeros pMHC-I en tampón de tinción (por ejemplo, la mancha brillante Buffer), de modo que 25 l de la I-pMHC tetrámero mezcla maestra son Added para cada prueba.
- Etiqueta de PBMC con dos tetrámeros pMHC-I por prueba; uno conjugado con aloficocianina (APC) y la otra a violeta brillante (BV) 421.
- Añadir 8,0 x 10 5 PBMC al flujo correspondiente citometría de tubos en un volumen final de 100 l. Si las células se sometieron al tratamiento PKI descrito anteriormente, que ya deben ser resuspendieron en 100 l en este paso.
- Añadir 25 l de pMHC-I tetrámero maestro de la mezcla con el flujo correspondiente citometría de tubos. Al final de este paso, el volumen final en cada tubo debe ser de 125 l.
- Vortex cada tubo con el fin de homogeneizar la suspensión celular.
- Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 min. Preparar el cóctel de mAb tinción de la superficie durante este 45 min de incubación.
La tinción 3. Superficie
- Preparar suficiente mezcla maestra mAb para teñir todos los tubos experimentales. Preparar un exceso de 15% del volumen total de esta mezcla maestra para tener en cuentapara el error de pipeteo.
- Ajustar el volumen de la mezcla maestra con tampón de tinción para que 50 l se añaden por prueba.
- Para la exclusión adecuada de las células T no CD8 + y delineación de subconjuntos de memoria, el uso de cantidades de mAbs dirigidos contra los siguientes moléculas en la mezcla maestra tinción de la superficie valora.
NOTA: Los fluorocromos conjugados con cada mAb se proporcionan como referencia: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7, y CCR7 FITC. Tenga en cuenta que los mAb contra CD14, CD16, y CD20 se conjugan con el mismo fluorocromo (es decir, BV 510), ya que se incluirán en la puerta "descarga". - Incluir un colorante puede arreglar para discriminar las células muertas de la mezcla maestra tinción de la superficie [es decir, colorante reactivo amina (ARD)]. Asegúrese de que el reactivo de ARD está conjugado a un fluorocromo con un espectro de emisión similar a los utilizados en la puerta "descarga". En este caso, utilizar ARD Aqua.
- Añadir 50 l dela mezcla maestra de tinción se describe en 3.1 a 3.4 para el flujo correspondiente citometría de tubos. Al final de este paso, el volumen final en cada tubo debe ser de 175 l.
- Vórtice cada tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 25 min.
- Lavar las células con tampón de lavado (solución de PBS que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino y 0,45 g / L NaN 3).
PRECAUCIÓN: La azida de sodio es una sustancia tóxica. La exposición a incluso pequeñas cantidades puede causar síntomas. Manejar esta sustancia de acuerdo con las directrices especificadas por la Oficina de Salud Ambiental y Seguridad (EHS) en la institución donde se llevan a cabo estos experimentos. - tubos de centrifugación a 510 xg durante 5 min. decantar cuidadosamente el sobrenadante en un contenedor de residuos por separado. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
PRECAUCIÓN: No se decanta el tampón de lavado sobrenadante en depósitos que contienen lejía, ya que puede reaccionar con la azida de sodio presente en el tampón de lavado y dar lugar a la formación de un gas tóxico 34. doONTACTO la Oficina de EHS en la institución donde se llevan a cabo estos experimentos para las instrucciones sobre cómo deshacerse de azida de sodio. - Después de decantar, vórtice las células en el líquido sobrante retenida en cada tubo.
4. Fijación de la célula
- Añadir 250 l de una solución de 2% de paraformaldehído (PFA) a todos los tubos para fijar las células.
PRECAUCIÓN: PFA es una sustancia tóxica. La exposición a incluso pequeñas cantidades puede causar síntomas. Manejar esta sustancia de acuerdo con las directrices especificadas por la Oficina de EHS en la institución donde se llevan a cabo estos experimentos.- Dado que la solución PFA 2% debe ser isotónica a las células, usar PBS para preparar esta solución. Cien mililitros de una solución PFA 2% es suficiente para múltiples experimentos. A fondo el vórtex todos los tubos inmediatamente después de la adición de 2% PFA con el fin de evitar la formación de agregados de células.
- Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 20 minutos.
- Wcélulas de ceniza repitiendo los pasos 3.7-3.9. Una vez completado este paso, las células se pueden almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante 24 a 48 hr. Antes de pasar a la fase de permeabilización, vórtice bien los tubos.
5. permeabilización de células
- Añadir 500 l de tampón de permeabilización. Vortex todos los tubos.
- Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min.
- Lavar las células repitiendo los pasos 3.7-3.9.
6. La tinción intracelular
- Preparar suficiente mezcla maestra mAb para teñir todos los tubos experimentales.
- Ajuste el volumen con PBS o tampón de tinción de modo que se añaden 50 l de la mezcla maestra intracelular mAb por prueba.
- Preparar la mezcla maestra mAb se describe en 6.1 y 6.2 utilizando cantidades de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD3 y Gzm B. titularse
NOTA: TCR compromiso por tetrámeros pMHC-I puede dar lugar a la internalización de CD3, lo cual puede interferir con la detección de tetrámero + CD3 + CD8 +Las células T si se añade el anticuerpo anti-CD3 de la mezcla maestra tinción de la superficie. Para evitar esto, añadir el mAb anti-CD3 en esta etapa, que es, después se permeabilizan las células. Los fluorocromos conjugado a cada mAb se enumeran como referencia: CD3 PerCP Cy5.5 y Gzm B PE. - Añadir 50 l de mAb cóctel para los tubos correspondientes. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar las células repitiendo los pasos 3.7-3.9. Los tubos están listas para ser adquirida en un citómetro de flujo.
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Representative Results
El protocolo descrito aquí se ha utilizado para determinar la magnitud y la memoria fenotipo de, las respuestas de células T de la mordaza de CM9 específicos de CD8 + inducidos por la vacuna en un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para este análisis, se utilizó un tetrámero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 conjugado-APC en un panel de tinción de citometría de flujo 8-color. Figura 1A - F muestra la estrategia de compuerta se utiliza para analizar los datos, que deben aplicarse para ambos tetrámeros presentes en cada prueba. Tenga en cuenta que el tetrámero pMHC-I + población de células T CD8 + es bien separados con un mínimo de fondo (Figuras 1F y G). + De memoria CD8 células T en macacos rhesus se pueden clasificar como tres subconjuntos basados en la expresión superficial de CD28 y CCR7: memoria central (T CM; CD28 + CCR7 +), la memoria de transición (T EM1; CD28 + CCR7), y el efector memoria (T EM2; CD28-CCR7) 35.Este protocolo también incluye una etapa de permeabilización celular para la detección intracelular de Gzm B y CD3. Figura 1G - I muestra el trazado de subconjuntos de memoria y Gzm B-que expresan las células T CD8 + tetrámero + dentro de la puerta.
La tinción de fondo puede no dar resultados óptimos en ensayos de marcaje por tetrámero pMHC-I. Para evitar esto, se sugieren algunas precauciones. Como se indica en la sección de protocolo, los viales que contienen los reactivos de tetrámero pMHC-I siempre se deben centrifugar a 20.000 xg durante al menos 15 minutos antes de la preparación de las mezclas de reacción. El objetivo de este paso es para sedimentar cualquier agregados de proteínas que pueden estar en la solución tetrámero pMHC-I. Además, también se recomienda titulando cada reactivo antes de su uso. Idealmente, las células que hacen o dejan de contener a la población de células T CD8 + Ag-específica de interés debe ser etiquetado con el tetrámero relevante pMHC-I MHC-I-emparejados. esta can llevarse a cabo mediante la tinción criopreservados PBMC de SIV naïve (control negativo) e infectados con SIV lado (control positivo) macacos a lado con diversas cantidades de un tetrámero pMHC-I recién obtenido. En la Figura 2, por ejemplo, 1,0 l / prueba de un APC conjugado Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrámero dio la mejor separación entre las poblaciones de células T tetrámero positivo y negativo CD8 +. Por último, la elección de fluorocromo también puede afectar de manera significativa los resultados obtenidos de tinciones tetrámero pMHC-I. En este sentido, tetrámeros pMHC-I conjugan para atenuar las moléculas (por ejemplo, fluoresceína) debe ser evitado. En nuestra experiencia, tetrámeros pMHC-I conjugados con fluorocromos brillantes, tales como PE, APC, y la BV 421, han dado los mejores resultados.
Hemos notado que Mamu-B * 017: 01 tetrámeros generalmente producen dim tinción, incluso cuando se conjuga con los fluorocromos brillantes mencionados anteriormente. Las razones de estabaja intensidad de fluorescencia no son del todo clara, pero podría incluir baja afinidad TCR / Mamu-B * 017: 01 interacciones y rápida internalización de TCR sobre tetrámero de unión 36,37. A lo largo de estas líneas, las PKI se han demostrado inhibir la internalización de TCR en la superficie de + células T CD8 32. Como resultado, las PKI puede mejorar la detección de + CD8 células T Ag-específicas por pMHC-I tinción de tetrámero. Hemos confirmado este efecto en nuestros experimentos, donde la calidad de Mamu-B * 017: 01 tetrámero coloraciones pueden mejorarse sustancialmente mediante pre-tratamiento de PBMC con una PKI (Figura 3). Curiosamente, el tratamiento previo con este PKI no mejoró significativamente la tinción de otros tetrámeros pMHC-I prueba aquí (datos no mostrados), lo que sugiere que Mamu-B * 017: las células T CD8 + 01-restringidas pueden ser únicos en su sensibilidad al tratamiento PKI.
Figura 1: Ventana de medida la estrategia y los resultados representativos de un exitoso tinción tetrámero pMHC-I. Se evaluó la magnitud y la memoria fenotipo de las células T inducida por la vacuna de la mordaza de CM9 específicos de CD8 + en PBMC de un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Aquí, se utilizó un tetrámero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 conjugado-APC en un panel de tinción de citometría de flujo 8-color. (A - F) la estrategia de apertura de puerta para el análisis de citometría de flujo. En primer lugar, una puerta en interiores en diagonal agrupadas fue creado por el trazado hacia delante altura de dispersión (FSC-H) frente al área de FSC (FSC-A) y luego la altura de dispersión lateral (SSC-H) frente al área de SSC (SSC-A; A y B) . A continuación, una puerta del tiempo se ha creado que incluye sólo aquellos eventos que fueron registrados dentro de los 5 º y 90 º percentiles. Las células resultantes fueron entonces cerrada en "canal volcado" negativos, + células CD3 (C y D). En esta etapa, lapoblación de linfocitos se delineó en función de su FSC-A y las propiedades SSC-A y los análisis posteriores se llevaron a cabo dentro de CD8 + células (E y F). Después de describir pMHC-I tetrámero + células (g), el análisis de fenotipificación memoria se realizó dentro de esta puerta (H). Células T de memoria macaco rhesus se pueden clasificar en tres subgrupos basados en la expresión de CD28 y CCR7: memoria central (T CM; CD28 + CCR7 +), la memoria de transición (T EM1; CD28 + CCR7), y la memoria efector (T EM2 ; CD28-CCR7). El presente protocolo también incluye una etapa de permeabilización de células para la evaluación intracelular de granzima B (Gzm B) expresión dentro de tetrámero + células T CD8 + (I). El área sombreada en el histograma corresponde a tetrámero + células T CD8 + teñidas con un mAb de control de isotipo correspondiente. Aunque el tetrámero BV 421 conjugado + población que estaba presente en esta tinción esque no se muestra en la figura, la misma estrategia gating se debe utilizar para analizarlo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los resultados representativos de la titulación de una APC-conjugado Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrámero. CMSP de dos Mamu-B * 008: 01+ macacos rhesus se usaron para este experimento: un animal era SIV ingenuo y sirvió como control negativo, mientras que el otro era infectados con SIV y sirvieron como control positivo. Para determinar la cantidad de Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrámero que produce la mejor separación entre tetrámero + y células T CD8 + tetramer-, CMSP de cada animal se incubaron con las cantidades indicadas de reactivo de tetrámero pMHC-I. Basándose en estos resultados, 1,0 l / wa pruebas elegidos como la cantidad óptima para usarse en ensayos futuros. La estrategia gating utilizado para analizar los datos se describe en la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos del tratamiento PKI en la intensidad de fluorescencia de Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. El inhibidor de la PKI inhibe la internalización de los complejos de TCR y por lo tanto mejora la detección de Ag-específica + CD8 células T por marcado con fluorocromo pMHC-I tetrámeros 32. (A - B) CMSP de dos Mamu-B * 017: 01+ se utilizaron macacos rhesus en este experimento: un mono era SIV ingenuo y sirvió como control negativo (A), mientras que el otro estaba infectado con SIV y sirvieron comoel control positivo (B). PBMC de ambos animales se incubaron a 37 ° C en presencia de PKI a una concentración de 50 nM durante 30 minutos antes de la tinción con un APC conjugado Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetrámero, como se describe en la sección de Protocolo . Como referencia, otro conjunto de tubos se sometió a las mismas condiciones de incubación y de tinción, excepto que sulfóxido de dimetilo (DMSO) se añadió en lugar de PKI. La estrategia gating utilizado para analizar los datos se describe en la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| proteínas SIV | La posición de aminoácido | La secuencia de aminoácidos | Me molécula MHC de clase (nueva nomenclatura) | MHC de clase I molécula (nomenclatur de edadmi) | Nombre corto epítopo |
| Mordaza | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| Mordaza | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| Mordaza | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Vif WY8 |
| Rdo | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Hacer encaje | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | YY9 Nef |
Tabla 1: Lista de tetrámeros pMHC-I disponibles para el seguimiento de las respuestas SIV específicos de células T CD8 + en macacos rhesus.
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Discussion
A pocos pasos de este procedimiento de discusión mérito ya que son cruciales para la obtención de resultados óptimos. En primer lugar, ya que la calidad de las muestras biológicas es un fuerte predictor del éxito de cualquier ensayo de citometría de flujo 38, todo se debe tener cuidado para asegurar que las células son viables y en suspensión durante el procedimiento de tinción. Esto es particularmente relevante cuando se trabaja con muestras crioconservadas ya que son más propensos a la formación de grumos y típicamente contienen un mayor número de células muertas. En estos casos, pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras antes del procedimiento de etiquetado tetrámero pMHC-I podría mejorar sustancialmente los resultados. En segundo lugar, adecuada compensación de los fluorocromos utilizados en el ensayo es crítico para el análisis de datos precisa, especialmente cuando se están evaluando múltiples parámetros en el mismo experimento. A este respecto, se recomienda que los controles fresco de compensación de un solo color pueden preparar para cada pMHC-I tetrámero scontienen ensayo. Estamos a favor del uso de perlas de compensación debido a su amplia reactividad anti-Ig y el hecho de que con ellos se obtienen claras distribuciones bimodales de las poblaciones positivas y negativas. Dado que estas cuentas no se unen a moléculas de MHC-I, anticuerpos conjugados a los mismos fluoróforos como los tetrámeros pMHC-I (por ejemplo, APC y 421 BV) se debe utilizar como controles de compensación. Varias de esas bolas de compensación están disponibles de varios fabricantes y se debe utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En tercer lugar, ya que la estrategia fenotipificación se describe aquí requiere la delimitación de subconjuntos de células T CD8 + sobre la base de la expresión graduada de tres moléculas (es decir, CD28, CCR7, y Gzm B), controles de activación periódica, tales como la fluorescencia menos uno (FMO) Tests o anticuerpos de isotipo emparejado, deberían utilizarse para facilitar este tipo de análisis. En nuestros experimentos, por ejemplo, tubos separados que contienen el tetrámero pMHC-I + población de células T CD8 + de interés unare siempre teñidas con mAb de control de isotipo conjugados con fluorocromos los mismos como los anticuerpos monoclonales contra CD28, CCR7, y Gzm B. Es importante destacar que, a pesar de las directrices antes mencionadas podrían ayudar a mejorar la calidad general de pMHC-I tetrámero coloraciones, no son las únicas variables que puede afectar al rendimiento de este ensayo. Teniendo en cuenta la singularidad de cada laboratorio, todo el flujo de trabajo descrito aquí se debe realizar al menos una vez en muestras simuladas para permitir la práctica y los ajustes pertinentes.
Curiosamente, pMHC-I tetrámero de las células T CD8 + positivas se observan ocasionalmente en PBMC de ingenuo SIV macacos rhesus (no infectados y no vacunados). Estos casos no parecen ser el resultado de la tinción de fondo basada en la inspección visual de los datos. Más bien, podrían reflejar interacciones entre las moléculas pMHC-I y los receptores similares a inmunoglobulina asesinas (KIR) expresados en la superficie de macacos rhesus NK y CD8 + células T 39,40. De hecho, Mamu-A1 * 002: 01 tetrámeros plegadas con péptidos correspondientes a los epítopos Gag y Env GY9 RY8 se ha demostrado que se unen a Mamu-KIRDL05 39. A lo largo de estas líneas, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 y Mamu-A1 * 002: 01 / Env RY8 son más propensos a exhibir la tinción Ag-independiente tetrámero pMHC-I se ha descrito anteriormente. Teniendo en cuenta este fenómeno, es importante para el control de esta reactividad de línea de base en los experimentos que involucran mono evaluaciones longitudinales de las respuestas de células T CD8 + SIV específicos después de la infección o la vacunación. Para lograr esto, es aconsejable realizar pMHC-I tinción tetrámero en muestras obtenidas en el primer día de tratamiento. También podría ser pertinente para congelar PBMC en varias alícuotas de pequeño tamaño en estos momentos iniciales en las comparaciones de casos con muestras de referencia son necesarios en futuros experimentos.
Una limitación de pMHC-I tinción de tetrámeros es que sólo + CD8 células T de especificidad conocida y MHC-I restricción cun ser estudiados por este enfoque. Esto es particularmente relevante en macacos rhesus dada la compleja organización de sus loci MHC. De hecho, un único haplotipo macaco rhesus puede tener docenas de genes MHC-I, no todos los cuales codifican las moléculas que se expresan de forma estable en la superficie celular 29. Como resultado, puede ser difícil determinar el conjunto de moléculas funcionales MHC-I expresadas por un animal dado. Sin embargo, esta advertencia se puede superar mediante el diseño de experimentos que incluyen monos que son positivas para conocidos alelos MHC-I, tales como Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, y Mamu- B * 017: 01.
En conclusión, este manuscrito proporciona un protocolo de tinción de tetrámero pMHC-I optimizado para la determinación del fenotipo de frecuencia y la memoria de las células T SIV-CD8 + específicas en macacos rhesus. Desde pMHC-I tinción de tetrámeros es más sensible que IFN-γ ELISPOT y ensayos de ICS para la detección de CD8 Ag-específica+ Células T y no requiere estimulación in vitro de Ag, la metodología que aquí se presenta es especialmente útil para estudiar el impacto de las respuestas de células T CD8 + en el resultado de la infección por virus de la inmunodeficiencia. El conocimiento práctico adquirido en el dominio de esta técnica también podría ser útil para el enriquecimiento de las células T CD8 + Ag-específicas como parte de los estudios funcionales y para el seguimiento de respuestas CD8 + de células T en diversos contextos de enfermedades 6.
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Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a David Watkins para apoyar los experimentos que permitieron a la optimización de la metodología actual. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyado en parte por una subvención piloto proporcionada por el Centro de Miami para la Investigación del SIDA de los Institutos Nacionales de la Salud con el número P30AI073961 premio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
