Summary
Этот протокол описывает индукцию модели ишемии-реперфузии (ИК) на мышиной коже уха с помощью магнита зажима. С помощью прижизненной модели по индивидуальному заказу изображений, мы исследуем в естественных условиях воспалительной реакции после реперфузии. Обоснованием развития этой техники заключается в расширении понимания того, как лейкоциты реагируют на ИК кожи травмы.
Introduction
Ишемическое реперфузионное повреждение (МРИ) имеет место, когда существует переходная гипоксия вследствие обструкции кровотока (ишемия), а затем последующего повторного оксигенации тканей (реперфузии). В коже, ишемия-реперфузия (ИК), как полагают, является одним из факторов, способствующих этому патофизиологии пролежней, где длительным постельным предрасполагает долгосрочные пациентов больницы к травмам. У этих больных, как кожа и мышцы , лежащие в основе постоянно подвергаются веса давления , оказываемого по областям , костистых известность, в результате локализованных травм , которые, если их не лечить, могут стать некротических 1.
Ущерб, вовлеченные в IRI носят двоякий характер. Во время ишемии, закупорка кровеносных сосудов приводит к резкому падению доставки кислорода к тканям. Это приводит к уменьшению АТФ и рН, которое инактивирует АТФазы, вовлеченных в клеточный метаболизм. В свою очередь, клеточные уровни кальция шип, и подчеркнул, или поврежден гргезов подвергаются апоптозу или некрозу 2. Высвобождение внутриклеточного содержимого или повреждений , связанных молекулярных моделей (DAMP), как HMGB1, способствует воспалительной реакции 3. Второе оскорбление происходит во время реперфузии. Хотя уровни кислорода и рН восстанавливаются во время реперфузии, это приводит к образованию активных форм кислорода (ROS), что приводит к окислению внутриклеточных липидов, ДНК и белков. Следовательно, провоспалительных медиаторов активируются, который оттеняет вторичный воспалительный ответ , который включает в себя вербовку иммунных клеток в месте воспаления 2. В то время как каскад биохимических событий, приводящих к воспалительной реакции была хорошо описана, пространственное и временное регулирование деятельности иммунных клеток недостаточно хорошо изучены.
Здесь мы опишем надежный ИК модель на коже мыши уха с помощью простого магнита зажима. В сочетании с многофотонная прижизненной томографии (МР-ИВМ), мысоздана модель для изучения воспалительных реакций в естественных условиях , которые происходят после того, как реперфузия происходит. Обоснованием разработки и использования этого метода является то, чтобы попытаться понять, как оба интерстициальные и проникают клетки реагируют на ИК в режиме реального времени.
Существующие модели IR с использованием техники зажима на фланг кожи высоко инвазивными, так как они требуют хирургической имплантации стальных пластин в бок кожи, делая их менее чем идеально подходит для иммунологических исследований 4. Аналогичный метод неинвазивной зажимное описана в мышином фланговых кожи 5,6. Тем не менее, из - за включения прижизненной компонента формирования изображения в этом методе, мы вместо того, чтобы выбрать кожу уха в качестве целевого ИК - сайта, поскольку она обходит движения , вызванные дыханием , и обеспечивает стабильность во время формирования изображения 7,8. Кроме того, лейкоциты подмножества, которые перекрывают интерстициальную ткань идентичны между кожей уха и кожи фланг, хотяцифры и пропорции могут незначительно отличаться в 9. Таким образом, кожа уха представляет собой идеальный сайт изображения.
Кроме того, большинство данных , извлекаемых из этих моделей IRI ограничены до макроскопических оценок (сортировочных язв) и микроскопических анализов конечных точек воспалительных показателей 10. С помощью этой модели в реальном масштабе времени визуализации клеточного ответа нейтрофилов после реперфузии в коже флуоресцентным репортерным мыши включена. Ранее опубликованные модель визуализации прижизненной уха используется 8 с дополнительными изменениями (рис 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты по живых животных были проведены в соответствии со всеми соответствующими использования животных и руководств и инструкций по уходу.
1. Выбор флуоресцентных Reporter Мыши
- Используйте 6- до 12-недельного возраста LysM-EGFP 11 мышей (без предпочтения мужчин или женщин).
Примечание: Использование различных клеточных специфических мышей флуоресцентный репортер позволяет визуализировать различных иммунных клеток в естественных условиях. В этом штамме, циркулирующих нейтрофилов (GFP Hi клеток), циркулирующих моноцитов (GFP ЛО клетки) и дермальные макрофаги (GFP ЛО клетки) могут быть визуализированы. С используются параметры визуализации, будут обнаружены только яркие сигналы от GFP-положительных нейтрофилов.
Примечание: Список штаммов иммунных клеток специфические флуоресцентные репортер мыши, подходящих для данного типа изображений исследования кожи можно найти в работе 8.
Примечание: Настоятельно рекомендуется альбинос мышей использовать для работы с изображениями, а pigmenМыши Ted более склонны к фотостарения. Это происходит потому, что пигментированные кожи уха гораздо более чувствителен к индуцированной лазером зернистость (индикативного горелого ткани). В результате можно наблюдать набор нейтрофилов и накопление даже в стационарном режиме 8,12. - Держите мышей в определенных свободных от патогенов (SPF) условиях с 12-х светло-темного цикла.
2. Мышь Анестезия
- Обезболить мышь с внутрибрюшинную инъекции кетамина-ксилазином (8 мкл -1 г веса тела), состоящего из смеси 15 мг мл -1 кетамина и 1 мг мл -1 ксилазина растворены в стерильной воде.
- Место мыши на грелку, чтобы поддерживать температуру тела при 37 ° С в течение всей процедуры подготовки. Проверьте наличие достаточных анестезии, наблюдая отсутствие носком пинч рефлекса.
Примечание: После первого часа, последующие четверть дозы обезболивающего необходимо будет вводить подкожноd будет длиться в течение приблизительно 0,5 ч каждый. Подергивание усов или хвоста может также указать, что анестезия изнашивания и что требуется дозаправка. - Используйте офтальмологических смазку на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
3. Депиляция
- Аккуратно нанесите крем для удаления волос на верхние две трети уха спинной мыши с помощью ватно-наконечник аппликаторы.
- Подождите в течение 2 - 3 мин перед снятием сливок с использованием мокрых хлопка-наконечник аппликаторы в тщательной, но нежной манере.
Примечание: Не допускать попадания крема для удаления волос , чтобы остаться на ухе мыши слишком долго, так как это может вызвать воспаление 13,14.
4. Индукция ишемией и реперфузии
- Используйте позолоченное, N42-класса неодимовые магниты толщиной, диаметр 12 мм х 2 мм, и с рейтингом Гаусс около 3000, чтобы вызвать ишемию в коже мыши уха.
Примечание: В этом случае ямочками лицо магнитов DenoTES ее северный полюс. - Слот магниты на их индивидуальные пластиковые направляющие.
Примечание: Пластиковая направляющая служит для облегчения размещения и разделение магнитов высокопрочных. Из-за их сильной магнитной силы еще с низким сопротивлением к разрушению, не включать отдельные магниты в непосредственной близости друг к другу или к другим металлам. Растрескивание и раскалывание может произойти, если они тянут друг к другу. - Поместите первый (спинального) магнита таким образом, что только край находится в контакте со вторым (вентральной) магнита (рис 3а)
Примечание: Это предотвращает магниты от привязки вместе, прежде чем они были в правильном положении. - Расположите оба магнита таким образом, что вентральная магнит лежит плашмя на ухе (рис 3а).
Примечание: Перед тем как ишемия индуцируется, убедитесь, что мышь выдерживают при температуре 37 ° C и что достаточное обезболивание сохраняется (этап 2.2). - После того, как готов, осторожно пусть магниты собираются вместе (рис 3а Примечание: Для целей визуализации, зажать только половину уха, так что можно наблюдать ИК и не ИК-области.
- Через 1,5 часа ишемии, удалите магниты скручиванием магниты на расстоянии друг от друга с помощью пластиковых направляющих, что позволяет реперфузии иметь место.
Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить уши от биговки, когда магниты помещены. Неполное ишемия очевидна , если макроскопически видимые крупные кровеносные сосуды немедленно повторно заливать (то есть, кровь заполняет сосуды немедленно) после того, как магниты будут удалены. Несмотря на то, реперфузионного не происходит сразу после удаления магнитов, закупорка кровеносных сосудов, является только временным. Таким образом, крайне важно, чтобы подготовить ухо мыши для работы с изображениями как можно быстрее.
5. Инъекция кровеносных сосудов Агенты, использующие метки
- Сразу после удаления магнита, вводить внутривенно (через ретро-орбитальное или инъекции вены хвоста) голубой Эванса (10 мг мл -1в PBS или физиологический раствор; 1 мкл -1 г веса тела) или другой кровеносный сосуд маркировки препаратом выбора.
Примечание: Перед инъекцией убедитесь, что достаточное количество анестезии до сих пор поддерживается выполняя нежный ног щипать.
6. Размещение уха на платформе визуализации
- Вырезать 2 куска клейкой ленты 1,5 см в длину и 1,8 см в ширину.
- Разрешить клей стороны держаться вместе в то время оставляя около 1 мм клея вдоль его ширины.
- Отрежьте клейкую ленту на две части, в продольном направлении, чтобы приспособить его размещение в щели на платформе уха.
- Вставьте эту клейкую ленту примерно на полпути через щели, таким образом, чтобы клейкая сторона была обращена вверх.
- Поместите мышь на грелку, так что ухо быть отображены рядом с помощью клейкой ленты полосы.
- При использовании двух PBS-смоченные хлопка-наконечник аппликаторы, слегка нажмите на ухо к клейкой ленты.
- Используя полосу в качестве ориентира, принести ухо мышичерез щель, одновременно регулируя мышь ближе к сцене.
- Чтобы удалить клейкую ленту, сначала добавить каплю PBS, чтобы уменьшить клейкость ленты.
- Отделить ухо мыши с помощью клейкой ленты как можно более осторожно, используя тонкую кисточку.
- Свести ухо к платформе уха, аккуратно качению влажным ватным кончиком аппликатора над ухом.
- Поместите каплю PBS под покровное (который хранится в положении на держателе покровное с использованием смазки, рисунок 2) и аккуратно поместите ее на ухо. Долейте PBS при необходимости.
Примечание: Держатель покровное увеличивает стабильность во время формирования изображения. - Вставьте ректального датчика температуры и подключить провода к системе отопления в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Установите температуру нагревательного тела площадку до 37 ° C и стадия платформы уха до 35 ° C.
7. Многофотонная Микроскоп Setи визуализации параметров
Примечание: Этот протокол использует единый луч, многофотонный микроскоп с перестраиваемой (680 - 1080 нм) Ti: Sa лазера (3,3 Вт при 800 нм, длительность импульса 140 фс, частота следования импульсов 80 МГц) с объективом 20X воды (NA = 1.0) для изучения прижизненных изображений.
- Откройте программу обработки изображений.
- Совместите лазер в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Регулировка длины волны возбуждения до 950 нм.
Примечание: GFP и Эванс синий может быть одновременно возбуждаются при 950 нм. - Для предварительного просмотра, используйте следующие настройки: 2 мкм scanfield, 505 х 505 разрешение 500 пикселей и частотой развертки 800 Гц в одном сканировании линии. Нажмите кнопку "Предварительный просмотр".
- Переключение аттенюатора (лазер) мощности. Убедитесь, что все необходимые сигналы подбирают, не подвергая поле изображения чрезмерного количества мощности лазерного излучения, которые могут вызвать повреждение тепла.
Примечание: Запуск при низкой мощности аттенюатора и увеличить, если Сигналл тусклое. Поскольку нейтрофилы будет отсутствовать интерстиций в начале моменты времени после реперфузии, макрофаги могут быть использованы в качестве датчика для определения минимальной мощности, необходимой, поскольку первые тусклые, чем нейтрофилы.
Примечание: Если этот шаг должен быть сделан в первый раз, настройте параметры в неишемического зоне, где ожидается неповрежденной целостности сосудов и будет способствовать установлению мощности аттенюатора. В последующих экспериментах эти параметры не требуют больших изменений, если мощность лазера не является неустойчивым. - Настройте параметры ФЭУ.
Примечание: Обратитесь к производителю для максимального оптимального напряжения для усиления ФЭУ. Установка напряжения ФЭУ вне рекомендованного порога приведет к более высоким отношением сигнал-шум. Общая рекомендация состоит в том, чтобы установить напряжение усиления ФЭУ до рекомендованного порога и увеличение мощности аттенюатора по мере необходимости следует сигнал слишком тусклым. - Выберите область изображения, которая находится в непосредственной близости открай ишемии, характеризуется массивным Эванса синего утечки.
- Соберите GFP и синего Эванса сигналов с использованием 525/50 полосовой (BP) и 655/40 фильтры BP, соответственно. Для получения второго сигналов генерации гармоник (SHG) коллагеновых волокон в кожном отделении, используйте 475/42 фильтр BP.
- Создайте папку для сохранения изображений в формате, который совместим для доступного программного обеспечения для анализа изображений.
- Для того, чтобы приобрести, используйте следующие настройки: 2 мкм scanfield, 505 х 505 пикселей резолюции 500, а частота развертки 400 Гц в одном сканировании линии.
- 100 мкм Z-стек с размером шага 4 мкм могут быть получены повторно с течением времени, с интервалом в 1 минуту, чтобы следить за нейтрофильной инфильтрации.
Примечание: Специально для лейкоцитов (например, нейтрофилов) с более высокой скоростью, миграционным интервалом , который длиннее , чем 1 мин может привести к трудностям во время анализа отслеживания клеток. В этом случае пользователь может либо уменьшить толщину переменного токаприобрете- стек или увеличить частоту сканирования.
Примечание: В то время как требуется стек приобретение ишемизированной зоны может выглядеть меньше, в результате сжатия (в качестве альтернативы, характеризующейся более высокой интенсивности SHG), последующее реперфузионное приведет к массивным воспаление, которое вызывает ухо набухать. Значительные дрейфует в Z-направлении, как ожидается. Таким образом, приобретение большого г стек необходимо, чтобы приспособить дрейф. - На протяжении всего изображения, пополнить PBS и воду регулярно, чтобы держать ухо влажной и объектив погружен в воду.
Примечание: Типичный эксперимент обычно длится в течение 2 - 4 ч. В зависимости от экспериментального проектирования, а также в сочетании с хорошо контролируемой режимом анестезии, увеличение продолжительности визуализации возможно.
8. Расторжение эксперимент
- Эвтаназии мышь асфиксией диоксидом углерода в соответствии с учреждения Институциональная Уход за животными и использование комитета (IACUC) прocedures.
Примечание: Всегда эвтаназии мышь утвержденными методами, как определено нормами, правилами и руководящими принципами учреждения. Если повторен изображений необходимо, держать мышь на грелку, пока Анестезия не спадет. После того, как мышь восстановила достаточное сознание и мобильная, вернуть мышь в клетку.
Анализ 9. Изображение
Примечание: Данные, полученные из эксперимента визуализации можно визуализировать с помощью различных программных пакетов.
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
- Под Surpass Mode, импортировать файл (Open → выбрать любой файл в нужную папку → Нажмите кнопку "Открыть").
- Редактирование псевдо цвета, если по умолчанию цвета не применяются (регулировка Edit → Дисплей → На вкладке канала, выберите нужный цвет из цветовой палитры).
- Отрегулируйте яркость, контрастность и фона (Edit → Display → Настройка Переключить Макс и значения Min). Убедитесь в том, что размеры файлов являются правильными (свойства Правка → Изображение → На вкладке геометрии, проверьте размер воксела. В этом протоколе, X = 0,99, Y = 0,99, а Z = 4).
Примечание: Выведите X и Y делением размерности scanfield по пиксельным разрешением. Z представляет собой толщину между каждого среза.
Примечание: Выход из этих наборов данных могут быть представлены в виде максимальных фильмов проекции.
Примечание: Отслеживание анализ необходим , чтобы полностью охарактеризовать клеточные активности и взаимодействия, чтобы понять их функцию в естественных условиях. Подробные инструкции по отслеживанию клеток с использованием функции спот доступной в программном обеспечении можно найти в протоколе в ссылке 15.
Примечание: Есть много способов количественной оценки миграции лейкоцитов, сведения о которых можно найти в обзорной статье в ссылке 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол использует платформу формирования изображений уха кожи по индивидуальному заказу, как показано на рисунке 1. Некоторые особенности этой платформы специально разработаны для облегчения визуализации при сохранении физиологических параметров. Размещение уха на латунную платформе нагретую не только поддерживает ухо при физиологическом температуре 35 ° C, но он также изолирует ухо от неизбежных движений, вызванные дыханием. Добавление металлического зажима на латунной платформе создает разрыв, чтобы предотвратить держатель покровное от оказания веса на ухо, тем самым поддерживая непрерывный поток крови. Ступень платформа также предназначена для размещения грелку, которая будет поддерживать мышь при 37 ° С в течение всей процедуры обработки изображений.
Держатель покровное (Рисунок 2) предназначен , чтобы позволить покровное быть закреплена на металлическом держателе с помощью вакуумных Greaсе. Держатель покровное соединен с подставкой, что позволяет гибко регулировки в вертикальной и горизонтальной осей с помощью адаптера. Таким образом, пользователь может сначала точно отрегулировать положение покровное над ухом, а затем зафиксировать эту позицию, затянув винты на адаптере.
В этом протоколе, мы описали использование магнитов для имитации ишемии и реперфузии. Рисунок 3b показывает репрезентативные точки зрения ушей до и сразу после ишемии. В физиологических условиях крупных кровеносных сосудов могут быть визуализированы макроскопически. Гивающего действия магнитов временно стеблями кровоток, что можно наблюдать с помощью переходного эффекта бланшировки (черная стрелка), когда магниты удаляются.
В этой конкретной демонстрации изображений сосредоточено на краю ишемические зоны (рис 3в (Рис 3). Это создает важные ориентиры для изучения прижизненных изображений и помогает поддерживать согласованность между независимыми экспериментами.
Данные показывают , что, в ответ на ИК оскорбление, проникающими выход нейтрофилов в интерстиций из неповрежденных кровеносных сосудов , выстилающих край ишемического зоны и мигрировать в сторону места повреждения (рис 3d и Movie 1). Мы ожидаем, что задержанный ответ нейтрофилов мигрирующие в интерстиций по сравнению с другими моделями воспаления из-за отсутствия жизнеспособных перфузируя кровеносных сосудов в ранних временных точках после реперфузии. Для того, чтобы полностью охарактеризовать эти клеткиУлар деятельность, анализ отслеживания клеток могут быть использованы , чтобы понять их функцию в естественных условиях. Скорость, среднее смещение, и хемотаксическая индекс некоторые из возможных выходов для чтения, которые могут быть получены из клеток отслеживания анализа.
Рисунок 1. Принципиальная схема выполненного на заказ Стадии Ухо кожи прижизненной многофотонной Imaging. (а) Вид сверху на стадии формирования изображения уха с его размерами. (б) Вид спереди и размеры. Обратите внимание, что латунный пластина толще по бокам, для того, чтобы обеспечить стабильность работы на платформе, и тоньше в середине, чтобы свести к минимуму площадь контакта с кожей, обеспечивая непрерывный поток крови, когда ухо сложенный через край щели и опиралась на платформе. (с) вид сбоку изогнутого держателя , что штифтами вниз зонд обратной связи. Грелку может бытьзакрепленного на платформе с помощью клейкой ленты, (не показано). Измененный Ли и др., Nat Protoc 2012 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Конструкция держателя покровного; Сбоку и сверху. Держатель покровное имеет покровное в фиксированном положении и, таким образом, уменьшает Z-дрейф. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Модель ИК. (А) Принципиальная схема , показывающая расположение магнитов. (В) (С) Схема уха , показывающим область изображенную относительно где магнит был помещен. (D) Максимальная интенсивность Z-проецируются снимки из последовательности в заданный промежуток времени , показывающий нейтрофильной инфильтрации пост-реперфузии у мыши LysM-EGFP. Прошедшее время показано в формате ЧЧ: ММ. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1. Нейтрофильная от кадрового агентства в ИК травмы. Покадровой последовательность максимальной проекции, показывающий нейтрофилов (зеленый) инфильтрацию в ответ на реперфузии в LysM-EGFP альбинос мыши кожи уха через 1,5 ч после ишемии. В ранние сроки, отсутствиеЭванс синий сигнал (красный) указывает на временную окклюзию сосудов после ишемии. Коллаген (синий, генерация второй гармоники). Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значение
ИК является одной из ведущих причин пролежней кожи. На ранних стадиях (I и II) пролежней описывают состояние кожи человека (по сравнению с базовыми подкожных тканей и мышц). Тем не менее, понимание иммунологической этиологии до сих пор отсутствует. Здесь мы представляем простой и надежный ИК-модель на мыши кожи уха для того, чтобы устранить этот пробел. Мы моделируем ишемию путем зажима уха мыши между двумя магнитами, а затем изучить иммунные реакции ниже по течению после удаления магнита (реперфузии). При использовании магнитов для создания постоянного давления на каждое ухо в течение фиксированного периода времени, вызывая ишемию, мы способны обеспечить воспроизводимость и согласованность между экспериментами.
Сила этого неинвазивного IR модели также заключается в его способности , чтобы продемонстрировать, в режиме реального времени, в естественных условиях иммунных реакций с использованием хорошо известной модели прижизненной Imaginг кожи уха, которая обеспечивает большую стабильность во время формирования изображения по сравнению с процедурой, фланговых кожи. Некоторые из современных моделей фланговых кожи включают хирургические процедуры , которые могут изменить иммунный ландшафт кожи 4. Кроме того, визуализации самой кожи представляет собой флангом техническую проблему, поскольку дыхательные движения могут внести свой вклад в артефакты движения , связанные во время съемки 5,6. Наша текущая модель обходит эти проблемы.
В дополнение к изучению физиологические реакции иммунных клеток к ИК, эта модель также может быть применима к патофизиологических параметров, например, сахарный диабет, где диабет может ухудшить ИК травмы за счет увеличения окислительного стресса. Понимание иммунных ответов будет способствовать пониманию заживления ран.
Критические шаги
После того, как мышь под наркозом, терморегуляция нарушается и температура тела резко падает. Для предотвращения hypotHermia, внешний нагрев имеет важное значение для поддержания температуры тела сердечника при 37 ° С. Ухо, расположенный дистально к сердечнику тела, физиологически Охладитель по 1 - 2 ° C и должна поддерживаться на уровне 35 ° С. Эта согласованность в системах отопления будет также обеспечивать воспроизводимые чтения минусами динамики клеток. В то же время, система отопления должна быть проверена, чтобы гарантировать, что мышь не перегревать по всей длине анестезии.
Использование белых мышей (BALB / C и C57BL / 6-C 2J) для всех методов визуализации кожи настоятельно рекомендуется , чтобы избежать пигментных индуцированных травм зернистость. Если мышей-альбиносов не доступны, уменьшая мощность лазера во время захвата изображения может облегчить проблему для пигментированных мышей. Тем не менее, дальнейшая оптимизация может быть необходима, как уменьшение глубины проникновения в ткани может привести к более неблагоприятным исходом приобретения.
Кожа уха очень нежная; следовательно, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать каких-либо обстоятельств,может вызвать воспаление. Примеры ненадлежащих методов включают, но не ограничиваются ими, следующие: 1) выдерживание Крем для депиляции на за чрезмерного количества времени, в течение того, что рекомендуется; 2) применение чрезмерное трение на ухе, когда в результате чего ухо через щель платформы визуализации уха или при отсоединении ухо от клейкой ленты,; и 3) перегрева ухо, либо из-за неисправности системы отопления или неуместного температуры обратной зондом, который может записывать температуру окружающей среды, а не температуру ядра мыши.
Модификации и устранение неисправностей
Большая часть поиска неисправностей , относящиеся к процедуре подготовки уха ранее перечисленных 8. Если ухо проецируется на более позднем этапе после реперфузии, ухо может набухать за пределы зазора 0,5 мм , создаваемого металлическим зажимом , чтобы приспособить толщину уха (рисунок 1). В этом случае размещение покровного стекла над ухомможет затруднить приток крови, что является очевидным, когда макроскопически видимые кровеносные сосуды исчезают из поля зрения. Этого следует избегать, создавая больший зазор между держателем покровное и латунной платформе. Это можно сделать двумя способами, либо вручную регулировать высоту держателя покровного (рисунок 2) или с помощью более толстый металлический зажим.
Ограничения техники
В этом протоколе, мы использовали синего Эванса, чтобы определить местоположение ишемизированной зоны, так как утечка синего Эванса в интерстиции отмечает границу ишемизированной зоны в ранние моменты времени после ишемии. Evans Blue обычно используется в качестве маркировки агента кровеносного сосуда. Однако при воспалительных состояниях, целостности сосудов серьезно скомпрометирована. Это приводит к утечке Evans Blue в интерстиций. В этой модели мы наблюдаем резкое снижение контраста между кровеносных сосудов и интерстиция вскоре после реперфузии. Таким образом, в стudies где лейкоциты-эндотелиальной взаимодействия вовлечены, мы рекомендуем экспериментировать с другими мечения кровеносных сосудов агентов различных размеров (например, декстраны, и т.д.).
Будущие приложения
К тому же использование мыши LysM-EGFP, чтобы продемонстрировать, как нейтрофилы реагируют на ИК кожи, эта модель также может быть использован для изучения других ответов лейкоцитов, как в инфильтрации (моноциты) и резидент интерстициальных (макрофаги), лейкоциты. Эта модель также может быть распространена и на другие исследований по изучению крови и лимфатической целостности, а также лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия после травмы IR. В сочетании с возможностью визуализации коллагена в качестве сигналов SHG через MP-IVM, также было бы интересно следить за целостность коллагена после того, как ИК-порт или во время заживления ран. Таким образом, мы создали неинвазивный, надежную модель IR для прижизненной визуализации с целью изучения иммунных реакций в коже мыши уха.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
