Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Summary

Nous présentons une open source haute analyse de contenu (HCA) en utilisant l'instrument automatisé d'imagerie de fluorescence à vie (FLIM) pour analyser les interactions entre protéines en utilisant Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) Affichages sur la base. L' acquisition de données pour cet instrument openFLIM-HCA est contrôlé par un logiciel écrit en μManager et l' analyse des données est effectuée en FLIMfit.

Abstract

Nous présentons un instrument d’analyse à haut contenu open source utilisant l’imagerie automatisée à durée de vie de fluorescence (FLIM) pour tester les interactions protéiques à l’aide de lectures basées sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) de cellules fixes ou vivantes dans des plaques multipuits. Cela fournit un moyen de dépister les processus de signalisation cellulaire lus à l’aide de biocapteurs FRET intramoléculaires ou d’interactions FRET intermoléculaires telles que l’oligomérisation ou l’hétérodimérisation, qui peuvent être utilisés pour identifier les partenaires de liaison. Nous décrivons ici la fonctionnalité de cette instrumentation FLIM automatisée à plaques multipuits et présentons des données exemplaires de nos études sur l’oligomérisation de la protéine Gag du VIH et une évolution temporelle d’un biocapteur FRET dans des cellules vivantes. Une description détaillée de la mise en œuvre pratique est ensuite fournie avec référence à une liste de composants matériels et à une description du logiciel d’acquisition de données open source écrite dans μManager. L’application de FLIMfit, un client open source basé sur MATLAB pour la plateforme OMERO, pour analyser des réseaux de données FLIM de plaques multipuits est également présentée. Les protocoles d’imagerie des cellules fixes et vivantes sont décrits et une démonstration d’une expérience FLIM automatisée à plaques multipuits utilisant des cellules exprimant des constructions FRET à base de protéines fluorescentes est présentée. Ceci est complété par une présentation générale de l’analyse des données pour cet ensemble de données FRET FLIM spécifique.

Introduction

L'utilisation croissante de l' analyse de contenu haute automatisé (HCA) dans la découverte de médicaments ¹ à des banques de composés d'essai est complété par l'évolution de la science de la vie de la recherche fondamentale vers des expériences d'imagerie automatisées pour des études systématiques, par exemple, pour les écrans phénotypiques des bibliothèques siARN. HCA automatisé est également de plus en plus important pour les petites études à grande échelle biologique qui ont généralement été mises en œuvre avec des expériences manuelles avec des dizaines de boîtes de cellules imagées avec des microscopes conventionnels. La puissance statistique conférée par l'aptitude à doser et d'analyser des centaines à des milliers de champs de vision permet la moyenne du bruit expérimental (y compris le «bruit biologique») et l'automatisation de l'acquisition et l'analyse de grands réseaux d'échantillons de données d'image peut aider à éliminer le biais de l'opérateur et souvent peut être utilisé pour détecter l'apparition d'erreurs systématiques, par exemple un changement dans le profil de l'IRF lors d'une acquisition. Fluorescence base des essaissont largement mis en œuvre en HCA, avec la plupart des instruments disponibles dans le commerce HCA avec l'imagerie d'intensité de fluorescence dans un ou plusieurs canaux spectraux pour cartographier la distribution relative et la co-localisation des protéines marquées. Plus sophistiqués modalités d'imagerie de fluorescence, telles que l' imagerie de fluorescence à vie (FLIM), la polarisation anisotropie imagerie et anisotropie de fluorescence imagerie résolue en temps, ne sont pas largement exploitées dans les instruments de HCA commerciaux, bien qu'ils offrent des lectures quantitatives puissantes, par exemple, des interactions entre protéines. Nous présentons ici une approche open source pour la mise en œuvre FLIM dans un microscope automatisé pour HCA.

Vie de fluorescence fournit une lecture spectroscopique inhérente ratiométrique qui peut être utilisé pour distinguer les espèces moléculaires différentes ou pour sonder l'environnement moléculaire local d'un fluorophore et est insensible à la concentration en fluorophore, à l'efficacité d'excitation / détection et à l'impact de scatteanneau et échantillon absorption ^2. En outre, étant donné que les mesures de fluorescence de durée de vie peuvent être réalisées dans un seul canal spectral, ils sont directement comparables entre les différents instruments et les échantillons sans étalonnage. Ils peuvent être appliqués à des fluorophores endogènes, y compris des métabolites cellulaires, des lipides et des composants de la matrice extracellulaire, pour fournir des lectures intrinsèques des processus biologiques et des pathologies. Ainsi FLIM sans étiquette peut cartographier les changements métaboliques dans les cellules ^3,4 et a été appliqué pour surveiller la différenciation des cellules souches ^5,6 et la croissance des échafauds de collagène ^7. Nous avons récemment démontré que FLIM HCA peut être utilisé pour des tests automatisés sans étiquette du métabolisme cellulaire utilisant autofluorescence ^8. Plus communément, cependant, les mesures de fluorescence à vie et FLIM sont appliquées à des fluorophores exogènes qui étiquettent biomolécules spécifiques, souvent mis en œuvre en utilisant des colorants qui tachent les compartiments cellulaires, en utilisant des colorants couplé à antibodies qui ciblent des protéines spécifiques dans les cellules fixes, ou en utilisant des fluorophores génétiquement exprimées couplés à des protéines spécifiques. Vie de fluorescence peut être utilisée pour fournir des lectures quantitatives fiables de détection des sondes fluorescentes leur environnement physique ou chimique. Pour des exemples, les colorants ont été déployés pour détecter la phase lipidique locale des membranes cellulaires ⁹ ou la viscosité de la cellule ¹⁰ et les biocapteurs à base de protéines fluorescentes génétiquement exprimées ont été développées pour signaler des concentrations de cellules de molécules de signalisation comprenant en IP3 ^11, PIP2 ¹² et calpaïne ¹³ ou des ions tels que calcium , ^{14,15, 16} le potassium et le chlorure ^17.

Beaucoup de ces biocapteurs utilisent Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ^18,19 pour fournir des lectures de changements dans la conformation de biocapteur. FRET entre «donneur» et fluorophores "accepteurs" se produit par l'intermédiaire d'une gamme courte dipôle-dipôle directe interactionpour lequel les fluorophores sont généralement séparés par moins de ~ 10 nm. Ainsi , la détection du FRET indique la proximité des protéines marquées de façon appropriée et fournit donc un moyen pour lire les interactions protéine-protéine ²⁰ tels que la liaison ou oligomérisation - soit en tant que points d'extrémité dans des cellules fixées ou des événements comme dynamiques de mesures du décours temporel de temps réel cellules. Par marquage d' un produit d' assemblage moléculaire approprié avec des fluorophores donneur et accepteur, il est également possible de lire des changements conformationnels - ou le clivage - de la construction par l' intermédiaire de la variation de FRET et cela constitue la base de plusieurs biocapteurs ^21. Mesures de l'efficacité de FRET peut fournir des informations sur la distance donneur-accepteur et la fraction de la population des fluorophores donneurs subissant FRET. Ainsi, les techniques d'imagerie à base de FRET peuvent être utilisés pour cartographier et quantifier les interactions moléculaires dans l' espace et le temps, par exemple, pour élucider la signalisation cellulaire traite ^22. AutomatING ces techniques d'imagerie pourraient fournir des analyses à haut débit basé sur des lectures de voies ou de réseaux de signalisation.

Dans HCA, la lecture de FRET plus couramment mis en oeuvre est l'imagerie ratiométrique spectrale, où des changements dans le rapport de l'accepteur à l'intensité des donateurs sont mappés. Bien que cette approche est facilement mis en œuvre - et est disponible dans de nombreux disponibles dans le commerce des lecteurs de plaques multipuits - mesures de FRET résolues spectralement quantitatives nécessitent un étalonnage de la réponse spectrale du système ^23. Cela inclut la diaphonie spectrale résultant de spectrale purge à travers et l'excitation directe de l'accepteur ainsi que les caractéristiques de transmission de l'instrument et l'échantillon (effet de filtre interne). En principe, cela implique la mesure des échantillons supplémentaires de «contrôle» qui sont marquées soit avec seulement donneur ou accepteur seule.

A partir de ces mesures spectrales FRET ratiométrique, une efficacité de FRETl' efficacité (le produit de l'efficacité de FRET réelle et de la fraction de molécules FRETing donneur / accepteur) peut être obtenu en même temps que la proportion relative des molécules de donneur et d' accepteur ^24. FRET ratiométrique Spectral est souvent utilisé avec des biocapteurs FRET unimoléculaire, où le stoechiométrie donneur / accepteur peut être supposé connu. Pour déterminer les fractions de la population du donneur et de l' accepteur FRETing, par exemple pour obtenir une courbe dose - réponse, la connaissance de l'efficacité de FRET réel est nécessaire. Ceci peut être obtenu en mesurant un échantillon de contrôle positif de FRET avec des propriétés connues ou en utilisant une autre méthode pour mesurer l'efficacité de FRET comme accepteur photoblanchiment ou FLIM.

En utilisant la durée de vie de fluorescence des lectures, le FRET peut être détecté et quantifié par mesure de l'émission du donneur seul - en supprimant la nécessité d'un étalonnage spectral et d'autres échantillons témoins. Ainsi, les lectures FLIM FRET peuvent être comparés entre les instrumentset entre les différents échantillons - permettant les données de l' endoscopie ou la tomographie par des modèles de maladies en direct ²⁵ être comparés à des mesures de tests cellulaires. En adaptant les profils de décroissance de la fluorescence du donneur à un modèle de décroissance multi-exponentielle appropriée correspondant à FRETing et les populations de donneurs non-FRETing, FRET efficacité et les fractions de population peuvent, en principe, être obtenus directement sans autres mesures. Ces avantages importants, cependant, viennent au prix de FLIM nécessitant des photons plus détectés par pixel que l'imagerie d'intensité résolution spectrale - généralement des centaines de photons sont nécessaires pour atteindre une précision dans la détermination de la durée de vie de 10% lors du montage d'un seul modèle de décroissance exponentielle et quand profils de fluorescence de désintégration d'ajustement à (décroissance) multiexponentielle modèles complexes, le nombre de photons détectés augmente à des milliers nécessaires. Cela a classiquement conduit à des temps d'acquisition longs (des dizaines à des centaines de secondes par domaine de la view) pour FLIM, en particulier lors de l'utilisation du temps corrélée comptage de photon unique (TCSPC) mis en œuvre avec l'acquisition de pixel séquentielle dans les microscopes à balayage laser. Les tentatives visant à augmenter la vitesse de formation d'image en utilisant des intensités d'excitation peuvent conduire à photoblanchiment et / ou de phototoxicité significative. Avec un manque d'instrumentation et des outils logiciels disponibles dans le commerce appropriés, ce qui a empêché FLIM d'être utilisé dans HCA pour la découverte ou systèmes médicaments biologie, où des centaines de milliers de champs de vue sont à imager. Le balayage laser TCSPC FLIM a été mis en œuvre dans une plaque multipuits microscope automatisé ²⁶ pour les mesures secondaires suite à l' identification des "hits" par l' état d' équilibre de polarisation fluorescence résolue anisotropie imagerie ^27, qui peut atteindre des vitesses d'imagerie similaires à l' imagerie ratiométrique spectrale ²⁸ avec lequel il partage de nombreux avantages et inconvénients. l'imagerie de fluorescence d'anisotropie exploite la diminutiondans anisotropie de fluorescence de l'accepteur , en présence de FRET et est également sensible à la diaphonie spectrale (par exemple, l' excitation directe de l'accepteur). Il nécessite un étalonnage pour tenir compte de la polarisation diaphonie et ne fournit pas une mesure directe de l'efficacité FRET.

Pour réaliser les avantages de FLIM pour HCA, nous avons travaillé pour régler les problèmes de vitesse d'acquisition d'image et d'un accès plus large à la technologie. Ici, nous fournissons une liste complète des logiciels de source et des composants matériels ouverts qui peuvent être utilisés pour mettre en œuvre le lecteur rapide automatisé FLIM multipuits de plaque qui est décrit ci-dessous, ainsi que FRET exemplaire-analyses basées. Dans notre approche ^29, FLIM est réalisée à l' aide grand champ imagerie en temps-dépendants en utilisant une gated image optique intensificateur (GOI), qui est illustrée à la figure 1 qui peut fournir de plus grandes vitesses d'imagerie et photoblanchiment inférieure à faisceau unique balayage TCSPC en raison de la interr pixel parallèleogation. Notre instrument openFLIM-HCA peut fournir FLIM sans surveillance, ne nécessitant que quelques secondes pour acquérir des données de détection FLIM quelques 100 photons par pixel ( en fonction de la luminosité de l'échantillon). Combiné avec le temps nécessaire pour déplacer l'échantillon à partir du champ précédent de vue, pour ajuster les paramètres d'acquisition et de maintenir l'échantillon au point, cela se traduit généralement en multipuits temps d'acquisition de la plaque de ~ 10 s par champ de vision ^25,28. Tronçonnage optique peut être mis en œuvre en utilisant un grand champ quasi Nipkow ( "disque de filage") du scanner ^30.

Pour l' analyse des données FLIM, nous avons développé un outil logiciel open source appelé FLIMfit ³¹ qui est capable d'analyser rapidement multipuits ensembles de données plaque FLIM sur les postes PC classiques et est un plug-in pour OMERO ^32. FLIMfit fournit des capacités d'analyse globales (décrites à la section 1.2) qui permettent aux données FLIM à être montés sur des modèles complexes avec oeul quelques 100 photons par pixel sous l'hypothèse que les composantes de fluorescence à vie sont invariant sur une image ou d'une région d'intérêt (ROI), réduisant ainsi le nombre de photons détectés nécessaire, l'exposition à la lumière de l'échantillon et l'acquisition de l'image du temps. Exécution FLIMfit sur un PC de bureau standard, ne nécessite que 10s de secondes de temps de calcul pour analyser les ensembles de données comprenant des centaines de FOV. Ainsi, tant l'acquisition de données FLIM et l'analyse peuvent être entreprises sur des échelles de temps qui sont pratiques pour HCA.

matériel openFLIM-HCA

Notre mise en œuvre de FLIM HCA comprend six éléments clés: (i) un cadre de microscope à fluorescence avec autofocus optique; (Ii) un (xyz) platine de microscope motorisée; (Iii) une source laser d'excitation; (Iv) un système de FLIM temps gated grand champ avec intensificateur gated optique (GOI), générateur de retard et de la caméra; (V) un ordinateur pour l'acquisition des données et l'analyse et (vi) un dispositif de balayage de disque de Nipkowunité d'imagerie optique sectionnée pour supprimer hors de la lumière de mise au point. Cela peut être important lors de l' imagerie de signaux faibles, par exemple de biocapteurs FRET à la membrane plasmique de la cellule, pouvant être submergée par les contributions de fluorescence cytoplasmique ou fond de lamelles ou de milieu de culture. données FLIM Time-gated est acquis en éclairant l'échantillon avec le ultracourtes pulsée rayonnement d'excitation, l'imagerie de la fluorescence émission à la photocathode du GOI et l'acquisition d'une série d'images CCD du phosphore du GOI pour une gamme de paramètres de temporisation de la porte intensificateur optique après l'arrivée des impulsions d'excitation. Comme le temps de grille retard après excitation est augmentée, le signal de fluorescence est visible à diminuer et la série d'images d'intensité de fluorescence en temps-dépendants acquises sur le CCD forment l'ensemble des données nécessaires pour analyser les profils de décroissance de tous les fluorophores dans le champ de vision . Le déclenchement de l'IGE est synchronisée avec les impulsions d'excitationet, pour la série d'acquisitions CCD, le retard du temps de grille par rapport aux impulsions d'excitation est réglée sur une série de valeurs croissantes dans la plage souhaitée. Cette synchronisation est obtenue en utilisant le générateur de retard qui comprend une "boîte rapide de retard" (fournissant des retards jusqu'à 20 ns pas de 1 ps) et une "boîte de retard grossier" qui fournit des retards d'un pas minimum de 25 ps.

Pour FLIM, l'excitation peut être fournie par un laser femtoseconde. Pour plus de commodité, on emploie typiquement une source supercontinuum fibre laser à pompage qui fournit des impulsions picosecondes accordables dans le spectre visible à partir de laquelle le rayonnement d'excitation approprié peut être sélectionné pour chaque fluorophore à l'aide d'une roue de filtre motorisée avec différents filtres passe-bande. En règle générale, nous utilisons une puissance moyenne de ~ 100-200 mW à l'échantillon avec des impulsions à taux de répétition de 40 ou 60 MHz. Ces pouvoirs d'excitation pourraient également être fournis par des sources laser ultrarapides basées sur le doublage de fréquencemode verrouillé titane dopé lasers de saphir. Notez qu'une durée d'impulsion d'excitation en dessous de ~ 100 ps est suffisant pour la plupart des expériences. Une deuxième roue de filtre motorisé équipé de filtres de densité neutre est utilisée pour réguler l'intensité d'excitation. Pour plus de sécurité et de commodité, le rayonnement d'excitation peut être délivré par l'intermédiaire d'une fibre optique monomode. Les configurations pour FLIM grand champ et FLIM optiquement sectionnée sont présentés dans les figures 2 et 3 respectivement. Pour plus de détails sur les composants précis utilisés, s'il vous plaît visitez le wiki openFLIM-HCA ^33. Une copie de la liste des pièces en cours est donnée dans le matériel supplémentaire.

Pour grand champ FLIM, le rayonnement d'excitation est nécessaire pour éclairer l'ensemble du champ de vue aussi uniforme que possible. Pour cela, nous dirigeons le faisceau laser d'excitation à un diffuseur holographique "chapeau" qui est mis en rotation à 10-50 Hz à moyenne temporelle de la granularité laser, avec le plan de la difl'unité de fusion étant imagée sur le plan focal arrière de l'objectif de microscope objectif. L'image de fluorescence à partir du port de sortie du microscope est relayé sur la photocathode du GOI et la substance fluorescente de la GOI (surface active diagonale de 18 mm) est imagé sur le capteur d'un capteur CCD scientifique refroidi (taille de la puce 10,2 mm x 8,3 mm) caméra à l'aide d'une paire de lentilles de caméra fournissant un grossissement de 0,7. Le système est contrôlé par un ordinateur standard qui est relié à l'instrumentation utilisant des protocoles RS232. En outre, un microprocesseur Arduino est utilisé pour commander un volet roulant dans le chemin de lumière d'excitation qui est fermée, sauf lorsque la caméra CCD est l'acquisition des données FLIM et pour enregistrer le signal provenant d'une photodiode qui est utilisé pour mesurer la puissance moyenne du supercontinuum spectralement filtrée la source d'excitation. Pour FLIM optiquement sectionnée, le rayonnement laser d'excitation est couplée dans une fibre optique monomode conservant la polarisation qui se connecte directement à l'unité de lecteur de disque de Nipkow, comme shown sur la figure 3. L'image de fluorescence de sortie de l'unité de scanner Nipkow est relayé sur la photocathode du GOI et le reste du système est le même que pour grand champ FLIM.

logiciel openFLIM-HCA

Le logiciel d'acquisition de données est écrit dans μManager ^34. Il fournit des fonctionnalités d'acquisition de données complète de HCA y compris les options pour changer l'ordre dans lequel les puits de la plaque sont imagés, pour acquérir des cours à temps pour tout FOV, pour maintenir automatiquement le focus lors des mesures et pour contrôler les roues d'excitation et de filtrage d'émission et le changeur de dichroïque pour l'imagerie multicolore automatisé. Il est également possible d'exécuter une acquisition "préscan" l' intensité de fluorescence afin d'identifier automatiquement et enregistrer les positions de FOV convenables pour une acquisition FLIM ultérieure selon des critères, par exemple, en fonction de l' intensité. données HCA FLIM peuvent être enregistrés comme une sériedes fichiers TIFF, comme une série de fichiers OME-TIFF (ie, un par FOV) ou en tant que fichier OME-TIFF unique intégrant toutes les données à partir d' une plaque multipuits. Plus d' informations et une description détaillée du logiciel μManager peuvent être trouvées sur le wiki openFLIM-HCA ^33.

Le logiciel d'analyse de données, FLIMfit ^31, un client basé sur MATLAB open source pour l'image de OMERO plate - forme de gestion des données ^32, est en mesure de lire les données FLIM à partir d' un serveur OMERO ou à partir du disque de l' ordinateur, comme indiqué sur la Figure 4. Il a été conçu pour analyser les données de TCSPC ou instruments FLIM grand champ temps fermé et offre de nombreuses possibilités pour adapter les données de openFLIM-HCA y compris raccord à monoexponentielle profils de désintégration, et de doubler les profils de désintégration complexité exponentielle et supérieur, y compris des modèles tels que profils fluorescence désintégration polarisation résolue. Il peut également tenir compte des signaux de fond fixes et variables dans le temps et peut utilize une fonction mesurée spatio-temporelle réponse de l'instrument (IRF) ou peut adapter à l'aide d'un IRF idéalisé qui peut être décalé dans le temps sur une base de pixel par pixel par une quantité déterminée à partir de la pleine mesure expérimentale IRF. Une différence de temps global (t ₀₎ entre l'IRF et un échantillon fluorescent peut être déterminée à partir d' une mesure d'un niveau de fluorescence. Les variations spatiales dans les signaux de fond et IRF peuvent aussi être prises en compte. FLIMfit est en mesure d'adapter les données FLIM sur une base de pixel par pixel ou en utilisant "binning global" ou "ajustement global" pour faciliter le montage des données FLIM avec modestes (centaines) de photons nombre de modèles de désintégration complexes.

Binning mondiale entraîne l' agrégation de toutes les photons détectés à partir des pixels au sein d' un retour sur investissement défini par l' utilisateur à chaque point de temps pour fournir un nombre de photons suffisantes pour permettre de montage des modèles de désintégration complexes. Le retour sur investissement peut être la totalité du champ de vision (FOV), il peut être manuellement defined par l'utilisateur, ou bien elle peut être déterminée à l'aide d'outils de segmentation d'image. Le retour sur investissement peut également être défini à l' aide de masques importés dans FLIMfit d'autres logiciels de segmentation d' image. Pour les applications FRET, il est courant d'utiliser binning globale pour répondre à un double modèle de décroissance exponentielle pour déterminer les composantes de fluorescence de durée de vie correspondant à FRETing et fluorophores donneurs non-FRETing qui sont supposés être spatialement invariant à travers le ROI, puis à remonter sur un base de pixel-sage avec ces vales de composants à vie fixes afin d'obtenir la fraction de la population FRETing des donateurs dans chaque pixel.

Montage global implique raccord simultanément les composants à vie et les fractions de la population FRETing des donateurs pixel-sage à travers toute une FOV- ou à travers un ensemble de données FLIM qui pourraient comprendre plusieurs FOV, par exemple, à partir d' une expérience de plaque multipuits ou une série temporelle d'images de fluorescence à vie. raccord Global est en mesure d'exploiter la Variati spatialesur des fractions de la population à travers l'image qui est perdu dans l'approche globale de binning pour fournir des contraintes plus fortes sur l'estimation de la durée de vie composante - et donc des résultats plus fiables - mais au prix de beaucoup plus de calcul ^35. FLIMfit peut analyser rapidement multipuits ensembles de données plaque FLIM avec ajustement global sur les postes de travail PC classiques avec, par exemple, un ensemble multipuits temps-dépendants données FLIM, acquis avec cinq portes de temps pour chacun des 394 FOV comprenant chacun 672 x 512 pixels, ce qui nécessite seulement 32 secondes et 2 Go de mémoire pour adapter à un modèle de décroissance exponentielle à double ^31. Ceci a été réalisé en utilisant un non linéaire séparable moins d'algorithme d' ajustement carré mis en œuvre en utilisant des algorithmes parallèles multithread pour permettre détartrage efficace sur les processeurs multicœurs et le code de FLIMfit a été optimisé pour réduire au minimum l' utilisation de la mémoire. La figure 5 montre un aperçu de l'interface utilisateur graphique de FLIMfitet plus de détails peuvent être trouvés à la page Web donnée en référence 36. De plus amples informations sur le montage global et binning global peut être trouvé dans la référence 31.

Le protocole suivant pour HCA FLIM utilisant notre instrumentation et logiciels openFLIM-HCA peut être adapté à un large éventail d'expériences d'imagerie cellulaire avec affichage FLIM. En général, plaque multipuits FRET expériences doivent être conçues pour inclure des puits réplicats de contrôles biologiques positifs et négatifs, en plus des conditions à l'étude. Ici, nous décrivons la mise en œuvre spécifique à accomplir FLIM optiquement sectionnée (voir Figure 3) des cellules Cos exprimant FRET constructions consistant en la mTurquoise protéine fluorescente et Vénus protéine fluorescente rejoint par un lieur peptidique court. Ici, le mTq32V, mTq17V et mTq5V FRET constructions (discutés dans la section des résultats représentatifs) fournir à faible, moyenne et haute efficacité de FRET ainsi que le non-FRETing mTq5A construire.Ces constructions et les autres matériaux nécessaires pour suivre ce protocole sont répertoriés dans la liste des matières.

Protocol

1. Préparation de la plaque multi-puits Tableau

1. Préparer une solution de 75 uM de coumarine 6 dans de l' éthanol (~ T permet 2,43 ns) pour des mesures de référence pour permettre la détermination de t _0.
2. Seed 150.000 cellules Cos dans quatre puits d'une plaque à 6 puits et permettre de fixer pendant une nuit dans un milieu de culture (voir la liste des matériaux).
3. Transfecter un puits chacun avec mTq5A, mTq5V, mTq17V et mTq32V utilisant un réactif de transfection commerciale selon les instructions et la culture du fabricant pour 24 h.
4. Détacher les cellules en utilisant une solution commerciale de trypsine / EDTA, selon le protocole du fabricant.
5. 5000 cellules Cos pipetage en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) exprimant mTq5A dans chacun des puits A1-G3 d'une épaisseur de 96 plaque multipuits # 1,5 à fond de verre qui a été préalablement traité avec de la poly-L-lysine. Répétez l'opération pour mTq5V des cellules exprimant dans des puits A4-G6, mTq17V dans des puits A5-G9 et mTq32V dans les puits A10-G12.
6. Laisser bien H1 vide (pour fournir une mesure de toute arrière-plan statique de la plaque multipuits).
7. Introduire à la pipette 200 ul de HBSS uniquement dans H2 puits (pour fournir une mesure de tout signal de fond provenant du milieu de culture cellulaire).
8. Pipette 5000 cellules non transfectées dans HBSS en H3 bien (pour fournir la mesure de tout signal de fond de autofluorescence cellulaire).
9. Pipeter 200 ul de la solution de colorant coumarine 75 pM dans le puits H4 (pour fournir un contrôle sur toute variation de t ₀ lors de l'acquisition de plaque multipuits, par exemple, en raison de changements dans la température ambiante ou aux fluctuations de laser ou la synchronisation des circuits.

2. openFLIM-HCA Acquisition de données

NOTE: Des informations détaillées disponibles sur le wiki openFLIM-HCA ^33.

1. Démarrer μManager et le plugin OpenFLIM-HCA
2. Sélectionnez le fichier de calibration pour la combinaison spécifique de l'unité de générateur de retard ettaux de répétition laser sous «contrôle FLIM: Retard fichier de calibration de la boîte: Calibration Files".
3. Définissez le dossier où les données seront enregistrées sous la rubrique «Fichier: Définir le dossier de base".
4. Vérifiez que le trajet du faisceau d'excitation pour faire en sorte que le couplage dans la fibre optique de distribution est stable et que le rendement de couplage est maximisée par l'énergie transmise par la fibre de distribution à l'aide d'un compteur de mesure de puissance. Fluctuations inférieures à 5% sont acceptables.
5. Vérifiez que le GOI déclenchement est stable en affichant le signal de sortie du moniteur du GOI sur un oscilloscope déclenché par le signal d'entrée de déclenchement GOI.
6. Contrôler l'image de la substance luminescente GOI sur le capteur CCD en couvrant la photocathode du GOI, fixant son gain à 750 V et en se concentrant une des lentilles de relais de telle sorte que des images d'événements de photons uniques rares (en raison de la lumière de fond qui fuient si le couvercle GOI ) enregistré sur le CCD sont aussi nettes que possible.
7. Vérifiez que l'échantillonle champ de vision est uniformément éclairé par l'imagerie d'un échantillon fluorescent uniforme, telle qu'une goutte de la solution de colorant de référence sur une lamelle couvre-objet, en utilisant une puissance suffisamment basse d'excitation (<1 uW) pour faire en sorte que le GOI ne soit pas saturé.
8. Sélectionnez le fichier de définition appropriée de la plaque, à savoir, sélectionnez l' option pour les plaques à 96 puits ( "Fichier: propriétés de charge des plaques»).
9. Utilisation de l'μManager GUI, assurez -vous qu'il n'y a pas de cube diviseur de faisceau dichroïque dans le cadre de microscope en sélectionnant une position vide.
10. Sélectionnez manuellement une largeur de 4 ns de grille au GOI pour l'ensemble de l'expérience.
11. Acquérir IRF données d'image:
    1. En utilisant l'interface utilisateur graphique μManager, en sorte qu'il n'y ait pas d' objectif de microscope dans la trajectoire du faisceau en sélectionnant une position vide. placer manuellement un bloc de faisceau anodisé noir au-dessus de la tourelle objectif pour empêcher tout échappement de lumière laser et de l'angle pour minimiser toute réflexion de nouveau dans le cadre de microscope.
    2. Utilisation de l'μManager GUI, régler les filtres de la CSUX (excitation, dichroïque, émission) de telle sorte que la fraction de lumière d'excitation diffusée à partir du disque de Nipkow filature peut être imagée , mais d' assurer l'intensité est insuffisante pour saturer le système de 200 ms CCD de temps d'intégration. Ceci afin d'éviter l'exposition de la photocathode GOI à trop de lumière, ce qui pourrait endommager la photocathode.
    3. Utilisez la fonction Recherche de MaxPoint sur toute la gamme des retards couverts par la boîte de retard rapide programmable. Vérifiez le schéma de sortie affichée puis réglez la boîte manuelle de retard de cours en appuyant sur le bouton avant de sorte que le profil complet IRF se situe dans la plage de balayage de la boîte de délai rapide.
    4. Réglez les paramètres d'acquisition (de densité neutre, temps d'exposition, l' accumulation de trame) de sorte que le CCD est pas saturé dans la plus brillante du temps porte et le temps d'intégration efficace est> 200 ms.
    5. Définir les étapes de retard de 25 ps sur le retard complet a sonnée ( «contrôle FLIM: boîte de délai rapide: Peupler retards").
    6. Acquérir l' image IRF en appuyant sur "image snap FLIM".
    7. Acquérir une image de fond en bloquant le laser ( «contrôle de chemin de lumière: densité neutre: bloqué"), ce qui réduit le nombre de retards ( "contrôle FLIM: boîte de délai rapide: réglage de retard actuel (ps)"), laisser toutes les autres propriétés inchangées et appuyez sur "Aligner l' image FLIM".
12. Acquérir des données de colorant de référence:
    1. Sélectionnez bien H4 en utilisant le μManager GUI ( "contrôle de XYZ: Allez bien: H4").
    2. Utilisation de l'μManager GUI, sélectionnez les filtres (Excitation 434/17 nm, dichroïque, émission 482/25 nm) pour l' imagerie mTqFP.
    3. Utilisez la fonction Recherche de MaxPoint sur toute la gamme de la boîte de délai rapide et ensuite ajuster la boîte de retard grossier de sorte que le profil complet de décroissance est dans la plage de retard de la boîte de délai rapide.
    4. Définissez le délaiau point d'intensité maximale en changeant le «contrôle de FLIM: boîte de délai rapide: réglage de retard actuel (ps)". Réglez les paramètres d'acquisition (de densité neutre, le temps d'exposition) de sorte que la CCD ne soit pas saturé.
    5. Définir les étapes de retard de 25 ps sur la gamme complète des retards ( "de contrôle FLIM: boîte de délai rapide: Peupler retards).
    6. Acquérir des données de colorant de référence en appuyant sur "image snap FLIM".
    7. Acquérir une image de la caméra CCD deuxième de fond en bloquant le laser d'excitation (voir 2.11.7)
13. Acquérir des données FLIM de l'échantillon de plaque multipuits en utilisant le logiciel d'acquisition μManager:
    1. Set qui les puits doivent être imagés et le nombre de FOV à acquérir par puits ( "HCA Setup acquisition séquencée: positions XYZ»).
    2. sélectionner manuellement un FOV de modèle contenant l'échantillon à imager. Utilisez ce FOV pour déterminer le filtre de densité neutre optimale, largeur de grille au GOI ettemps d'intégration de la caméra de manière à atteindre 75% de la plage dynamique de la caméra CCD.
    3. Régler autofocus ( "contrôle de XYZ: Autofocus»): Appuyez sur "commande de mise au point de retour seulement», puis se concentrer manuellement sur les cellules ou structure d'intérêt. Set "Autofocus plage de recherche" à 2000 pm et appuyez sur "Entrée". Appuyez sur "AF maintenant" pour lancer une procédure de mise au point automatique. Une valeur de décalage sera affiché dans le champ "FocusOffset (Autofocus)".
    4. Entrez la valeur de décalage obtenue en 2.13.3 en «AF offset» et répétez la procédure de mise au point automatique à deux reprises ( "AF maintenant") pour vérifier que la valeur de décalage est maintenant à zéro, ce qui indique le bon fonctionnement du système de mise au point automatique.
    5. Utilisez la fonction "AutoGate" dans le logiciel d'acquisition OpenFLIM-HCA pour choisir un échantillonnage logarithmique des points de retard. Alternativement, ils peuvent être sélectionnés manuellement, voir les référencesrence 36 pour plus de détails.
    6. Set "Accumulez Frames" à une valeur que les rendements souhaités temps total d'acquisition de données. L'augmentation du nombre d'images accumulées augmente le rapport signal sur bruit des données FLIM au détriment de augmente également le temps total d'acquisition de données de FLIM.
    7. Exécutez l'acquisition de FLIM de la plaque multipuits en appuyant sur le bouton "Démarrer séquence HCA".
14. Acquérir une autre image de fond de CCD de la caméra en bloquant le laser d'excitation (voir 2.11.7) avec des paramètres d'acquisition identiques que ceux utilisés pour l'acquisition de données FLIM.

3. openFLIM-HCA analyse des données utilisant FLIMfit

1. Vérifiez que les fichiers auxiliaires nécessaires pour l' analyse de données FLIM sont présents (ie, l' IRF et la mesure du colorant de référence).
2. Chargez les données du puits vide (H1), le milieu de culture contenant bien (H2) et les puits contenant des cellules non marquées dans un milieu de culture (H3) dans FLIMfit( "Fichier: données FLIM Load") pour vérifier s'il y a des contributions de fond supérieur à 1% du signal provenant des cellules exprimant «donneur-seulement», à savoir, dans les puits A1-G3.
3. Préparer un fond (TVB) fichier variant dans le temps en chargeant le moyen bien avec la culture dans FLIMfit ( "Fichier: données FLIM Load"). Chargez les données caméra de fond acquises à l' article 2.14 ( «Contexte: Charge de fond") et utiliser l'option FLIMfit "Outils: Créer TVB Intensity carte" pour générer la TVB. Voir la référence 31 pour plus de détails sur la TVB.
4. Préparer le variant spatialement IRF Maj Carte en chargeant les données IRF acquises à l'article 2.11 et de soustraire l'arrière-plan de la caméra CCD acquise dans la section 2.11.7. Utilisez l'option FLIMfit "Outils: Créer IRF Maj carte" pour calculer la variation de l' espace IRF Maj Carte. Voir la référence [31] pour plus de détails sur la IRF Maj Carte.
5. Monter un monoexponentiel décroissance aux données de colorants de référence acquises à la section 2.12. Colorant de charge de référence et la carte IRF variant spatialement calculé à la section 3.4, paramètres d' ajustement fixés ( "Durée de vie: No. Exp: 1") avec t ₀ set comme un paramètre ajusté ( "Durée de vie: FIT IRF Shift: Aménagée"). La valeur de t ₀ obtenue est ensuite rapportée dans le tableau figurant à l'onglet "Paramètres".
6. Analyser les données FLIM en chargeant les données de FLIM expérimentales acquises dans la section 2.13, la variation spatiale IRF Carte calculée dans la section 3.4, l'arrière - plan de la caméra acquise dans la section 2.14, le fichier TVB préparé dans la section 3.3 et tapez la valeur négative de t ₀ obtenue dans la section 3.5 ( "IRF: IRF changement: t _0"). Montez ensuite les données expérimentales au modèle de décroissance souhaitée à l' aide FLIMfit ³⁶ selon les exigences de l'expérience.

Results

Pour illustrer les capacités de l'instrumentation openFLIM-HCA, nous présentons trois applications de FRET exemplaires. La première concerne FRET constructions qui sont adaptées à partir de constructions de modèles FRET développés par le laboratoire de Stephen Vogel ^38. Ils comportent une série de constructions génétiquement fluorescentes exprimables dans lequel une protéine fluorescente donneuse (mTurquoise) est lié à un fluorophore accepteur (Vénus) par des longueurs courtes contrôlées de 5, 17 et 32 ​​acides aminés (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Les différentes longueurs de liaison entre donneur et accepteur fluorophores conduisent à des rendements différents de FRET et donc différentes durées de vie des donateurs. Pour fournir un contrôle négatif, la Vénus dans le court 5-amino lieur d'acide construction est remplacé par Amber - une mutation non-fluorescente YFP (mTq5A) qui ne peut pas agir comme un accepteur FRET ^38. Nous avons remplacé Cerulean dans les vecteurs pCXV et PC5A originaux par restriction à digérer l'vecteurs avec des enzymes Nhel et BglII et des fragments de mTurquoise ligaturant digérés en utilisant les mêmes enzymes à partir du vecteur pmTurquoise-N1. La région de liaison a été modifiées par cette substitution.

La figure 6 présente un FLIM exemple FRET essai utilisant ce système modèle exprimé dans des cellules Cos, dans lequel une plaque multipuits est revêtit avec 3 colonnes chacune des cellules transfectées avec le témoin négatif (colonnes 1-3), l'agent de liaison d'acide 5-amino FRET construire (colonnes 4-6), l'agent de liaison d'acide 17-amino FRET construction (colonnes 7-9) et l'agent de liaison de 32 acides aminés construction FRET (colonnes 10-12). Row H contient des puits pour TVB estimation. Figure 6 (a) montre des exemples de fluorescence acquis automatiquement des images de durée de vie des champs typiques de vue dans chaque puits. Il est évident que le témoin négatif (colonnes 1-3) présentent des durées de vie plus longues, et que la durée de vie du donneur est la plus faible pour la construction FRET avec le plus court segment de liaison lenGTH (colonnes 4-6). La figure 6 (b) montre comment la durée de vie moyenne moyennée sur l' ensemble des champs de vision de chaque puits varie à travers la plaque multipuits. Les figures 6 (c) et (d) montrent des cartes à vie de l' intensité fusionnée exemplaires fluorescence des donateurs pour un FOV de mTq5A et mTq17V respectivement. Figure 6 (e) montre la fluorescence du donneur profil de décroissance de l' intensité moyenne de toutes les cellules imagées dans le puits A1, ainsi que l'ajustement à un modèle de décroissance monoexponentielle et l'IRF (qui est dominé par la largeur de grille GOI). La figure 6 (f) présente la durée de vie de fluorescence moyenne pour chaque colonne de la plaque multi - puits obtenu à partir d' un ajustement monoexponentielle pixellique. Une table de la durée de vie moyenne et écart - type (STD) peut être trouvé dans le tableau 1 ci - dessous. L'acquisition de données pour les images montrées à la figure 6 a pris environ 160 min à acquérir. L'analyse a 92 s sur un ordinateur de 2,6 GHz avec 10 cœurs et 64 GB de RAM.

Le deuxième essai exemplaire démontre l'application de FLIM FRET pour lire l'oligomérisation du VIH-1 Gag lors de l'assemblage de virions VIH-1 comme un moyen de tester les inhibiteurs de ce processus ^25,42. Exprimant Gag VIH-1 dans des cellules hôtes appropriées, fournit un système de modèle pour ce stade du cycle de vie du VIH-1 car elle conduit à la formation de particules virales (VLP) qui sont semblables aux immatures virions VIH-1. Pour ce test, nous avons exprimé le VIH-1 protéine Gag fusionné avec la PCP dans les cellules HeLa et comparé l'action de différents inhibiteurs via leur impact sur le signal de FRET qui a résulté de l'oligomérisation Gag. Les détails des inhibiteurs utilisés sont fournis en référence 42.

Les détails de la préparation des échantillons et les mesures expérimentales sont décrites en détail dans la référence 25, où nous avons démontré que nous pouvions utiliser FLIM pour lire boe heteroFRET entre l'agrégation des protéines Gag marquées stochastiquement avec CFP et YFP, et aussi homoFRET dans les cellules exprimant seulement Gag marquée avec PCP. Bien que homoFRET ne présente généralement pas un changement dans la durée de vie du donneur, il le fait pour le cas particulier de la PCP où le fluorophore existe en deux isomères avec différentes durées de vie de fluorescence moyenne ^40,41. La PCP homo-FRET lecture présente les avantages de la préparation d'échantillons simplifiée par rapport à CFP / YFP hétéro-FRET et est plus efficace du spectre, ce qui pourrait être important pour les lectures de FRET multiplexés.

Nos travaux antérieurs appliqué FLIM FRET pour doser l'oligomérisation Gag en présence d'un N-myristoyltransférase (NMT) inhibiteur ^42. Cet inhibiteur perturbe les enzymes endogènes responsables de l'addition de l' acide myristique à Gag, ce qui permet protéines Gag de se lier à la membrane plasmique et ⁴³ est une condition préalable à la formation de virions VIH ouVLP. Nous avons montré que les deux lectures heteroFRET et homoFRET pourraient réaliser Z '> 0,6 dans les études de dose-réponse avec un inhibiteur NMT. Z 'est un paramètre utilisé dans l'industrie pharmaceutique pour indiquer la qualité d'un dosage et représente les différences entre les valeurs moyennes des contrôles positifs et négatifs et de leurs écarts relatifs à générer une métrique unique valeur de qualité du dosage - avec Z'> 0,5 être considéré comme "excellent" pour un dosage pharmaceutique ^44. Nous notons que cette excellente performance a été réalisée avec des échantillons pour lesquels le changement de la durée de vie du donneur moyen était de l'ordre de 300 ps - démontrer la puissance statistique de l'analyse des données de FLIM pour un grand nombre de cellules, ce qui permet des lectures utiles à réaliser en utilisant beaucoup moins des changements dans la durée de vie de la fluorescence est possible avec les nombres typiques de cellules imagées dans des expériences de microscopie manuelles.

Ici, nous présentons une plaque multipuits FLIM FRET fixés comparant 4 composés inhibiteurs du VIH Gag oligomérisation (désigné ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16) données. Pour cette expérience, nous avons utilisé la lecture de homoFRET avec des cellules HeLa transfectées transitoirement avec le plasmide Gag-CFP. Un total de neuf doses différentes de chaque inhibiteur ont été appliquées suivant le protocole standard décrit en référence 32, permettant à deux puits de répétition par condition. Comme témoin positif, la colonne 1 présente les cellules exprimant Gag-myr, une protéine gag muté dépourvu du fragment d'acide myristique qui ne peut pas former des VLP et ainsi simuler une inhibition totale. Un contrôle négatif a été fourni par les cellules de dosage exprimant Gag-CFP seulement avec juste le véhicule utilisé pour livrer les inhibiteurs dans les autres colonnes (colonne 11). Un total de huit FOV ont été acquises par puits.

Les données ont été équipé d'un seul modèle de décroissance exponentielle sur une base pixel par pixel et la durée de vie de fluorescence plate carte montrant la durée de vie moyenne par puits (sur tous les pixels au- dessus du seuil d'intensité dans les huit domaines de la vue) est illustré ci - dessous dans la figure 7 (a). La figure 7 (b) montre la courbe de vie de fluorescence correspondante en fonction de la concentration en inhibiteur. Trois des inhibiteurs montrent un effet inhibiteur (ICL13, ICL15 & ICL16) lors d'une incubation avec des cellules exprimant Gag-PCP. Un inhibiteur (ICL14) montre aucun effet à aucune dose testée. Le Z 'calculé pour cette plaque était de 0,51. Les valeurs obtenues pour les contrôles positifs et négatifs sont représentés sur la figure 7 (b) que les points en noir à 100 pM et 0,1 nM.

Les courbes de dose - réponse pour ICL13, et ICL15 ICL16 représentés sur la figure 7 (b) ont ensuite été montés sur le modèle de régression non linéaire logistique à 4 paramètres avec le coefficient de Hill fixé à 1 ⁴⁵ avec la durée de vie maximale et minimale fixée à lavaleurs obtenues à partir de la (colonne 1) positive et négative (colonne 11) commande respectivement. Les retournés IC ₅₀ pour les trois courbes étaient alors: 38 nM, 24 nM et 116 nM pour ICL13, ICL15 et ICL16 respectivement. A titre de comparaison avec les valeurs de _CI50 obtenues par FLIM intracellulaire FRET mesures, nous avons déterminé IC ₅₀ pour l' inhibition de l' activité enzymatique de NMT1 humaine recombinante dans notre test enzymatique biochimique précédemment ^42. Les trois composés trouvés à être actifs par FLIM FRET sont aussi les plus actifs dans cet essai (IC ₅₀ de 17 nM, 51 nM et 39 nM pour ICL13, ICL15 et ICL16, respectivement), avec ICL14, qui n'a montré aucune réponse significative dans l'essai FLIM FRET, étant ca. 100 fois moins actif contre NMT1 _(CI50 de 1700 nM). Pour les composés actifs, les IC ₅₀ valeurs obtenues grâce à ces modalités d'essai indépendants sont remarquablement similaires, avec des variations mineures probablement attribuables à differences dans l'absorption ou le métabolisme du composé dans les cellules.

Cette petite étude met en évidence la capacité du HCA FLIM pour discriminer l'activité des différents composés qui agissent sur la même cible d'intérêt. Nous croyons qu'il est la première démonstration d'un écran à l'aide FLIM automatisée dans un contexte à haute teneur pour générer de multiples courbes de réponse de dose et illustre le potentiel pour FLIM à appliquer à l'écran et / ou caractériser des composés thérapeutiques utiles.

La troisième expérience FLIM FRET exemple concerne un biocapteur FRET génétiquement pour exprimer une protéine d'échange activée par l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc (EPAC)), qui est un facteur d'échange de guanine Rap-1 qui se lie spécifiquement à l'AMPc. Ce biocapteur EPAC FRET (EPAC-S ^H188) utilise mTurquoise2 protéine fluorescente (mTq2FP) comme fluorophore donneur et intègre deux Venus-FP pour mettre en œuvre une coopérationmposite accepteur ^46. AMPc est un second messager omniprésent et est impliqué dans une multitude de processus intracellulaires dans de nombreux organismes différents. Elle est synthétisée par l'adénylcyclase de la conversion de l'ATP à la membrane cellulaire. Ici, nous démontrons notre capacité à lire et à quantifier son activité dans des cellules HEK293T vivantes suite à l'ajout de forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase qui régule à la hausse la production d'AMPc intracellulaire et augmente donc sa concentration cytoplasmique. Ce capteur est soumis à EPAC FRET dans son (non liée) et son état inactivé donneur vie augmente avec la concentration de l'AMPc en tant que AMPc conduit à l'ouverture du biocapteur. Le profil de décroissance mono-exponentielle de mTq2FP rend ce biocapteur mieux adapté pour l' analyse quantitative de la durée de vie de biocapteurs basés sur la PCP ^45. La figure 8 montre un exemple d'un cours de temps enregistré en utilisant la plaque multipuits FLIM microscope automatisé où nous avons tracé le changementà durée de vie moyenne et la variation de la fraction de la population des donneurs FRETing au fil du temps après l'addition de 100 uM de forskoline. Pour plus de simplicité, nous supposons que le signal total peut être décrit par un mélange de FRETing monoexponentielle et les donateurs non-FRETing et la fraction de la population du biocapteur EPAC FRET activé a été obtenu en ajustant un profil de décroissance exponentielle à double face de la série chronologique.

Pour l'acquisition de données d'AMPc (EPAC) cinq retards de grille, avec une largeur de 4.000 ps de grille, ont été choisis avec le temps de retard fixé à 1.300 ps, ​​4300 ps (intensité maximale), 4919 ps, 6656 ps, 8035 ps, 1, 0391 ps et 16.000 ps. Le temps d'intégration de la caméra pour chaque retard est de 250 ms. À un bien, nous avons acquis un temps bien sûr FLIM avec des images acquises toutes les 10 s de plus de 10 min. Les points de données acquises parfois 120 s et 130 s ont été supprimés, car l'ajout de forskoline a causé un petit changement dans la position focale de l'échantillon et à cet effete de l'intensité de fluorescence enregistrée au cours de l'acquisition FLIM à ces points de temps.

Pour l'analyse de données les images ont été chargées dans FLIMfit et segmentés par cellule. Les données de fluorescence à vie a été monté sur un modèle de décroissance exponentielle à double utilisant un IRF et un t ₀ valeur fixe obtenue à partir d' un colorant de référence (75 uM coumarine 6). La fluorescence du donneur en moyenne sur la durée de vie moyenne de toutes les cellules est représenté sur la figure 8 (a). Figure 8 (b) montre la variation de FRETing fraction de la population au fil du temps calculée en ajustant les mêmes données FLIM sur le même modèle de décroissance exponentielle double

où β est la fraction donneur FRETing. Nous supposons un mélange de FRETing et eleme non FRETingnts pour les points de temps avant l'addition de forskoline. Pour obtenir ces vies, un ajustement exponentielle double a été appliquée sur les trois premiers points de temps donnant des durées de vie de τ ₁ = 3,964 ± 21 ps pour le donneur non-FRETing et τ ₂ = 3,022 ± 27 ps pour le donneur FRETing. Ceux - ci ont été fixés pour l'ajustement ultérieur de l'ensemble pour obtenir les valeurs de ß à chaque point de temps ensemble des données.

En résumé, nous avons présenté les résultats de HCA FLIM exemplaires pour trois échantillons expérimentaux. La première était une plaque de 96 puits revêtus avec des cellules Cos exprimant FRET constructions comprenant un donneur mTqFP lié soit à un accepteur Venus FP ou un non-fluorescent orange construire par des longueurs de peptide lieur variable. La variation de l'efficacité de FRET et par conséquent la durée de vie du donneur avec une longueur de groupe de liaison est clairement apparente et l'écart-type de la durée de vie moyenne pour chaque construction a été inférieure à 36 ps. Le deuxième exemplaire assay avait un «écran» de quatre inhibiteurs potentiels pour la myristoylation de la protéine Gag du VIH pour lesquels le% d'inhibition a été calculé à partir de la variation de la moyenne durée de vie de fluorescence du donneur avec la concentration d'inhibiteur mesurée dans les cellules HeLa exprimant la protéine Gag marquée avec PCP. Cette lecture est basée sur homoFRET, qui ne présenterait pas habituellement un changement dans la durée de vie des bailleurs de fonds, mais le fait pour CFP parce que cela existe dans plusieurs isomères avec différentes durées de vie fluorescentes. Cela peut être utile en termes d'efficacité spectrale, par exemple, pour multiplexer différents affichages FRET ^25. Le troisième essai exemplaire était un cours de temps à surveiller les cellules HEK293T vivantes exprimant le biocapteur AMPc FRET, EPAC. Cela a montré la réponse attendue suite à un traitement avec de la forskoline et l'application de FLIMfit utilisant un modèle double de décroissance exponentielle avec le nombre de photons détectés étant proportionnel à l' imagerie des cellules vivantes - comme nous l' avons montré précédemment avec le Biosen LIBRA FRETsor pour IP3 ^47.

Figure 1. Schéma du grand champ FLIM temps-dépendants en utilisant un intensificateur d' image optique fermée (GOI). Côté gauche, montre un schéma du système expérimental. En haut à droite, schématique d'impulsion d'excitation, la position des images en temps-dépendants et ajustement monoexponentielle aux données. En bas à droite, bande dessinée montrant la décroissance de la fluorescence des deux objets représentés dans le système expérimental. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Schéma du grand champ openFLIM-HCA en utilisant un intensificateur d' image optique fermée (GOI). Voir le texte pour une description plus détaillée de lacomposants du système. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Schéma de optiquement sectionnée openFLIM-HCA en utilisant un intensificateur d' image optique fermée (GOI) avec une unité de scanner de disque Nipkow. Voir le texte pour une description plus détaillée des composants du système. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Schéma du flux de données d'image à partir programme d'acquisition de Manager pour Omero serveur ou le disque de l' ordinateur et en FLIMfit pour analyse. Le flux de données démarre en haut l coin auche où les données d'image brutes sont acquises dans le logiciel d'acquisition μ-Manager. Les éléments à l'intérieur de la zone en pointillés représentent les étapes de l'analyse des données de FLIM, tandis que ceux de l'extérieur correspondent à l'acquisition et le stockage des données. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Capture d'écran de l' interface utilisateur FLIMfit. En haut à gauche, la liste des champs de vision actuellement chargé et de l'image d'intensité de fluorescence du champ sélectionné de vue. En bas à gauche, sélection de modèle approprié et les conditions de montage. En haut à droite, la fluorescence décroissance pour la région actuelle des intérêts (cercles bleus), l'ajustement aux données (ligne rouge), IRF (ligne pointillée rouge) avec des résidus d'ajustement ci-dessous (ligne bleue).g5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Multiwell plaque FLIM du modèle FRET construit mTq5V, mTq17V, mTq32V exprimé dans les cellules Cos. (A) exemplaires images fluorescence à vie de FOV dans chaque puits pour différentes constructions de FRET exprimées dans les cellules Cos comme indiqué dans le texte. (B) la carte thermique de moyenne durée de vie de fluorescence Vénus en moyenne sur toutes les cellules dans chaque puits. (C) l' image d'intensité de mTurquoise Ambre recouvert de vie carte (barre d'échelle de 20 um). (D) l' image d'intensité de mTurquoise Vénus (17 acide aminé) recouvert de vie carte (barre d'échelle de 20 um). (E) le profil de décroissance de l' intensité mesurée (cercles bleus) de mTq5A construire (contrôle négatif) fluorescence moyenne sur toutes les cellules imagées dans le puits A1, ainsi que l'ajustement des données à une décroissance monoexponentielle (bleu trait plein) et IRF (ligne orange pointillée). (F) graphique de la durée de vie moyenne en moyenne sur chaque colonne à travers la plaque à cavités multiples, avec des barres d'erreur indiquant l'écart - type de vie de fluorescence entre les champs de vue. Pour (ad) les valeurs de durée de vie sont représentés en utilisant une échelle de fausses couleurs avec les limites indiquées dans picosecondes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. multipuits écran plaque FLIM Exemplar d'inhibiteurs Gag en utilisant des cellules HeLa exprimant Gag-PCP. (A) la carte thermique de moyenne durée de vie de fluorescence du donneur par puits pour plaque multipuits revêtit avec colonne 1 cellules présentant transfectées avec myr-Gag-CFP comme un positiv contrôle électronique pour l'inhibition, la colonne 11 présentant des cellules transfectées avec Gag-PCP exposé au véhicule seul, et les carrés colorés en pointillés indiquant les puits qui ont été dosés avec l'un des quatre différents inhibiteurs à des concentrations allant de colonne de dose élevée de 2 à colonne à faible dose 10 . l'échelle de couleur fausse représente la durée de vie de fluorescence moyenne allant de 2,200 ps à 3,100 ps. (B) des parcelles de vie de fluorescence pour chaque inhibiteur avec des barres d'erreur montrant l'écart type entre les puits de répétition. Points en noir à 2 et -4 sur l'axe horizontal sont les points de contrôle positifs et négatifs obtenus respectivement des colonnes 1 et 11 respectivement. Les lignes pleines indiquent un ajustement aux données de courbe de dose-réponse pour les différents inhibiteurs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 8. Utilisation Exemplar de FLIM pour lire le biocapteur EPAC FRET dans une mesure time-lapse en utilisant des cellules HEK293T. Changement de (a) fluorescence moyenne durée de vie et (b) fraction du FRETing donneur en fonction du temps après l' addition de forskoline indiqué par la barre verte. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard par cellule. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

	par puits	STD	SE TROMPER			par puits	STD	SE TROMPER
mT5A	4008	32	12		MT17V	3004	26	dix
mT5V	2717	35	13		mT32V	3133	30	11

Tableau 1. durée de vie moyenne et écart - type (STD) des constructions de FRET.

Discussion

Nous avons décrit un microscope à plaque multipuits automatisé conçu pour HCA en utilisant FLIM temps-dépendants. Cet instrument est contrôlé en utilisant un logiciel open source écrit en μManager avec la possibilité d'enregistrer les données sur un serveur OMERO et l'analyse des données de FLIM entrepris en utilisant FLIMfit ^36, un programme open source écrit en MatLab et disponible en tant que client OMERO ³² L'instrument μManager logiciel de contrôle, openFLIM-HCA, est disponible en ligne ³³ avec une liste des composants du système ⁴⁸ pour permettre aux chercheurs universitaires de construire leurs propres instruments FLIM HCA.

Afin d'acquérir des données de FLIM robustes, il est nécessaire d'optimiser les paramètres d'acquisition GOI et CCD et de tenir compte de toutes les variations de t _0. Comme décrit dans 3.8.2, le réglage de gain et une caméra CCD temps d'intégration GOI devrait être réglé pour atteindre ~ 75% de la gamme dynamique de CCD. Uchanter plus élevés tensions GOI et plusieurs accumulations de cadre CCD à chaque retard de porte de temps augmente le rapport signal sur bruit ⁴⁹ mais cela augmente le temps d'acquisition de FLIM totale (depuis moins de photons de fluorescence sont acquises par trame avant les sature de la caméra CCD et donc le nombre d'accumulations de cadre devrait être augmenté) et donc ce compromis devrait être décidée pour chaque expérience. L'étalonnage du générateur de retard dépend de la fréquence de répétition du laser et il est donc nécessaire de faire en sorte que le fichier d'étalonnage correct pour la vitesse de répétition utilisée est chargée dans le logiciel d'acquisition. La procédure de calibrage de la boîte de retard peut être trouvé sur le wiki openFLIM-HCA ^33.

Si l'autofluorescence cellulaire est faible par rapport au signal de fluorescence, nous utilisons le signal d'un juste milieu de culture contenant bien de fournir le contexte variant dans le temps (TVB). Pour réduire au minimum la fluorescence de fond à partir du milieu de culture cellulaire, on évitedes milieux contenant du rouge de phénol. Si l'auto-fluorescence cellulaire est importante, la TVB peut être dérivée de mesures des cellules non marquées. Cependant, dans ce cas, il faut prendre soin, car cela suppose que l'arrière-plan d'autofluorescence est le même pour chaque pixel de l'image. Cette hypothèse ne sera pas valide si le autofluorescence varie considérablement d'une cellule ou si le faisceau d'excitation ou de la sensibilité de détection est pas uniforme sur le champ de vision.

L'acquisition d'une image en utilisant IRF dispersés impulsions de lumière d'excitation fournit le profil IRF temporelle qui est convolution avec le modèle de données dans le processus de montage et prévoit également une carte de la variation spatiale de l'IRF à travers le champ de vision. FRI peut être mesurée par imagerie d'un échantillon de la dispersion telle qu'une suspension colloïdale, bien que, dans notre instrument, en utilisant une lumière d'excitation diffusée à partir du disque de Nipkow fournit une mesure propre de l'IRF. La détermination précise du moment of l'IRF est important parce que les erreurs dans le délai entre l'excitation et le temps de déclenchement peuvent avoir un impact significatif du processus d'ajustement, en particulier lors du montage à des modèles complexes de décroissance exponentielle. L'IRF a acquis en utilisant la lumière d'excitation diffusée est pas exactement ce qui est nécessaire pour le processus d'ajustement, car il est enregistré à la longueur d'onde d'excitation plutôt que la longueur d'onde d'émission de fluorescence, ce qui peut affecter son timing, bien que la variation spatiale de l'IRF doit être le même aux deux longueurs d'onde. En outre, l'IRF dispersée peut être déplacé globalement en temps par rapport à la véritable IRF en raison d'une longueur de trajet optique différente de l'objet de diffusion, comme cela est le cas pour un IRF acquis à partir du disque Nipkow en FLIM optiquement sectionnée. Cette correction, t _0, ce qui est le décalage temporel global nécessaire qui devrait être appliqué à l'IRF dispersés de lumière d'excitation acquise, est calculée à partir des données de colorant de référence monoexponentielles comme indiqué dans Protocol étape 4.4. Les colorants suivants peuvent être utilisés pour différentes longueurs d' onde d'excitation: une coumarine 153 solution à 75 uM dans du methanol (4,3 ns τ ~ ⁵⁰⁾ peut être utilisé pour l' excitation dans la gamme de 295-442 nm; une 6 solution à 75 uM coumarine dans l' éthanol (2,43 ~ T pour ns ³⁷⁾ peuvent être utilisés pour l' excitation dans la gamme 430-500 nm; et une solution à 75 uM de rhodamine B dans l' eau (τ ~ 1,7 ns ³⁷⁾ peut être utilisé pour l' excitation dans la gamme 488-575 nm. Nous notons que, bien qu'il soit possible de FLIMfit utiliser un autre IRF pour chaque pixel du système, généralement , il est raisonnable de faire l'hypothèse que l'IRF variant spatialement a le même profil temporel pour chaque pixel de l'image , mais présente une gamme des décalages temporels variant spatialement par rapport à la t globale _0. Nous décrivons ce que la carte de décalage IRF, qui est déterminée à partir de l'IRF de la lumière diffusée. Ensemble, le profil IRF, t ₀ et la carte IRF de décalage sont utilisés pour enen sorte que chaque pixel dans le champ de vision est équipée d'un IRF approprié. Surtout, t ₀ peut varier lentement au fil du temps de sorte qu'il doit être mesurée avant toute acquisition de données FLIM.

L'utilisateur doit décider comment échantillonner profils de désintégration des fluorescence et est nécessaire pour définir la largeur des temps-portes et leurs retards relatifs après excitation. D'une manière générale, il est souhaitable d'utiliser des grandes largeurs de grille afin de maximiser le signal détecté et typiquement on utiliser des largeurs de grille fixées à 4 ns pour FLIM de cellules marquées aux protéines fluorescentes. Le nombre de temps à grille des retards devrait être suffisant pour échantillonner le profil fluorescent de décroissance (y compris une porte fixé pour mesurer le signal juste avant l'impulsion d'excitation) compte tenu de la complexité de l'ajustement du modèle qui sera utilisé dans l'analyse. La valeur optimale peut dépendre de la durée de vie et les amplitudes relatives des composants de désintégration. En général, 4 portes sont suffisantes pour monoexponentielle raccord désintègre alors 7 ou plusieurs portes peuventêtre utilisé pour d'autres modèles de désintégration complexes.

Nous notons que FLIM peut être implémentée en utilisant une gamme de techniques dans le domaine temporel ou dans le domaine fréquentiel et automatisé HCA FLIM de réseaux de plaques multipuits a été mis en œuvre d' abord dans un (non-tronçonnage) grand champ microscope en utilisant des lectures domaine fréquentiel à vie de FRET ^51. La première optique tronçonnage FLIM lecteur de plaques multipuits automatisé pour HCA utilisant grand champ time-gated imagerie ²⁸ a ensuite été signalé. Par la suite, à grand champ (non-tronçonnage) domaine fréquentiel FLIM HCA a été appliqué à l' écran pour modifications post traductionnelles (tyrosine phosphorylation) à travers une banque de gènes en utilisant FRET ⁵² et le temps-gated FLIM HCA a été appliqué à FRET tests de HIV-1 Gag ⁵³ oligomérisation et de sumoylation de FOXM1 ⁵⁴ et Raichu RhoA et Rac1 biocapteurs ^33. Il est également possible d'utiliser TCSPC pour multipuits plaque FLIM ²⁶ mais à ce jour il est apparu difficile de faire correspondre til débit de techniques exploitant la détection à grand champ. Une approche émergente qui pourrait résoudre ce problème est l'utilisation de tableaux de simples détecteurs de comptage de photons tels que des tableaux de SPAD ^55.

Nous notons que les lectures de FRET utilisant des protéines fluorescentes doivent être traités avec prudence et que les valeurs absolues des paramètres obtenus à partir de FLIMfit ou tout autre logiciel d'analyse FLIM dépendra des hypothèses associées à l'ajustement du modèle. Par exemple, lorsque le donneur de FRET a une deuxième composante importante de décroissance, l'utilisation d'un modèle biexponentielle pour ajuster les données FRET FLIM peut entraîner la contribution de la composante décroissance plus rapide, généralement associé à la population FRETing apparaissant plus élevée qu'elle ne le devrait. Il est donc souhaitable d'utiliser des donneurs avec une durée de vie mono-exponentielle telle que mTq2FP. Même alors, des études récentes ont montré que l'analyse FRET peut encore être affectée par les états sombres de protéines de fluorescence de l'accepteur ou parhétérogénéité du facteur d'orientation κ ² en raison d'une distribution de conformations fluorophores avec une variété d'angles et les distances chromophores ^56. Néanmoins, nous et d'autres ont montré que la durée de vie de fluorescence des lectures de FRET produisent des résultats utiles qui sont en corrélation avec les mesures biochimiques et peuvent être utilisés pour dépister les interactions entre protéines ou de suivre la dynamique de biocapteurs. Ainsi , cette plate - forme HCA openFLIM peut être appliqué à une large gamme de dosages basés sur la durée de vie de fluorescence, FRET utilisant l' autofluorescence cellulaire ou ^8, ainsi que fournir des lectures quantitatives des sondes à base de colorants ^25.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cadre de microscope	Olympus	IX81	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
autofocus optique	Olympus	ZDC	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
platine de microscope motorisée (x-y-z)	Marzhauser	00-24-565-0000	Platine avec source laser d’excitation contrôlée
	Corvus Fianium	SC400-4	Intensificateur optique supercontinuum laser
http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/	Kentech	High Rate Imager (HRI)
Kentech		---	See Générateur de retard agile et caméra à générateur de retard de précision
	Hamamatsu	ORCA-ER-II
Nipkow scanner unit  ;	Yokogawa	CSU-X1  ;	http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Diffuseur chapeau	Thorlabs	ED1-S20-MD	Diffuseurs d’ingénierie
mTq5V  ;	Oxford Genetics	P3850	mConstruction Vénus turquoise avec linker 5 acides aminés
mTq17V	Oxford Genetics	P3847	mConstruction Vénus turquoise avec linker 17 acides aminés
mTq32V	Oxford Genetics	P3848	mConstruction Vénus turquoise avec linker 32 acides aminés
mTq5A	Oxford Genetics	P3849	mConstruction Turquoise Amber
HEK293T	---		---type de cellule utilisé
sans rouge de phénol HBSS	Sigma Aldrich	55021C-1000ML	milieu d’imagerie
de culture			DMEM + 10 % FBS + 0,5 % Antibiotiques
DMEM	Sigma Aldrich	D6046-500ML	pour milieu de culture
FBS	Sigma Aldrich	12003C-500ML	pour milieu de culture
xTremeGene9	Sigma Aldrich	6.37E+09	pour la transfection, suivre le protocole en ligne de La Roche
trypsine/EDTA Solution	Thermo Fischer	R001100	pour le détachement des cellules, suivre le protocole en ligne de Thermo Fischer