Storskala Rekonstruksjoner og Independent, Upartiske Clustering Basert på Morfologiske Metrics å klassifisere nevroner i Selektive populasjoner
Summary
Denne protokollen beskriver store rekonstruksjoner av selektive nevronale populasjoner, merket følgende retrograd infeksjon med en modifisert rabies virus uttrykker fluorescerende markører, og uavhengig, upartisk klyngeanalyser som muliggjør omfattende karakterisering av morfologiske beregninger blant forskjellige nevrale underklasser.
Abstract
Denne protokollen beskriver store rekonstruksjoner av nerveceller kombinert med anvendelse av uavhengige og objektiv clustering analyser for å skape en omfattende undersøkelse av de morfologiske egenskaper ble observert blant en selektiv neuronal populasjon. Kombinasjon av disse teknikker utgjør en ny fremgangsmåte for innsamling og analyse av data nevroanatomi. Sammen utgjør disse teknikkene gjør det mulig i stor skala, og derfor mer omfattende, prøvetaking av selektive nevronale populasjoner og etablere objektive kvantitative metoder for å beskrive morfologisk unike nerve klasser innen en populasjon.
Protokollen skisserer bruk av modifiserte rabiesvirus til selektivt å merke neuroner. G-slettet rabies virus fungerer som en retrograd tracer følgende stereotaxic injeksjon i et mål hjernens struktur av interesse, og fungerer som et redskap for levering og uttrykk for EGFP i nerveceller. Et stort antall nerveceller blir infisert ved hjelp av denneteknikk og uttrykke GFP gjennom sine dendritter, produsere "Golgi-lignende" komplette fyllinger av enkelte nerveceller. Følgelig forbedrer virus-mediert retrograd tracing metoden på tradisjonelle fargestoffbaserte retrograd følgeteknikk ved å produsere komplette intracellulære fyll.
Individuelle godt isolerte neuroner som strekker seg over alle områder av hjernen område som undersøkes blir valgt for rekonstruksjon for å oppnå en representativ prøve av nerveceller. Protokollen skisserer prosedyrer for å rekonstruere celle organer og full dendrittiske arborization mønstre av merket nevroner som strekker seg over flere vevssnitt. Morfologiske data, inkludert stillinger hver nervecelle i hjernen struktur, er hentet for videre analyse. Standard programmeringsfunksjoner ble brukt til å utføre selvstendig klynge analyser og klase vurderinger basert på morfologiske beregninger. For å verifisere nytten av disse analysene, statistisk evaluering av en klyngeanalyse gjengivelseRMED på 160 nevroner rekonstruert i thalamic reticular kjernen i thalamus (TRN) av macaque ape ble gjort. Både den opprinnelige klyngeanalyse og statistisk evaluering som utføres her tyder på at TRN nevroner er delt inn i tre subpopulasjoner, hver med unike morfologiske egenskaper.
Introduction
Nevroanatomi er en av grunnlaget for nevrovitenskap 1 og nyere interesse "connectomics" har fornyet entusiasme for å forstå den morfologiske mangfoldet av nevronale populasjoner og sammenhenger mellom spesifikke nevroner 2. Metoder for merking og gjenreise nevroner har kraftig forbedret med nyvinninger, inkludert genetisk og virus-mediert krets tracing nærmer tre, fire, slik at mer omfattende morfologiske undersøkelser av neuronpopulasjoner 5. I tillegg til forbedringer i merking enkelte nerveceller har kvantitativ dataanalyse teknikker også dukket opp som gjør det mulig uavhengig og objektiv klassifisering av nevroner i forskjellige subpopulasjoner basert på morfologiske data 5, 6. Disse objektive teknikker er en forbedring på mer tradil kvalitative klassifiseringsmetoder som har vært standard i feltet for over et århundre. Målet med denne studien er å skissere, trinn-for-trinn, er kombinasjonen av virus-mediert merking av nevroner i en selektiv befolkning, store rekonstruksjoner av et omfattende utvalg av disse nevronene, og kvantitativ dataanalyse basert på uavhengig gruppering med statistisk evaluering. Ved å kombinere disse metodene, skissere vi en ny tilnærming mot innsamling og analyse av nevroanatomi data til rette omfattende prøvetaking og objektiv klassifisering av morfologisk unike nerve typer innenfor en selektiv nevronale befolkningen.
Som et eksempel på disse metoder vil vi beskrive vår analyse av en stor populasjon av neuroner i løpet av en enkelt sektor av thalamiske retikulære kjernen (TRN) av makakerape. Disse dataene er fra en tidligere studie 7. Metoder for selektiv merking TRN nevroner projisere til rygg Lateral geniculate kjernen i thalamus (dLGN) ved hjelp av kirurgisk injeksjon av modifiserte rabies virus koding EGFP 4, 8 (se tabell over spesifikke materialer / utstyr, rad 2) er skissert. Denne modifiserte rabies virus mangler genet som koder for en essensiell kappeproteinet, noe som eliminerer trans-synaptiske bevegelse av viruset. Når viruset kommer inn axon terminaler på injeksjonsstedet, fungerer den som en tradisjonell retrograd tracer med den viktige fordelen av å kjøre EGFP uttrykk gjennom hele dendrittiske arborization av infiserte nevroner 5, 9, 10. Følgelig kan dette G-slettet rabies virus brukes til å selektivt infisere og merke noen nevronale befolkningen etter injeksjon, og retrograd transport.
For å utføre en omfattende analyse av en bestemt neuronal populasjon, er det viktig å ta prøver fraen bred distribusjon av nevroner i befolkningen. På grunn av at virus-mediert merkingsteknikk frembringer fullstendig intracellulære ", Golgi-lignende" fyller mange neuroner med aksoner på viruset injeksjonsstedet, er det mulig å rekonstruere et meget stort utvalg av neuroner innenfor det fulle omfang av en hjernestrukturer. I tillegg, fordi den modifiserte rabiesvirus er så effektiv til å infisere og merking av et stort antall neuroner, er det mulig å rekonstruere hundrevis av nerveceller pr dyr. Prosedyrer for prøvetaking 160 neuroner i hele den visuelle delen av TRN 11 for å generere en fullstendig prøve av dLGN-utstikk TRN neuroner er skissert. Prosessen med å rekonstruere individuelle nevroner ved hjelp av et nevron rekonstruksjon system som omfatter et mikroskop, kamera, og rekonstruksjon programvare er beskrevet. Også beskrevet er metoder for å bestemme posisjonene til de enkelte neuroner i løpet av en hjernestruktur (i dette tilfellet innenfor TRN) og for å kontrollere viruset injeksjon site volum og plassering innenfor en struktur (i dette tilfellet i dLGN) ved hjelp av volumetriske kontur rekonstruksjoner. Trinnene for å eksportere morfologiske data og utføre selvstendig klynge analyser basert på morfologiske beregninger målt for hver nervecelle er skissert. Det er begrensninger for clustering metoder, og det finnes også en rekke forskjellige clustering algoritmer tilgjengelig. Følgelig er disse alternativer og fordelene ved noen av de mer vanlige algoritmer beskrevet. Klyngeanalyse gir ikke statistisk verifisering av det unike i klynger. Derfor er flere trinn skissert for å bekrefte optimal clustering samt forholdet mellom morfologiske data innenfor og på tvers klynger. Statistiske metoder for å vurdere klynger for TRN datasettet for å bekrefte at TRN nevroner er gruppert i tre unike klynger basert på 10 uavhengige morfologiske beregninger er beskrevet.
Dermed ved å skissere fremgangsmåten for selektiv merking, Rekonstruere, og analyse av morfologiske data fra en spesifikk neuronal populasjon, beskriver vi fremgangsmåter for kvantifisering av morfologiske forskjeller mellom neuronene innenfor en befolkning. Tidligere funn av forskjellige nevronale typer innen den visuelle delen av makakerape TRN er bekreftet med separate statistiske evalueringsmetoder. Sammen håper vi disse teknikkene vil være bredt gjeldende for nevroanatomi datasett og bidra til å etablere kvantitative klassifisering av mangfoldet i neuronpopulasjoner gjennom hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nevroanatomi studier har vært en pilar i nevrovitenskap og nyere interesse connectomics og struktur-funksjon relasjoner har fornyet entusiasme for detaljert morfologisk karakterisering av selektive nevronale populasjoner. Tradisjonelt har nevroanatomi studier støttet seg på kvalitative klassifiseringer av nerveceller i morfologisk forskjellige klasser av nerveceller som er definert av ekspert neuroanatomists. Med fremskritt innen teknikker for å rekonstruere nevroner og utpakking morfologiske data, er det nå mulig …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke legene. Ed Callaway og Marty Usrey for å tillate oss å bruke vev utarbeidet som en del av en tidligere studie og Libby Fairless og Shiyuan Liu for hjelp med nevronale rekonstruksjoner. Dette arbeidet ble finansiert av NIH (NEI: EY018683) og Whitehall Foundation.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y. . Histologie du systeme nerveaux de l’homme et des vertebres. , (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family?. Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
