Summary
Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.
Abstract
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) tamamen kardiyomiyositlerde (hiPSC-CMS), endotel hücreleri (hiPSC-EC), ve düz kas hücreleri (SMC'lere) içine hiPSCs ayrıştırılması için uygulamadan önce, özel hücre tipleri, fakat geleneksel protokolleri ayırt edilmelidir genellikle düşük verim, saflık ve / veya zayıf fenotipik stabilitesi ile sınırlıdır. Burada, yeni hiPSC CMS, -ECs üretilmesi için protokoller ve -SMCs esas itibarıyla geleneksel yöntemlere göre daha verimli, hem de uygulama alanı üzerine oluşturulan bir sitokin içerikli bir flaster ile hücre enjeksiyonu birleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Yama uzun bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard sıkılmış olan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, enjekte edilen hücrelerin tutma hem de arttırır. miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının domuz modelinde olarak bütünleşme oranı daha yüksek, iki kat daha fazla olduğunuHücreler hücreleri ve yama hem sitokin içeren yama olmadan hücrelere kıyasla yama ve tedavi ile uygulanmıştır, fakat tek başına hücreleri ile, kalp fonksiyonu ve infarkt önemli iyileşmeler ile ilişkilidir.
Introduction
onlar hastanın bağışıklık sistemi tarafından reddedilmesi olmayan hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız aralığı ve miktar içine ayırt edilebilir, çünkü insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) rejeneratif hücre tedavisi için en umut verici ajanlar arasında yer almaktadır. (SMC'lere Bununla birlikte, kendi kendine replikasyon ve farklılaşması için kendi kapasitesi, tümör oluşumuna neden olabilir ve bunun sonucunda, hiPSCs tamamen bu kardiyomiyositlerde (CMS), endotel hücreleri (EC), ve düz kas hücreleri gibi özel hücre tipleri, ayırt edilmesi gereken ), uygulamadan önce. Hücre yönetiminin en basit ve en yaygın yöntemlerden biri direkt intramiyokardiyal enjeksiyon, ancak yerli miyokard dokusu ile aşılanan nakledilen hücrelerin sayısı son derece azdır. Bu yıpratma çok iskemik doku sitotoksik ortamına bağlanabilir; Ancak, fare embriyonik kök hücreler (EKH) iken yaralanmamış kalplerin, myokarddan içine doğrudan enjekte ouygulanan hücrelerin önemli bir bölümünün onlar esnasında üretilen yüksek basınçlar tarafından iğne izi aracılığıyla sıkılmış, belki de yönetim sitesine çıkıldı düşündürmektedir 3-5 saat 1 için tutuldu teslim 5 milyon hücre nly ~ 40% miyokard kasılma.
Burada, hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde (hiPSC CMS) 2, endotel hücrelerinin (hiPSC-EC) 3 ve düz kas hücreleri (SMC'lere) 4 oluşturmak için yeni ve büyük ölçüde daha etkili yöntemler sunar. Özellikle, bu hiPSC-SMC protokol ağırlıklı sentetik veya kontraktil SMC fenotip doğru hücreleri yönlendirerek somatik DKH'lerde 5 gözlenen morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin geniş taklit etmek ilk. Ayrıca, bir sitokin içeren fibrin s oluşturarak enjekte edilen hücrelerin melezleşmesi hızını artırır, hücre dağıtım için bir yöntem sağlarEnjeksiyon sitesi üzerinden atch. Yama, en az üç günlük bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard çıkan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, her iki hücre tutmanın geliştirilmesi görünmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deney prosedürleri Birmingham Alabama Üniversitesi Hayvan Rehberine uygun olarak yapılmaktadır.
1. hiPSC-CM'ler içine hiPSCs Farklılaşan
- Kaplayın, gece boyunca 4 ° C'de önceden soğutulmuş büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ile 6 delikli bir plakanın deliklerine. Kullanmadan önce, jelatinimsi protein karışımı aspire. % 5 CO2 ve 10 uM ROCK inhibitörü ile 37 ° C mTeSR1 orta ek hücreleri (oyuk başına 1 x 10 5 hücre) önceden kaplanmış plakalar üzerine hiPSCs tohum, ve kültür.
- Hücreler% 90 izdiham ulaşana kadar her gün orta yenile; Daha sonra,% 5 CO2 ve 37 ° C'de iki gün süre ile ortam (0.5 mg, jelatinimsi Protein 6-çukurlu plaka başına karışımı, oyuk başına 2 ml'lik ortam) ve kültür hücreleri büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ekleyin.
- orta değiştirmek için, yavaşça vakum yoluyla petri ile gelen orta dışarı emmekdışarı hücrelerin dokunmadan, ve bir transfer pipet kullanarak yeni orta ekleyin.
- ile desteklenmiş RPMI1640 ortam maddesi ile ortamının değiştirilmesiyle farklılık başlatın insülin olmadan jelatinimsi protein karışımı, B27 Büyüme faktörü indirgenmiş ve 100 ng / ml Aktivin A; Kültür% 5 CO2 ve 24 saat boyunca 37 ° C'de hücre.
- , RPMI1640 insülin olmayan B27 ile takviye edilmiş ortam, 10 ng / ml olan kemik morfojenik protein 4 (BMP-4), ve 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile orta yerine Kültür% 5 CO2 ve 96 saat boyunca 37 ° C'de hücre.
- B27 ile takviye edilmiş RPMI1640 ortam maddesi ile orta takın ve% 5 CO2 ve 37 ° C 'de kültür hücreleri devam etmektedir; her 3 günde bir orta yenileyin.
- farklılaşma başlatarak 3 gün sonra ~ mikroskop altında hücrelerin yakalanma kümeleri gözlemleyin. ~ 7 gün ilk kasılmaları gözlemledikten sonra kümeleri toplayın ve Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi yıkayın.
- hafifçe çalkalanarak 37 ° C'de 10 dakika süreyle 100 U / ml kolajenaz IV ihtiva eden Hanks tamponu içerisinde onları kuluçka plaka kümelenmiş-hücreleri ayırmak; Daha sonra, 5 dakika boyunca etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.25 tripsin ekleyin.
- RPMI / B27 ortamında% 10 fetal bovin serumu ile enzim çözeltisi nötralize ve RPMI / B27 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- hemasitometre hücrelerinin sayısını. Kültür olmayan kardiyomiyosit hücreler kültür kaplarına yüzeyine yapışır sağlayacak% 5 CO2 ve en az 3 saat 37 ° C'de en az 10 cm yemekleri hücreleri.
- HiPSC-CMS içeren hücre süspansiyonu, toplamak ve jelatinli protein karışımı -kaplı yüzeye kültürleme yoluyla (10 cm çanak başına 6 ila 10 x 1 civarında hücreleri) hücreleri korumak.
2. hiPSC-EC içine hiPSCs Farklılaşan
- th inkübe edilerek tek hücre içine hiPSC popülasyonu ayrıştırmaları% 5 CO2 ve 5 dakika için 37 ° C 'de maddesi kenetleme em. Taze mTeSR1 ortamı içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın.
- 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 10 uM ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş ortam içinde mTeSR1 tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre yoğunluğu belirlemek.
- 24 oyuklu plakanın bir oyuğuna 20 NIH birim / ml trombin çözeltisi 250 ul ekle.
- 12.5 mg / ml fibrinojen çözeltisi 250 ul 1 x 10 6 hiPSCs ekleyin. Ve trombin yüklü de hücre-ihtiva eden fibrinojen çözeltisi 250 ul ilave edin. Karışım dakika içinde bir hiPSC içeren fibrin iskele oluşturacak şekilde katılaşmaya gözlemleyin.
- cam kapak forseps ile bir 6-yuvalı plaka oyuklarına katılaştırılmış hücre içeren iskele aktarın ve insülin olmadan% 2 B27 ile takviye 2 mi EBM2 ortamında iskeleleri kültürlenmesiyle farklılaşma başlatılması, aktivin-A (50 ng / mi) çözündürüldü, ve BMP-4, 24 saat için (25 ng / ml),% 5 CO de
- nazikçe hücreleri dokunmadan vakum yoluyla eski orta emerek orta değiştirin. İnsülin olmadan B27 ile takviye edilmiş yeni EBM2 orta, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF, 50 ng / ml), eritropoietin (EPO, 100 ng / ml), ve transforme edici büyüme faktörü ß1 (TGFβ1, 10 ng / ml) ve kültür ekleme % 5 iskeleleri CO2 ve 48 saat boyunca 37 ° C.
- Orta ve kültür% 5 CO2 ve başka bir 48 saat süre ile 37 ° C 'de iskeleleri yenile; Daha sonra, orta 200 U kollajenaz IV (100 U / ml) eklenerek iskele hücreleri bırakın.
- Sonra yayımlanmış hücreleri aşağı doğru döndürün. B27, VEGF-A (50 ng / ml) ve SB-431542 (10 uM)% 2 ile takviye edilmiş 2 mi EGM2-OG ortamı orta yerine; iki günde orta yenileyin.
- 100 U / ml kolajenaz IV hücreleri ayırmak yaklaşık 10 gün sonra (~ farklılaşma başlatıldıktan sonra 14. günde, yani, h) izoleAkış sitometrisi ile farklılaşmış hücre popülasyonundan iPSC-EC AT özel markör proteinlerin ekspresyonu için analiz (örneğin, CD31, CD144) 3.
- Kurulmuş bir protokole 3 yoluyla izole hiPSC-ECS genişletin.
3. hiPSC-SMC'ler içine hiPSCs Farklılaşan
- Jelatinimsi protein karışımı ile kaplanmış plakalar üzerine hiPSCs tohum, kültür mTeSR1 ortamı içinde hücreler,% 5 CO2 ve 37 ° C'de, gün ortam değişiklikleri ile, birbirine karışana kadar (yaklaşık 2 gün).
- 3 gün RPMI1640 ortam maddesi ve% 2 B27 artı insülin CHIR99021 (5 uM) ve BMP-4 (10 ng / ml) ile hücreleri kültürleyerek mezodermal soyundan hücreler içine farklılaşmasını başlatın.
- Ağırlıklı sentetik fenotip hiPSC-SMC'ler üretmek için:
- Kültür, VEGF-A (25 ng / ml), RPMI1640 me fibroblast büyüme faktörü p (FGFβ, 5 ng / ml) ile hücrelerin dium ve% 2 B27 eksi insülin,% 5 CO2 ve 4 gün boyunca 37 ° C.
- Kültür, VEGF-A, hücreler (25 ng / ml), FGFβ% 5 CO2 ve 37 ° C'de RPMI-1640 ortamı içinde (5 ng / ml) ve% 2 B27 artı insülin 2 gün ° C.
- Kültür trombosit türevli büyüme faktörü p (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ% 5 CO2 ve 37 ° RPMI1640 (3 ng / ml) ve% 2 B27 artı insülin hücreler 4 gün boyunca ° C.
- Ağırlıklı kasılma fenotip hiPSC-SMC'ler üretmek için:
- Kültür 4 RPMI1640 VEGF-A ile günde (25 ng / ml) ve FGFβ (5 ng / ml) ve% 2 B27 eksi insülin hücreleri.
- Kültür RPMI1640 ve% 2 B27 artı insülin PDGFβ (5 ng / ml) ve TGFβ (2.5 ng / ml) ile 7 gün hücreler.
- ~ 6 gün RPMI1640 metabolik ortam içeren laktat (4 mM) içinde kültürlenmesi ile son hiPSC-SMC popülasyonları arındırın.
- Isı Zeytin yağı bir su banyosu içinde 45 ° C arasındadır.
- Isı 50 ° C'ye% 10 jelatin çözeltisi 5 mi.
- zeytin yağı, karışmaya jelatin ekleyin ve bir su banyosu buz ilave edilerek 5 ° C'ye kadar hızlı bir şekilde soğutulur.
- Yirmi beş dakika sonra, mikro küre oluşumunu uyarmak için, zeytin yağı soğutulmuş (4 ° C) aseton ilave edin.
- 5 de sıcaklığını muhafaza 1 saat boyunca ° C; daha sonra, zeytin yağı çıkarmak için önceden soğutulmuş asetonla onları 5 kez yıkayın, mikro küreler toplamak ve 4 ° C'de kurumaya izin verin.
- çapraz bağlama uyarılması için gece boyunca 4 ° C 'de% 70 etanol ve% 0.25 glutaraldehid çözeltisi içinde küreler tekrar süspansiyon ve daha sonra 100 mM glisin Karışımı nötralize.
- Saat 30 dakika boyunca 5 ug IGF ve% 0.1 sığır serum albümini ihtiva eden 2 O damıtılmış 15 ul 5 mg mikro-küreler karıştırılarak mikrosferler olarak yüklenebilir IGF.
5. Hücre Yaralanma Sitesi üzerinde yama oluşturma ve enjekte
- 1 ml Minimum Essential Medium (MEM) birlikte hiPSC kaynaklı SMC'lere (1 milyon dolar) CMS (2 milyon), ve ECS (1 milyon dolar) Askıya.
- 1 mi fibrinojen çözeltisi (25 mg / ml) içinde mikro-5 mg süspanse edin.
- Hücre-içeren çözelti, fibrinojen / mikro küre çözeltisi ile bir şırınga ve trombin çözeltisinin 1 ml'si ile üçüncü bir şırınga ile bir şırınga doldurun (80 NIH birim / mi, 2 ul 400 mM CaCl2, 200 mM ε-aminokaproik ile desteklenmiş asit).
- Cerrahi 2 daha önce açıklandığı gibi inen koroner arter sol ön ligasyonu yoluyla domuz kalbinde miyokard enfarktüsü neden olur.
NOT: Kısa, dişi Yorkshire domuz olarak (~ 13 kg, yaş 45 gün) Telazol / Xylazine (4.4 mg / kg) kas içi enjeksiyon ile sedasyon edilir ve izofluran (% 0.5-5) ile genel anestezi altında entübe. Bir 4. IntercOstal torakotomi ve maruz kaldığı inen koroner arter anterior bırakılır. koroner arter 60 dakika boyunca bağlanması ile tıkanır ve daha sonra bağ kaldırılır. Hemen elektriksel defibrilasyon ventriküler fibrilasyon durumunda gerçekleştirilir. - domuz kalplerin infarkt bölgenin epikarda bir steril plastik halka (~ 2.5 cm) yerleştirin ve sonra aynı anda ringe kürecik / fibrinojen ve trombin çözümleri enjekte edin.
- Karışım (~ 30 sn) kuvvetlendirmek için izin ve sonra hücrelerin infarkt miyokard içine katılaşmış karışımın içinden hücre içeren şırınga iğne takın ve enjekte. 3-0 ya da 2-0 monocryl sütür hayvan boyutuna bağlı olarak kas katmanları, deri altı dokusu ve göğüs duvarı kapatın. Buprenorfin 0.01-0.02 mg / kg kas içi enjeksiyon her 8 saatte bir ameliyat sonrası ilk 3 gün ağrıyı kontrol etmek için kullanılır.
- kardiyak manyetik rezonans kardiyak fonksiyonu değerlendirmekcerrahi işlem, bir hafta ve cerrahi işlem 2, 3, 4 sonraki dört hafta önce görüntüleme (MRG). Son MRG çalışmalarından sonra, hayvan kurban ve histoloji ve moleküler analiz 2, 3, 4 için kalpleri işlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklılaştırılmış hiPSC-CM'ler, -ECs ve -SMCs karakterizasyonu
HiPSCs ayırıcı kapasitesi, 4, 2 3 değerlendirildi. Sitometri son hiPSC-CM nüfusun saflık% 90 (Şekil 1A, 1B, panel B1) aşabilir düşündürmektedir kardiyak troponin T (cTnT) ifade analizleri Akış. Hemen hemen bütün hücre yavaş miyozin ağır zincir (Şekil 1B, panel A1) ifade α-sarkomerik aktin (Şekil 1B, panel A2) yaklaşık% 25 miyosin hafif zinciri 2V izoformunu (MLC2v) ifade ederken (Şekil 1B, panel sadece ventriküler CM'ler 4 bulundu B2). HiPSC-EC farklılaşma protokolünün etkinliği (yani, CD31 yüzdesi + hücreler) substantia olduLly yüksek PCBC16iPS hücreleri ile kulpları hattan hiPSCs (% 45.6, Şekil 1C, panel C2) daha (% 31.3, Şekil 1C, panel D2) ile yapıldığında; >% 95 saflıkta popülasyonları CD31 ifadesi için seçim ile elde edilmiştir, ve seçilen hücre>% 90 kadar 4 hafta içinde CD31 ve CD144 ifade etmeye devam kültürlendiğinde B27 ile desteklenmiş (FBS'siz) EGM2-OG ortam içinde, VEGF, ve SB431542 (Şekil 1D) 3. Saflaştırılmış hiPSC-SMC'lerin fazla% 94 düz kas aktin (SMA) ifade fakat sentetik hiPSC-SMC'lere kollajen 1, konneksin 43 veya vimentin (Şekil 1E) ifade etmek kontraktil hiPSC-SMC'ler daha fazlaydı. HiPSC-SMC'lerin göç ve çoğalması yeteneği 4 değerlendirildi. Sentetik hiPSC-DKH'leri aynı zamanda kasılma hiPSC-SMC'ler daha göçmen ve proliferatif idi (Şekil 1F, paneller i ve ii) kasılma SMC'lere daha güçlü sözleşmeli iken benn, karbakol tedaviye yanıt (Şekil 1F, panel, III, IV ve V).
Jelatin Mikrokürelerinin gelen büyüme faktörü Yayın
Kültürlenmiş hücre içermeyen yamalar ortamdaki IGF-1 seviyeleri, ELISA ölçümleri büyüme faktörü, en az 3 gün boyunca (Şekil 2A) 2 bir süre boyunca mikro-serbest olduğunu göstermiştir. analizleri 5 ug IGF-1, IGF-ihtiva eden mikro küreciklerin 5 mg yükleme yapılmıştır. Bir yama 1 mi fibrinojen çözeltisi ve 1 mi trombin ile mikro-küreler karıştırılmasıyla elde edilmiştir. Yama 2 mi MEM içinde kültürlenmiştir. Orta bir ml toplanmış ve taze MEM 1 ml her gün (Şekil 2B) ile değiştirilmiştir. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu.
IR-yaralanma Modelinden Gözlemler
2 bir domuz modelinde araştırılmıştır. 6.000.000 hiPSC CMS, -ECs ve -SMCs (her bir hücre tipi 2.000.000) toplam yaralı miyokardiyal doku içine doğrudan enjekte edildi. HÜCRE grubundaki hayvanlar aynı hücre dozda fakat yama olmayan tedavi edilirken cep + düzeltme grubundaki hayvanlar için, bir yama fibrin ve oluşan IGF-1 içeren bir mikro-küreler, enjeksiyondan önce yaralanma yerinde üzerinde oluşturulmuştur; Her iki tedavi MI grubundaki hayvanlardan tevkif edildi. Dört hafta yaralanması ve tedaviden sonra, cep + yama grubundaki hayvanlara verilen hücrelerin% 9 HÜCRE grubundaki hayvanlara uygulanabilir hücrelerin sadece% 4 ile karşılaştırıldığında, muhafaza ve uygulama bölgesinde hayatta devam edilmiştir (Şekil Şekil 3A). Tek başına hücreler ile hücre ve yama, ancak her ikisi ile tedavi, olduğu da Associkalp fonksiyonu ve infarkt (Şekil 3B) ölçümlerinde önemli gelişmelerle ated.
Şekil 1: kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücrelerine hiPSCs farklılaşması. Kardiyomiyosit farklılaşma ve hiPSC-CM'ler saflığı farklı kardiyak belirteçler (B) flow sitometri (A) ve histoloji ile değerlendirildi. HiPSC endotel farklılaşma akış sitometrisi (C) tespit edilmiştir. HiPSC-EC endotel fenotipinin bakımı akış sitometrisi (D) ile saflaştırmadan sonra 2, 3 ve 4 hafta CD31 ve CD144 ekspresyonunu analiz ile tayin edilmiştir. HiPSC düz kas hücre farklılaşması, çeşitli belirteçler (E) ile ölçülmüştür. Ve göç ve çoğalması potansiyelihiPSCs türetilen kontraktil düz kas hücreleri genel sentetik yumuşak kas hücreleri (F) değerlendirildi. Çekirdekler immünofloresan boyama DAPI ile zıt. (B) ve 200 um (E ve F) = 100 um Ölçek çubuğu. Sentetik hiPSC-SMC'lerin göç ve çoğalması özelliği (F paneli i ve ii) değerlendirildi. Ve karbakol tedavisine yanıt olarak kontraktil SMC'lerinin kasılması (F, panel III-V) değerlendirildi. * P <0.05, kasılma hiPSC-SMC'ler vs sentetik hiPSC-SMC'lere. A ve B, Ye L, et al modifiye edilmiştir. 2. C ve D Zhang S, et al modifiye edilmiştir. 3.. E ve F Yang L, et al modifiye edilmiştir. 4. Veriler ortalama (SEM) ortalama ± standart hata olarak verildi. İki grup arasında karşılaştırılması Student T testi ile değerlendirildi ve çoklu gruplar arasında karşılaştırma tek yönlü ANOVA yoluyla değerlendirildi. p <0.05 özellikleri önemli olarak kabul edildican. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: mikro-büyüme faktörleri serbest bırakılması. IGF-ihtiva eden mikro-küreler sentezlendi (A). Bu, (B) sentezlenmiştir sonra mikro-IGF-1 serbest 1, 3, 5 ve 7 gün sonra ölçüldü. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Panel A, Ye L., ve ark değiştirildi. 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: hiPSC türevli trilineage Cel hücre tedavisinin etkinliğinin değerlendirilmesils. Üç hücre popülasyonu genel engrafman oranı 4 hafta hücre nakli (A) sonra değerlendirildi. Kardiyak (ejeksiyon fraksiyonu ile gösterildiği gibi) işlevi ve enfarktüs boyutu hücre nakli (B) sonra 1 ve 4 hafta kardiyak MR ile incelendi. * MI karşı p <0.05; #p <Patch karşı 0.05. A ve B, Ye L., ve ark modifiye edilmiştir. 2. Veri ortalama ± SEM olarak sunuldu. gruplar arasında karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ile anlamlılık açısmdan analiz edildi. p <0.05 anlamlı kabul edildi. ANOVA aracılığıyla kadar önemli tanımlanan Sonuçları Tukey düzeltmesi ile tekrar analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSC-CM'ler gelişmiş Verim / Saflık
CM'ler içine insan kök hücreleri farklılaştırarak için geleneksel protokoller genellikle düşük verim ve saflık ile sınırlıdır; Örneğin, hESC CM'ler sadece 35-66% yavaş miyozin ağır zincir ya da cTnT 6 dile Percoll ayrılması ve kardiyak vücut oluşumu yoluyla elde edilmiştir. Ayırt hiPSC-CM popülasyonlarının saflığı esasen promotere işlevsel olarak bağlanmış olan bir raportör geninin sentezlenmesi için seçilerek arttırılabilir bir CM-özgü protein 7, 8, 9, ancak bu teknik gerekli genetik olarak tadil edilmiş kullanımını gerektirir özellikle klinik araştırmalar için, daha az tercih edilirler hücreleri. Burada sunulan protokol ile, hiPSC-CM'ler% 68'i cTnT ifade ve saflık sonradan genetik manipülasyon ya da tek olmadan mikro diseksiyon ve preplating via>% 90 arttıcell seçim. toplam verim de başına ~ 3-5000000 hiPSC-CM'ler oldu.
hiPSC-EC Geliştirilmiş Verim / Kararlılık
En sık kullanılan iki hiPSC-AT farklılaşma protokolleri murin stromal hücrelerin 10, 11 ve embriyonik gövde oluşumu 12, 13 ile birlikte kültür dayanmaktadır. Bununla birlikte, ko-kültür yöntemi murin soyundan hücreler ya da proteinler daha sonra 10 ve yalnızca ~% 15 veya embriyo gövde yöntemi EC fenotipi 10, 12, 13 varsayalım ile üretilen hücre daha az ksenojenik kirlenmesine neden olabilir. Burada sunulan hiPSC-EC farklılaşma protokol ksenojenik kontaminasyon riskini ortadan kaldırır ve en fazla olması (hiPSC hat kullanıldığı bağlı olarak) embriyonik organları kullanmak yöntemlere göre daha verimli 3-kat edebilirsiniz. FurthermCevher, CD31 ifadesi için seçim ile arıtıldıktan sonra, ~ hiPSC-EC% 90 hiPSC-EC, geleneksel farklılaşma protokolleri 12 yoluyla üretilen iki hafta ile karşılaştırıldığında, in vitro olarak, en az 4 hafta içinde AT fenotipi muhafaza.
hiPSC-SMC'lerin Fenotipik Özellikleri
Bir SMC fenotip (ya da SMC'lerin bir nüfus) belki de en iyi önemli morfoloji farklılıkları, işaretleyici ifade ve faaliyet yol açabilir ağırlıklı kasılma ve sentetik özellikleri arasında bir denge olarak tarif edilir. Bu nedenle, belirli bir uygulama için hiPSC-SMC'lerinin yardımcı oluşturulur hangi belirli bir fenotip bağlı olabilir. Burada sunulan hiPSC-SMC farklılaşma ve arıtma protokolleri sadece 2-3 hafta içinde ~% 95 saf ağırlıklı kontraktil veya sentetik SMC popülasyonları üreten ilk, ve prosedürler requ yok çünkü ksenojenik kontaminasyon riski minimumdurbesleyici hücrelerin kullanımı ire.
Nakledilen Hücrelerin Aşı Oranı Geliştirilmiş
Etkili bir hücre tedaviye başlıca engellerden biri, miyokard 14, 15, 16, 17 ile aşılanan tatbik hücrelerin çok az sayıda olduğu düşünülmektedir. Böyle IGF-1 gibi sitokinler daha iskemik dokuların 18, 19, 20 toksik mikro dayanacak şekilde hücrelerin sağlayarak engraftman artırabilir, ama kasılması sırasında uyarılan yüksek basınç iğne izi yoluyla ve periferik dolaşım içine hücreleri sıkmak olabilir. Bu nedenle, engraftman önemli ölçüde daha yüksek oranı Sam gözlemlenen oranından daha büyük 2 kat fazla olan bir IGF-1 içeren bir fibrin yama yoluyla hücreleri enjekte edilerek eldee hücre miktarı, yama olmaksızın verilmesi olasılığı epikardiyal boşluğa çıkartılmadan hücreleri engelleyen bir fiziksel bariyer meydana yama kendisi IGF-1 sitokoruyucu etkileri ve hem de atfedilebilir.
kritik Adımlar
HIPS hücre pluripotensini sağlamak için, önce, farklılaşma hiPSC hattının karyotipine kontrol pluripotense belirteçleri (Nanog, SSEA1 ve Oct4, ve diğ.) Ekspresyonunu belirlemek ve teratom oluşumu kabiliyetlerini teyit etmek için gerekli olan . HiPSC hatları 10'dan fazla nesiller geçişli edildiğinde onların pluripotensini yeniden kontrol etmek için önerilir. farklılaşmamış hiPSC durumu da doğru farklılaşması için çok önemlidir. farklılaşma başlanmadan önce hiPSC durumunu sağlamak için, tavsiye edilir: 1)) (en az iki haftalık taze ortamını kullanmak ve hiPSC differentiat başlamadan önce günlük orta yenilemekiyon; 2) enzimatik sindirim süresi (en az 5 dakika) azaltmak ve hafifçe yukarı pipet ve hücrelere aşağı hücrelere zarar görmemesi için; 3) bir yoğunlukta 6-çukurlu levha başına 1 x 10 5 hücre hücreleri replate; 4) Her zaman 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör hücreleri tutmak ve daha uzun 15 dakika süreyle inkübatör dışına hücreleri tutmaktan kaçının.
Tekniğin Sınırlamalar
Enjekte hiPSC türetilmiş kalp hücreleri ve yama yönetimini birleştirerek bizim yöntemin en önemli dezavantajı açık göğüs cerrahisi için bir gerekliliktir; böylece, bu yaklaşım eşzamanlı koroner revaskülarizasyon cerrahisi geçiren hastalar için olduğu gibi yardımcı tedavi dışında klinik uygulamalara doğrudan çevrilebilir olması pek mümkün değildir. Daha yaygın klinik kullanımı gibi erişebilir bir endoscope- ve kateter bazlı bir yaklaşım olarak pratik ve minimal invaziv teslim yöntemi geliştirilmesini gerektirirkarın ve diyafram ile kalp. Ayrıca, kardiyak hücre tedavisi ile ilişkili en kritik güvenlik kaygıları biri aritmojenik komplikasyonların gelişme ve maymunlar 1 milyar hESC elde edilen CM'ler intramiyokardiyal enjeksiyonları ile tedavi edildiğinde, hayvanların dört kendiliğinden aritmiler 21 geliştirmiştir. 10 milyon hiPSC türetilmiş CM'ler hücre dozu daha küçük 100 kat, belki de IR hasarı 2 ile domuzların kalplerine enjekte edildiğinde Ancak, aritmojenik komplikasyonlar hiçbir kanıt gözlendi.
Gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Bağışıklık tepkisinin muhtemelen düşük engrafman oranı için önemli bir rol oynar. CRISPR / Cas gen düzenleme sistemi nakavt (KO) büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) sınıf I ve sınıf II tarafından "evrensel donör" hiPSCs bir çizgi oluşturmak için araştırmacılar sağlayabilir. hiPSC MHC KO türetilmiş hücreler ve dokular olabilir Hengraftman önemli ölçüde daha yüksek oranları ave. teknikleri geliştirmek üzere, engraftman oranları artacaktır. artış greft boyutu belli bir noktada, büyük greft alıcı kalbin aritmojenitesinin artması beklenmektedir. greft ilişkili aritmojenitesinin azaltılması gen düzenleme teknolojisi ile GAP birleşme proteinleri ifade artışı ile hücreler kullanılarak elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
