Introduction
הריאות נמצאות בקשר רצוף עם הסביבה החיצונית ונחשפות מאוד לשני חלקיקים וחיידקים מזיקים עם היכולת לגרום למחלה. לכן, חשוב עבור מערכת החיסון לעלות תגובה חיסונית חזקה נגד פתוגנים פולשים, אך חשוב לא פחות לשמור על סובלנות לאנטיגנים בשאיפה כי אינו גורם למחלות. כדי לספק מעקב חיסוני חזק, מערכת הנשימה היא מצופית עם רשת של תאי מערכת חיסון, כוללים תאים דנדריטים (DCS). DCs הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן עם היכולת הייחודית להפעיל תאי T נאיביים. בריאות האדם, DCS תושב נתקלים אנטיגן ולאחר מכן תהליך ולהעביר אותה אל קשרי הלימפה לנקז-ריאה להגשה והפעלה של תאי T 1, 2, 3.
במערכת החיסון האנושית, DCS ניתן לחלק לכמה קבוצות משנה, עם distinct אבל פונקציות חופפות: CD1c + ו- CD141 + DCs מיאלואידית (MDCs) ו CD123 + DCs plasmacytoid (PDC) 4, 5. בעוד שרוב ידעתי מפורט על אדם DCs נובע ממחקרים בדם, עכשיו זה ברור כי ריאות אדם הנמל גם אוכלוסיות נדירות של תת DC עם קיבולת 6 גירוי תאי T, 7, 8, 9. עם זאת, הנתונים המצטברים מראים כי תאי חיסון, כולל DCS, נבדלים תדירות, פנוטיפ, ותפקודם בהתאם למיקום האנטומי שלהם 10. לכן, חשוב ללמוד תאים חיסוניים מן הרקמה הרלוונטית להבין תרומתם החסינה וסובלנות מקומיות. יחדיו, זה מדגיש את הצורך בלימוד DCS-תושב ריאות כאשר פונים מחלות ריאה, למרות DCs הדם להיות בקלות יותר זמין ונגיש בבני אדם.
המחקרים הראשונים שחקרו DCs תושב-ריאות בבני האדם הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה הביטוי של סמנים יחידים, כגון HLA-DR ו CD11c, בסעיפי רקמות באמצעות אימונוהיסטוכימיה 11, 12, 13. לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה יותר בדרך כלל יש לסמוך על תזרים cytometric מנתח ללמוד תת תא החיסון שונה. עם זאת, מאחר וקשה למצוא סמנו על פני קרום תא יחיד המזהה באופן ייחודי משנה DC ספציפי, ההגבלה הפוטנציאל של מחקרים החלימה רק בארבעת צבעים cytometry זרימה הוא הסיכון כולל אוכלוסיות תאים עם סמנים פנוטיפי דומים כמו DCs. לדוגמה, CD11c מתבטא בכל DCs מיאלואידית ואת הרוב המכריע של מונוציטים. מצד השני, במחקרי החלת לוחות cytometry זרימה מתקדמים יותר, רקמת ריאה שאינה סרטנית כריתות כירורגית של חולים בדרך כלל שמשהXref "> 10, 14, 15, 16, אם כי לא ברור אם האוכלוסיות הנדירות אלה הן מייצגים את חומר שבאמת נוכחי DCs בנבדקים בריאים. בסך הכל, מחקרים מוגבלים במידה רבה בשל העובדה כי בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר.
כדי להתגבר על כמה מגבלות אלו, עבודה זו מתארת כיצד לבצע ניתוח מפורט של הפריסה המרחבית וכן זיהוי פנוטיפי של DCs בביופסיות endobronchial הרירית המתקבל מתנדבים בריאים שעברו ברונכוסקופיה. ביופסיות קטנות אחדות ניתן לאסוף כל פרט ולאחר מכן יכולות להיות מוטבעת עבור חתך וניתוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה או מתעכלת enzymatically עבור ניתוח התזרים cytometric מתקדם. באמצעות רקמת הריאה בצורה של ביופסיות endobronchial המתקבל bronchoscopies מקנה יתרון של מה שהופך אותו ניתן לבצע את study על מתנדבים בריאים, בניגוד ניתוח פתוח של הריאות כי, מסיבות מובנות, הוא מוגבל לחולים הדורשים ניתוח חזה. יתר על כן, אותה הרקמה תדגם במהלך ברונכוסקופיה ממתנדבים בריאים נורמלית מבחינה פיזיולוגית, בניגוד אזור שאינו מושפע של רקמת ריאה בחולים עם מחלת ריאות. מצד השני, הביופסיות קטנות ומספר התאים להיאסף, גם כאשר איגום ביופסיות כמה, מגבילים את סוג הניתוחים שניתן לבצע.
בעוד העבודה הנוכחית מתמקדת DCS, השיטות שתוארו ניתן להרחיב ישירות לכלול אחרים (חיסוניים) תאים בעלי עניין הנמצאים ברקמת ריאה רירית אדם. יתר על כן, פרוטוקולים חלים גם ישירות דגימות שהתקבלו מחולים הסובלים ממחלות ריאות שבו ברונכוסקופיה היא חלק בהקמת האבחנה, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סרקואידוזיס, או סרטן ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מחקר זה אושר על ידי המועצה לביקורת האתית האזורית Umeå, שוודיה.
1. ברונכוסקופיה עבור דגימת Endobronchial ביופסיות מ בבני אדם
- קבלת הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
- פנקו את הנושאים עם midazolam הפה (4-8 מ"ג) ו glycopyrronium תוך ורידי (0.2-04 מ"ג) 30 דקות לפני ברונכוסקופיה. החל הרדמה מקומית עם לידוקאין הגרון הסמפונות. בואו מגרגרים הנושא עם ~ 3 מ"ל של לידוקאין 4% ולהחיל 3 מ"ל לבסיס הלשון לתוך הגרון באמצעות מזרק הגרון. מטב את ההרדמה המקומית עם 8-10 מנות של ספריי לידוקאין. ביצוע שלב זה עם הישיבה בנושא.
- הכנס ברונכוסקופ וידאו גמיש דרך הפה באמצעות שופר פלסטיק עם הנושא במצב שכיבה. השתמש קטטר ספריי מתוצרת בכוונה כדי להשלים את ההרדמה המקומית של קנה הנשימה הסמפונות דיסטלי באמצעות ברונכוסקופ. הנה, להשתמש במינון של כ5-10 מ"ל של 2% לידוקאין.
- קח 6-9 ביופסיות ברירית endobronchial מ קארינה הראשי לבין חטיבות סימפונות הראשיות באמצעות מלקחי fenestrated (איור 1). בעקבות ברונכוסקופיה ולפני שעזב את בית החולים, ולתת לשאר הנושא במשך 2-4 שעות ולספק לו / לה עם ארוחה קלה.
2. הטמעת ביופסיות ב גליקול Methylacrylate (GMA) שרף
הערה: פרוטוקול immunostaining GMA פותחה במקור באוניברסיטת סאות'המפטון, היסטוכימיה יחידת המחקר 17.
- קיבוע: אימונוהיסטוכימיה, להסיר את ביופסיות מן מלקחיים ומניחים אותם ישירות לתוך צלוחיות זכוכית המכיל 3 מ"ל של מעכבי פרוטאז ואצטון מיובש קר כקרח (פלואוריד phenylmethylsulfonyl (35 מ"ג / 100 מ"ל אצטון) ו iodoacetamide (370 מ"ג / 100 מ"ל אצטון )). לתקן את רקמת הלילה ב -20 ° C (איור 2).
הערה: השלבים הבאים יש performed במנדף עם כפפות ניטריל מתאימות. ערכת הטבעה מכיל רכיבים שעלולים לגרום לרגישות, גירוי, ו / או תגובה אלרגית בעור. כל הפסולת חייבת להיות מסולקת פסולת מסוכנת כמו. - התייבשות: הסר את אצטון עם מעכבים ולהחליף עם אצטון המיובש הטרי (ללא מעכבים) במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר אצטון ולהחליפה בנזואט מתיל במשך 15 דקות.
- הסתננות: כן פתרון עיבוד של פתרון בנזואט 5% מתיל מונומר methacrylate גליקול; 10 מיליליטר מספיק עבור בקבוקון אחד. באמצעות טפטפות פסטר מפלסטיק, שאיבה את הפתרון בנזואט מתיל ולהחליף עם 3 מ"ל של תמיסת עיבוד. דגירת ביופסיות פתרון עיבוד עודף על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות; טפטפות פסטר יכולה לשמש את כל שינויי הפתרון שלאחר מכן, כולל הטבעת פתרון.
- להחליף את פתרון עיבוד כל שעה 2 (3x 2 incubations hr), אז בפעם חדירה הכולל של ביוpsies בפתרון העיבוד הוא לפחות שעה 6. הכנס מדבקות נייר לתוך הקצה העליון של קפסולות הטבעה לזהות הביופסיות.
- הכן פתרון הטבעה של בנזואיל פרוקסיד 75 מ"ג ב 10 מ"ל של מונומר methacrylate גליקול. להוסיף 0.25 מ"ל של N, פולי N -dimethylaniline (אתילן אוקסיד) (מאיץ) לפתרון הטבעה כדי להתחיל את התגובה פילמור. הסר את פתרון העיבוד ומניח ביופסיה אחת לתוך הקפסולה ההטבעה הרלוונטי באמצעות מלקחיים.
- לאט למלא את הקפסולה ההטבעה לפסגה עם הטבעת פתרון ולסגור את המכסה. הימנע מפריע הביופסיה ויצירת בועות אוויר גדולות. דגירה הכמוסה ב 4 ° C. עד השרף יש polymerized לחלוטין.
- אחסן את הביופסיות המוטבעות ב -20 ° C בתוך שפופרת 50 מיליליטר המכילה כ 5 גרם של ג'ל סיליקה.
3. חתך של ביופסיות Endobronchial GMA-מוטבע
- ציפוי שקופיות מיקרוסקופ: שטפו את השקופיות למיקרוסקופמדיח כלים על מחזור רגיל. מכסים את השקופיות ולאפשר להם אוויר יבש.
- כן פתרון ציפוי של 10% פולי- L- ליזין (PLL) פתרון במים מזוקקים. להטביע את שקופיות פתרון ציפוי למשך 5 דקות, ולאחר מכן לתת להם להתייבש באוויר. אחסן שקופיות PLL מצופה יבש בקופסאות המקוריות שלהם.
- לשטוף רצועות זכוכית וכו 'עם 0.1% Tween 20 במים מזוקקים. יש לשטוף את הזכוכית עם 70% אתנול ו יבש עם מגבות נייר. חותך להבי זכוכית מרצועת הזכוכית באמצעות יצרנית סכין. אחסן את הלהבים במכל המונע תנועה על מנת להבטיח כי חוד החנית לא ולהינזק או פצע.
- ביופסית זמירה: מניח את הקפסולה ביופסית מפצל הקפסולה ולכרות כל צד באמצעות סכין חד קצה פחמן פלדה. סר ביופסית GMA-מוטבעת ולמקם אותו היטב סגן. חתוך עודף GMA מרחבי הביופסיה באמצעות להב הפלדה.
- חתך GMA.
- כן פתרון אמוניה 0.05% עם מים מזוקקים. מניח את סכין זכוכית ביופסיה ב הדואר microtome. בזהירות ליישר את בלוק הביופסיה עם הלהב ידי התאמת בעל סכין ואת הזווית של בלוק הביופסיה כך להב המוטלת שטוח נגד פני השטח של הבלוק.
- חותכים 2 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות microtome על מהירות חיתוך איטי להשתמש במלקחיים להעביר ולהציף חלקים על פני המים אמוניה. Float בסעיפים עבור 45-90 שניות, המאפשר אחזור אנטיגן עדין ופתיחה של הסעיף.
- תרים קטעים עם שקופיות מיקרוסקופ. בדוק את היסטולוגיה ביופסיה על ידי צביעה במהירות עם toluidine כחול.
- לייבש את השקופיות על סט צלחת חמה עד 50 מעלות צלזיוס וליישם 500 μl של כתם כחול toluidine מסוננים קטע בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק. מומלץ לחמם את החלק על הצלחת החמה עד טבעת ירוקה מתחילה להסתמן בקצה הכתם, ולאחר מכן לשטוף אותה עם מים.
- באמצעות מיקרוסקופ אור, לבדוק את היסטולוגיה ביופסיה. סעיפים המשמשים אימונוהיסטוכימיה יכילו אזורים טובים של lamina הניזוקpropria אפיתל, עם בלוטות מעטות ככל ואת שריר חלק כמה שפחות.
- כמו בסעיף 3.4.2, לחתוך קטעים שיש היסטולוגיה טוב לאסוף אותם עם שקופיות מיקרוסקופ PLL מצופה מכתים immunohistochemical. חותכים לפחות שני קטעים מתוך כל ביופסיה לניתוח. מגלשות יבשות לפחות שעה 1. לאחר ייבוש, ניתן לזהות קטעים עטופים בנייר כסף פח ומאוחסן ב -20 ° C עד 2 שבועות, או שהם יכולים להיות immunostained מייד.
4. מכתים immunohistochemical של ביופסיות Endobronchial GMA-מוטבע
הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל. הכן את הפתרון אזיד הנתרן 0.1% בתוך במנדף והרחק חומצות. לתקשר עם חומצות משחררות גזים רעילים.
- צייר את מיקומם של חלקים באמצעות עט יהלום שהקצה ולסדר את השקופיות על מתלה מכתימה.
- בצע בלוק Peroxidase. כן פתרון לחסום peroxidase של חמצן 0.3% מימן בתמיסה יזיד הנתרן 0.1%. Apply 1 מ"ל של גוש peroxidase סעיפים דגירה במשך 30 דקות.
- כן פתרון לשטוף של 0.05 מ 'טריס שנאגר מלוח (TBS), pH 7.6. שטפו את השקופיות TBS, 3x 5 דקות.
- כן פתרון לחסום BSA 1% ב DMEM. האם זה מראש בכמויות גדולות, aliquot ומקפיאים עד הצורך. מסננים את השקופיות ו דגירת מקטעי פתרון לחסום למשך 30 דקות כדי לחסום מחייב נוגדן ספציפי. אם מחייב נוקב עדיין מתרחש, כולל שלב דגירה 30 דקות עם גוש סרום 5% מאותו המין כמו נוגדנים משני.
- לדלל הנוגדן הראשוני (CD45 או CD1a) ב TBS לריכוז הרצוי (CD45 מדולל ב 1: 1,000; CD1a מדולל ב 1: 1,00) ולהחיל אותו על שקופיות. Coverslip בסעיפים ו דגירה לילה ב RT.
- לשטוף שקופיות ב TBS שלוש פעמים. לדלל נוגדנים משני biotinylated (מכוונת נגד הפונדקאי נוגדן ראשוני, ארנב במקרה זה אנטי עכבר F (ab '2)) ב TBS לריכוז הרצוי (1:300 דילול) ולהחיל אותו על שקופיות. דגירה עבור שעה 2 ב RT.
- כן 30 דקות מורכבות ביוטין-peroxidase streptavidin לפחות לפני השימוש. ודא שיש מספיק כדי לכסות את כל השקופיות. שטפו את השקופיות TBS שלוש פעמים. החל פתרון השקופיות ו דגירה של שעה 2 ב RT.
- שטפו את השקופיות TBS שלוש פעמים. כן 3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC) פתרון מצע peroxidase (עשה בהתאם להוראות היצרן). ולהחיל אותו על שקופיות דגירה במשך 20-30 דקות או עד עוצמת הכתם הרצויה מתפתחת.
- יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מהברז למשך 5 דקות. Counterstain את החלקים עם פתרון haematoxylin של מסוננים מאיירים למשך 2 דקות. שטפו את השקופיות במים זורמים מהברז למשך 5 דקות.
- מסנן את השקופיות ולכסות את החלקים עם הרכבה בינונית מימי קבע. ייבש את השקופיות ב 80 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש. אפשר השקופיות להתקרר, ולאחר מכן לטעון אותם עם DPX ומקום coverslip.
5. Stניתוח aining
- לנתח את הסעיפים בהגדלה 40X באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצלמה רכובה המחוברת למחשב.
הערה: לקבלת ניתוח הסלולר, רוזן מוכתם חיובי, תאי בעלי גרעין בתוך שכבת הרירית מיוחדת הסמפונות האפיתל ללא פגע, למעט באזורים של שריר חלק, בלוטות, כלי דם גדולים, ורקמות תואמות או פגומות. - הממוצע את ספירת התאים ולתקן את ספירת התא הממוצעת באזור של שכבת הרירית מיוחדת ואת האורך של האפיתל. האזור של שכבת הרירית המיוחדת ואורך האפיתל ניתן לחשב באמצעות תוכנית ניתוח התמונה.
6. אנזימתי עיכול של ביופסיות Endobronchial
- ביופסיות כביסה: בעזרת מלקחיים סטריליות, ביופסיות שלם ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת בופר של האנק (HBSS) (איור 3). דגירה במשך 5 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד. מעביר את הביופסיות על ד סטריליish באמצעות אחסון התוכן של הצינור 15 מ"ל עם HBSS.
- שיבוש ריר עם DTT: החלף את HBSS בצינור עם 10 מ"ל של HBSS המכיל 5 1,4-dithiothreitol מ"מ (DTT). מעביר את הביופסיות בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות מלקחיים סטרילית. דגירה במשך 15 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד.
- וורטקס הצינור בעדינות במשך 15 שניות. מעבירים את ביופסיות על צלחת סטרילי באמצעות אחסון התוכן של הצינור 15 מ"ל עם HBSS DTT.
- העברת ביופסיות עד בינוני התרבות: החלף את HBSS DTT בצינור עם 10 מ"ל של מדיום תרבות RPMI 1640. מעביר את הביופסיות בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות מלקחיים סטרילית. דגירה של 10 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד.
- לעכל ביופסיות עם collagenase ו DNase.
- הכן פתרון העיכול של collagenase השנייה (0.25 מ"ג / מ"ל) ו DNase (0.2 מ"ג / מ"ל) ב RPMI מחומם מראש המכיל 1 פתרון M HEPES. הוספת 500 μL של פתרון העיכול לכל היטב כת רקמת 48-היטב צלחת יור.
- מקום 1 ביופסיה לכל היטב פתרון העיכול. דגירה את הצלחת על פלטפורמת רעד במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 220 סל"ד. עד פיפטה ומטה לאחר 30 דקות מחדש לפזר את הביופסיות, ולאחר 60 דקות, כדי disaggregate לחלוטין את הרקמה.
- הכנת תרחיפים תא בודד.
- ברכה יחד הביופסיות מתעכלות מבאר לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. אוסף את התאים הנותרים על ידי שטיפת הבארות עם חיץ FACS קר כקרח (בופר פוספט (PBS) בסרום שור 2% עובריים המכיל).
- סוחטים את הרקמה הנותרת על מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה של המזרק. בצנטריפוגה תאים מתעכל ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח. ספירת התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer כתם כחול Trypan כדי להעריך את הכדאיות של תאים.
= "Jove_title"> 7. ניתוח תזרים Cytometric של תאים בודדים של ביופסיות Endobronchial לאחר אנזימתי עיכול
- Resuspend התא גלולה של כ 1 x 10 6 תאים 200 μl של חיץ FACS.
- הוספת צבע כדאיויות תא להוצאת תאים מתים על פי הפרוטוקול של היצרן.
- הוסף 5 μl של מגיב חסימת FCR דגירה במשך 5 דקות ב 4 °.
- הוספת נוגדנים פני התא נגד CD45 (2 μl), השושלת (CD3, CD20, CD56, CD66abce, ו CD14; 2 μl כל אחד), CD16 (0.5 μl), HLA-DR (3 μl), CD11c (5 μl), CD123 (5 μl), CD1c (3 μl), ו CD103 (2 μl) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 °. פרטים על נוגדנים ניתן למצוא בסעיף שיטות, אבל לכייל לייעל את הנוגדנים לזרימה המדויקת cytometer בשימוש. לשטוף נוגדנים עודפים עם PBS במשך 5 דקות ב g x 400. רוכשים את הדגימות טריות על cytometer זרימה או לתקן את תאי paraformaldehyde 1% לפני acquisit מאוחר יותריוֹן.
- זהה DCs האנושי בביופסיות ריאות באמצעות זרימת cytometry assay 18 (איור 4).
הערה: שימוש cytometry זרימה תוכנת ניתוח, תאי מערכת החיסון נבדלים מתאי ריאה אחרות על ידי gating על CD45. תאים מתים ניתן לשלול כתאים כי הם חיוביים עבור צבע חי / מת. מכל CD45 + תאי החיים, תאי שושלת (תאי B, תאי T, תאי NK, נויטרופילים, מונוציטים ו) ניתן לשלול באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, CD16 ו בערוץ אחד. לאחר מכן, HLA-DR + תאים יאפשר זיהוי של כל DCs האנושי. MDCs ניתן להבחין בין PDCs מבוסס על הביטוי של CD11c או חוסר CD11c, בהתאמה. MDCs ניתן לחלוקה נוספת לתוך CD1c + MDCs או CD141 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקרים לאפיון תאים חיסוניים רקמות תושב נשימה של אדם, כולל DCS, מוגבלים, בעיקר בשל העובדה כי הוסרו בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר. כאן, שיטה פחות פולשנית קבלת רקמת הריאה ביופסיות endobronchial (גאות) של מתנדבים בריאים ופרוטוקולים פותח על מנת ללמוד את תאי מערכת החיסון של רקמות באמצעות אימונוהיסטוכימיה או cytometry זרימה מתוארים.
מתנדב בריא עבר ברונכוסקופיה, כפי שתואר לעיל 19, 20. שישה עד תשעה 1-2 מ"מ 3 ביופסיות ברירית endobronchial נלקחו קארינה הראשי לבין חטיבות סימפונות העיקריות של כל נבדק באמצעות מלקחי fenestrated (איור 1 א). שתי ביופסיות ננעצו GMA ובהמשך המשמשות אימונוהיסטוכימיה לספק מידע מרחבים. Biopsi הנותריםes היו מתעכל enzymatically, ואת תא בודד השעיות נותחו באמצעות צבע רב cytometry זרימה, אשר מאפשרות אפיון קפדני של תת תאים נדירים (איור 1B).
כדי לקבל כמה שיותר מידע מרחבי ככל האפשר מן חתיכות הרקמה הקטנות, הביופסיות היו משובצות GMA המאפשר סעיפי מיקרומטר ultrathin (איור 2 א-ב). כצפוי, תאים חיסוניים להביע CD45 היו יחסית נדיר- בממוצע, 125 CD45 + תאים לכל מ"מ 2 נכחו רקמת ריאה רירית במהלך תנאי יציב, כפי שהוערכו על ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 2 ג). שליטת isotype IgG1 הביאה לא מכתים חיובי, המעיד על סגוליות גבוהות של הנוגדן הראשוני. מספר התאים חיוביים בשני האפיתל הריאות ואת שכבת הרירית המיוחדת שבבסיס כומתו והראה כי תאי CD45 + חיסוני היו יותר בשפע laמינה propria מאשר האפיתל (איור 2 ד). יתר על כן, CD1a להביע תאים זוהו מנויים, והם ככל הנראה מייצגים DCS (איור 2E). בממוצע, פחות מאחד CD1a + תא לכל מ"מ 2 זוהה שכבת הרירית המיוחדת ריאות על מצב יציב (איור 2F).
אימונוהיסטוכימיה מספק מידע על חלוקת האנטומי של תאים ברקמות ללא פגע, אך הוא מוגבל בדרך כלל יכולתו להגדיר את התאים באמצעות סמנים על פני קרום התא מרובים. רב צבעים cytometry זרימה, תלוי במכשיר, יש את היתרון של מתן מידע נוסף לכל תא, וזה יכול לשמש דוגמאות קטנות. עד תשע ביופסיות ריאה ריריות היו נקוות, שטף, וטופחו לשבש את הריר. כל ביופסיה אז הייתה מתעכלת על ידי collagenase ו DNase בבארות בודדות של צלחת גם 48, וכתוצאה מכך השעית תא בודד (F igures 3A - 3B). בממוצע, 1.5 x 10 6 תאי endobronchial לכל נושא התקבלו, וקשר חיובי בין תשואת התא ואת הכדאיות נצפה (איור 3 ג). כדאיויות התא המופחתות ציינו עם מספרים סלולריים נמוכים עלולות להיות מוסברות על ידי ריכוז אנזים גבוה לכל תא זה היה הכי מוצלח עבור התאים. זהו אתגר עם ביופסיות שונות הן בגודל והן צפיפות תאים, עם כמה ביופסיות דגימה יותר של הרירית השטחית יותר מאחרים. כצפוי, ניתוח תזרים cytometric של השעית התא הבודד עולה כי, בממוצע, 12% מכלל התאים היו CD45 + לויקוציטים, בעוד שרוב התאים ברקמה הרירית ריאות בתנאים יציבים לא היו תאי מערכת חיסון (3D איור ). תזרים cytometric ונתונים IHC בקורלציה, אשר מדגיש את עוצמת שימוש בטכניקות שניהם במקביל.
= "1"> ניצול פרוטוקול עיכול אנזימטי, השעיות תא מתאי endobronchial הוכתמו פנל של נוגדנים שכותרתו fluorescently. התדירות תת DC השונה ברקמת ריאה והבעתם של CD103 לעומת תאי שטיפה ברונכואלוואולרית או דם היקפי מאותו הנושא נותחה. תאים מיאלואידית זוהו באמצעות שער על CD45 חי + לויקוציטים שביטאו HLA-DR אבל היו שליליות עבור סמנים השושלת CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14, CD16 ו (איור 4 א). באוכלוסייה הקטנה הזו של תאים, plasmacytoid DCS (PDC) זוהה מבוסס על חוסר ביטוי CD11c והביטוי הגבוה שלהם CD123 ו- HLA-DR (צהבהב). בין CD11c + HLA-DR + השושלת שלילי תאים, הן CD1c + (אלמוגים) ו CD141 + (בורדו) DCs מיאלואידית זוהו (איור 4 א). כדי להמשיך לאפיין תת תא אלה, הביטוי שלהם של CD10 integrin 3 נקשרת E-cadherin, חשוב עיגון רקמות, הוערכו. בעוד כל תת DC, כמו גם תאי T במחזור הדם ההיקפיים, היו נמוכים או שליליים עבור CD103, חלק מובהק של תאים DCS ו T נמצא הריאות של אותו יחיד הביע CD103. זה היה נכון של תאים הנמצאים הן שטיפה ברונכואלוואולרית וכן רקמת הריאה (איור 4B).
איור 1: דגימה של רקמה רירית אדם ריאות. (א) Bronchoscopies בוצע בנושאים להשיג ביופסיות endobronchial מחטיבות הסימפונות הראשיות של מלקחיים תוך שימוש באחת ריאות. ביופסיות (B) היו חלק בלתי נפרד בין אם GMA עבור חתך רקמות אימונוהיסטוכימיה (דיאגרמה כחול) או מתעכל enzymatically להשיג תא בודד השעיות עבור cytometry זרימה (תרשים ורוד).מ '/ קבצים / ftp_upload / 55,222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Embedding הביופסיות שרף GMA. (א) ביופסיות שנלקחו bronchoscopies הועברו מיד צלוחיות זכוכית המכילים אצטון מיובש קר כקרח (פאנל משמאל). בעקבות קיבעון לילה, הביופסיות היו הסתננו עם פתרון בנזואט מתיל. ביופסיות הונחו הטבעה כמוסה מלאי הטבעת פתרון להתחיל פילמור (פנל באמצע). ביופסיות Embedded ניתן לאחסן ב -20 ° C או יכול להיות מחולק מכתים אימונוהיסטוכימיה (פאנל מימין). (ב) השלבים העיקריים סכמטי מדגיש בתהליך של ביופסיות הטבעה באמצעות GMA. נציג תמונות של ביופסיות מחולקות מראות את הנוכחות של CD45 + (C) או CD1a + תאים (E) מוצגים בהשוואה לקבוצת ביקורת isotype המתאימה (לוחות מימין). המכתים ספציפי מוצג באדום, גרעיני תאי counterstained עם hematoxylin הם בכחול. בר סולם = 50 מיקרומטר. גרפים בר להראות החציון ± טווח בין-רבעוני של CD45 + (D) או CD1a + (F) תאים לכל מ"מ 2 propria האפיתל או lamina (n = 20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: עיכול אנזימתי של ביופסיות עבור cytometry הזרימה. (א) ביופסיה endobronchial שנלקחו ברונכוסקופיה בצלחת פטרי. הביופסיות נשטפו HBSS, שטופלו DTT להסיר ריר, גידולד מתעכל עם collagenase ו DNase לפני אוסף של תאים בודדים עבור ניתוח תזרים cytometric. (ב) סכמטי מסכמת את הנהלים העיקריים לעכל ביופסיות עבור cytometry זרימה. (C) הגרף מראה את הקשר בין שתיים תשואת תא ואת הכדאיות, כפי שהוערך על ידי ספירה ידנית והדרה הכחולה Trypan (n = 20). (ד) תא בודד השעיות מן הביופסיה מתעכלת נותחו על ידי cytometry זרימה שלהם ונבחן לגביהם כדאי ואת הביטוי של CD45 (אנטיגן משותף לויקוציטים). תזרים cytometry העלילה מציגה התורם נציג אחד מתוך 20 נבדקים בריאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: זיהוי של תת תא ריאות הדנדריטים ב מתעכלiopsies. (א) אסטרטגיה Gating לזיהוי CD1c + ו- CD141 + DCs מיאלואידית (MDCs) ו DCs plasmacytoid (PDC) ב הרקמה הרירית ריאות. תזרים cytometry מגרש מנושא לנושא הנציג מוצג. (ב) מגרשים נקודה להראות את הביטוי של CD103 integrin על אוכלוסיות של DCs בביופסיות ריאות (פאנל משמאל), שטיפה ברונכואלוואולרית (פאנל באמצע), ודם היקפי (פאנל מימין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר כיצד ליצור אפיון מרחבי phenotypical מפורט של DCs ריאות רקמות תושב בבני אדם בריא באמצעות אימונוהיסטוכימיה וזרימת cytometry על ביופסיות ברירית endobronchial שנאספו במהלך ברונכוסקופיה. בפסקאות הבאות צעדים קריטיים בפרוטוקול הם דנו בפירוט.
קריטיים שלבים עם הפרוטוקול
חתך אימונוהיסטוכימיה: זה קריטי כדי לשמור על בלוקים ביופסיה ב -20 ° C כאשר לא משתמש בהם (שלב 2.5). בלוקים חמים לפעמים יכולים להיות רכים לא קטע גם כן. בנוסף, שמירה על הגושי ב -20 ° C יהיה לשמר אתרי אנטיגן לגרום מכתים טוב יותר באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
חתך אימונוהיסטוכימיה: כאשר חתך הביופסיות GMA-המוטבעות, זה נוח יש 3-4 מכולות של מי אמוניה זמינות לצוף המדורים. כאשר קטע הוא הרים, maKe בטוח להחליף אותו עם קטע טרי (שלב 3.4). הדבר מבטיח כי, לפי הזמן אותו סעיף המטופל שוב, זה יהיה כבר צף על פני מי האמוניה כ באורך הנכון של זמן (45-90 שניות), אשר מסייע מצגת אנטיגן ואת אימונוהיסטוכימיה הבא. חיתוך 2 מיקרומטר חלקים בצורה זו מאפשר גם חתך רצוף, כלומר לאותו התא יכול להיות מוכתם באופן פוטנציאלי עם סמנים תאיים או על פני קרום תא שונים. חשוב לא לגעת את חוד החנית של להב הזכוכית כאשר חתך, כפי שהוא נפגע בקלות. אם יש כל פסולת מן הלהב כי צריך להיות מוסר, תמיד לצחצח הרחק חוד החנית.
עיכול אנזימתי וזרימת cytometry: בדגימות רקמה שבו תאי מערכת חיסון הם נדירים, זה קריטי לכלול CD45 בלוח מכתים זרימת לזהות לויקוציטים ראשון (במיעוט) לפני DCs זיהוי נוסף או תאי חיסון אחרים בעלי עניין. כמו כן, "fשולט luorescence מינוס אחד "או אלוטיפ הם קריטיים לכלול בעת אימות לוחות הנוגדן משמשים כדי להבטיח כי אירועים נדירים הם אות אמיתית על רעש.
שינויים ופתרון בעיות
חתך אימונוהיסטוכימיה: עבור סמנים תאיים ביותר הביע על ידי תאים חיסוניים, רקמת שקדים יכול לשמש כביקורת חיובית טובה כדי לכיל נוגדנים אימונוהיסטוכימיה כדי להימנע מבזבוז חומר ביופסיה endobronchial מוגבל (שלב 4). כדי להמחיש את התהליכים הדנדריטים של DCS, רקמות יכולות להיות מחולקות במקביל האפיתל, ולא בניצב הדרך הרירית 21. מצעי peroxidase אחרים יכולים לשמש בנוסף AEC, כגון DAB, אם המשתמש דורש צבע מצע שונה. קומפלקס אנזים avidin / ביוטין יכול גם להיות תחליף, למשל, עם phosphatase אלקליין.
עיכול אנזימתי וזרימה cytometry: למרות בסופו של דברביופסיות obronchial הם קטנים, תאי תושב הרקמות לשרוד את עיכול אנזימטי ועיבוד לתוך השעית תא בודד עבור ניתוח התזרים cytometric (איור 3). עם זאת, חשוב להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של האנזימים על הכתמים המשמשים cytometry זרימת לוח נוגדן. כדי לבדוק אם המסלקת פרוטוקול עיכול אנזימטי את, אלטר, או מפריעה מכתים נוגדן, תאים בקלות נגיש יותר להביע סמנים דומים, כגון תאי דם היקפיים mononuclear, יכול להיות מטופלים עם אנזימי עיכול (שלב 6) או לא, והם יכול לאחר מכן על ידי מוכתם נוגדנים שכותרתו fluorescently ונותחו על ידי cytometry זרימה (שלב 7). אם collagenase ו DNase לא להפריע הזמין אנטיגן, הכתמים עם או ללא טיפול של התאים עם אנזימים אמורים להיות דומים. יתר על כן, זה יכול להיות מאומת באמצעות שני cytometry לזרום, כמו גם ללא פגע סעיפי רקמות אימונוהיסטוכימיה (אלחוטידמויות 2 - 3) 19.
מגבלות של הטכניקה
ברונכוסקופיה: אנשים בריאים רוב לסבול ברונכוסקופיה היטב, היא שיטה בשימוש שגרתי לבחון ולטעום הריאות, כולל לאסוף ביופסיות ברירית endobronchial, כפי שמתואר כאן (שלב 1). עם זאת, ברונכוסקופיה היא בדרך כלל אינה שיטה מתאימה לבצע לדגימה אורכת, שכן היא נתפסה לעתים קרובות לא נוחה, וזה גם הליך הזמן- תקציבים ומשאבים רבים דורשים. לכן, ביופסיות endobronchial רק לספק תמונת מצב של תאי מערכת החיסון הנוכחיים ברקמת הריאה הרירית בזמן נתון, ולא מחקר ארוך טווח של שינויים בדינמיקה או קינטיקה.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
חתך אימונוהיסטוכימיה: היתרון של מוטבע GMA ולא פרפין או על ידי cryopreservationהוא שימור המורפולוגיה אנטיגנים, ומספר רב יותר של חלקים המעולה מפני הביופסיות הקטנות, בשל החלקים הדקים שניתן להשיג 17.
עיכול אנזימתי cytometry הזרימה. על ידי קבלת תאים בודדים ביופסיות קטנות, הרבה יותר מידע ניתן להשיג צבע רב cytometry זרימה.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות במקביל למיקסום את המידע ניתן לקבל ביופסיות endobronchial קטנות על ידי שילוב אימונוהיסטוכימיה ו cytometry הזרימה. כדי לאפיין את הפריסה המרחבית של תאי חיסון נדירים כגון DCS, ביופסיות יכולות להיות מוטבעות GMA להשיג חלקים דקים אימונוהיסטוכימיה, ואילו להבחין DCs מתאי חיסון אחרים עם סמנים דומים, העיכול אנזימטי של הביופסיות מאפשר צבע רב cytometry הזרימה להיות PErformed. כדי להפעיל את הזיהוי המשוחדת של מאפייניו החדשים DCs בזמן דלקת או מחלה, הניתוח האוטומטי של נתוני התזרים cytometric יכול להתבצע על ידי החלת אלגוריתמי תכונת חילוץ 22. יישומים עתידיים כוללים באמצעות תאים בודדים אלה עבור מיון התא לאסוף אוכלוסיות תאים ספציפיים שיכולים לשמש לריצוף RNA או פרופיל transcriptomic. זיהוי של DCs המתגורר הריאות עשוי להיות חשוב להבנת השינויים בנוף החיסוני במהלך בריאות ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למתנדבים שתרמו חומר קליני למחקר זה. אנחנו גם להודות מקרב לב לצוות במחלקה לבריאות הציבור ורפואה קלינית, המחלקה לרפואת רפואה / הנשימה, בית החולים האוניברסיטאי, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) לאיסוף כל החומר הקליני.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AS-S ממועצת המחקר השוודי, קרן הלב-ריאות שוודית, קרן שוודית למחקרים אסטרטגיים, ואת קרולינסקה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
