Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse chimique formée par la liaison entre la plaque de serrage moteur de la fibre musculaire et l’axone des motoneurones terminal. Le NMJ s’est avéré jouent un rôle crucial lorsque la communication entre le muscle et le nerf est altérée, comme le vieillissement ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Comme le muscle et le nerf communiquent en voie bidirectionnelle^1,2, être capable de mesurer les défauts NMJ séparément des défauts de muscle peut apporter un nouvel éclairage sur leur interaction physiopathologique. En effet, cette évaluation fonctionnelle peut aider à déterminer si des altérations morphologiques ou biochimiques réduisent fonctionnalité de signalisation de la neurotransmission.

La comparaison de la réponse contractile musculaire provoquée par une stimulation nerveuse et la réponse du muscle même évoqué par stimulation directe de sa membrane a été proposée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ. En effet, depuis la neurotransmission membrane stimulation de contournement de signalisation, toutes les différences dans les deux réponses contractiles peuvent être imputés à l’évolution de la NMJ. Cette approche a été largement proposée pour rats^3,4,5,6,7et également utilisée pour recueillir des informations sur des souris modèles^8,9,10,11,12.

Ici, nous décrivons en détail une procédure permettant d’accise et de tester deux préparations de muscle-nerf, i. e. les préparatifs du soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique. À l’aide de fait à l’ordre logiciel, nous avons conçu un protocole d’analyse continu qui combine la mesure des différents paramètres qui caractérisent la fonctionnalité NMJ et le muscle, réduisant ainsi à une évaluation complète des dommages NMJ séparément de celui du muscle. En particulier, le protocole de mesure de la force de la contraction, la cinétique de muscle, la courbe force-fréquence direct et les stimulations nerveuses, l' échec de neurotransmission¹³ pour une mise à feu et les fréquences tétaniques et la fatigue intratetanic⁷.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université La Sapienza de Rome-Unité d’Histologie et d’Embryologie Médicale et ont été réalisées conformément à la version actuelle de la loi italienne sur la Protection des Animaux.

1. Montage expérimental

1. Mise en place du système expérimental composé d'1 actionneur/transducteur, 2 stimulateurs, 1 appareil musculaire in-vitro, 1 bain tissulaire préparatoire, 1 électrode d’aspiration, 1 oscilloscope numérique, 1 stéréomicroscope, 1 illuminateur à lumière froide, 1 carte d’acquisition, 1 bloc de connexion et un ordinateur personnel.
   REMARQUE : Ici, le logiciel de commande a été programmé dans LabView et a été conçu pour garantir une flexibilité, une précision et une répétabilité élevées des stimulations. Pour chaque stimulation, l’utilisateur peut sélectionner la largeur d’impulsion, la fréquence, la durée et décider si elle est délivrée à la membrane ou à travers le nerf. L’utilisateur peut également sélectionner la durée de la période de repos avant chaque stimulation.

2. Évaluations des propriétés contractiles de la JNM des muscles soléaires et diaphragmaires

1. Préchauffage du système
   1. Préparez le tampon Krebs Ringer¹⁴ et placez-le dans un bain de l’appareil de montage et du bain de tissu préparatoire. Placez un plat de 60 mm préparé avec 4 ml de silicone dans le bain de tissu préparatoire.
   2. Allumez le bain-marie en circulation et réglez la température à 30 °C pour le muscle soléaire et à 27 °C pour le muscle du diaphragme.
   3. Laisser le mélange 95 % O₂ - 5 % CO₂ s’écouler dans les deux bains.
   4. Allumez l’actionneur/transducteur et les deux stimulateurs d’impulsions et réglez les valeurs de courant sur 300 mA pour la stimulation membranaire et sur 5 mA pour la stimulation nerveuse.
      REMARQUE : Il a déjà été démontré que la valeur du courant de 300 mA n’induit aucune contraction significative sur les branches nerveuses lorsque la D-tubocurarine est ajoutée à la solution¹⁵. La valeur du courant de 5 mA correspond à la quantité de courant nécessaire pour stimuler le muscle à travers le nerf sans créer de chevauchement avec la stimulation membranaire induite au moyen de la solution. Étant donné que la distance entre l’électrode d’aspiration et le muscle dépend de la longueur du nerf, cette valeur de courant doit être soigneusement ajustée avant chaque expérience, comme décrit ci-dessous.
2. Dissection du soléaire et du diaphragme
   1. Sacrifiez la souris par luxation cervicale pour minimiser la souffrance et excisez immédiatement les muscles pour les tester comme suit.
   2. Préparation, dissection et mise en place du soléus-sciatique
      1. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la patte de la souris et retirez la peau qui recouvre la jambe. Faites une incision dans la partie supérieure de la jambe avec une paire de ciseaux, puis tirez fermement sur la peau. Isolez le tendon d'Achille du tibia, puis coupez le tendon d'Achille avec une paire de ciseaux.
      2. Serrez fermement le tendon à l’aide d’une paire de pinces et tirez doucement le muscle gastrocnémien avec le soléaire. Une fois que le tendon proximal du soléaire est exposé, coupez tout le mollet avec une paire de ciseaux tout en tenant le tendon d'Achille. Placez immédiatement l’échantillon de tissu dans le bain de tissu préparatoire.
      3. Placez le bain préparatoire sous le stéréomicroscope et fixez le veau sur la coupelle en silicone à l’aide de broches en acier inoxydable de 0,20 mm de diamètre. À l’aide d’une paire de pinces, clampez le tendon proximal du soléaire et tirez-le doucement pour exposer l’innervation sciatique.
      4. Une fois l’innervation exposée (Figure 1), retirez soigneusement le tissu environnant pour exposer environ 5 mm du nerf. Utilisez une paire de ciseaux fins pour couper le nerf. Tout en serrant fermement le soléaire sur le tendon proximal à l'aide d'une pince, tirez-le à nouveau et excisez-le en coupant le tendon d'Achille avec une paire de ciseaux.
      5. Passez un fil de nylon dans le trou du bras de levier de l’actionneur/transducteur. Créez un nœud coulant à l'extrémité du fil et saisissez le tendon d'Achille avant de tirer le fil vers l'arrière jusqu'à ce que le muscle atteigne le bain de l'appareil de montage. Fixez le tendon proximal dans la pince fixe et attachez le fil de nylon autour du bras de levier. Laissez le muscle s’équilibrer dans la solution.
      6. Déterminez la longueur optimale initiale (L₀).
         1. Tout d’abord, étirez le muscle pour le précharger à 10 mN (cette valeur garantit la force de contraction maximale (basée sur l’expérience)). Ensuite, étirez doucement le muscle pour modifier la précharge et stimulez-le avec une série d’impulsions uniques. La longueur optimale est atteinte lorsque la force de contraction maximale est mesurée.
   3. Préparation, dissection et mise en place du diaphragme-phrène
      1. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la peau de la souris. Retirez la peau recouvrant le muscle du diaphragme en faisant une incision sur le sternum avec une paire de ciseaux et en tirant fermement sur la peau.
      2. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez l’abdomen horizontalement sous le sternum et retirez délicatement l’intestin et les organes à l’aide d’une pince. Utilisez une paire de ciseaux épais pour couper la colonne vertébrale.
      3. Coupez les côtes à environ 1 cm au-dessus du sternum et procédez horizontalement. Retirez délicatement les organes externes à l’aide d’une pince et coupez la colonne vertébrale pour obtenir un anneau circulaire de côtes contenant le diaphragme.
      4. Lavez la préparation dans un plat contenant le tampon Krebs Ringer, puis placez-la dans le plat en silicone à l’intérieur du bain de tissu préparatoire, la face supérieure vers le haut et le sternum vers l’avant.
      5. À l’aide du stéréomicroscope, retirez soigneusement les poumons et les organes restants ; le nerf phrénique sera visible sur le côté droit (Figure 2A).
      6. Coupez les nervures pour laisser un anneau d’environ 2 mm tout le long du diaphragme.
      7. À l’aide d’une pince, fixez une goupille en acier inoxydable de 0,20 mm de diamètre sur le tendon central du diaphragme au point correspondant à l’innervation du nerf phrénique, et une autre goupille sur les nervures dans le même axe pour identifier la bande de diaphragme d’intérêt.
      8. Fixez deux broches supplémentaires sur le tendon central et deux autres broches sur les nervures de chaque côté de la bande sélectionnée pour disposer le diaphragme. Si nécessaire, nettoyez le nerf phrénique du tissu conjonctif environnant à l’aide d’une pince.
      9. À l’aide d’une lame incurvée, coupez le diaphragme de chaque côté de l’innervation pour identifier une bande tendineuse-muscle-côte comme indiqué dans Figure 2B.
      10. Passez un fil de nylon dans le trou du bras de levier de l’actionneur/transducteur. Créez un nœud coulant à l’extrémité du fil et saisissez le tendon avant de tirer le fil vers l’arrière jusqu’à ce que le muscle atteigne le bain de l’appareil de montage.
      11. Fixez les nervures à l’intérieur de la pince fixe et attachez le fil de nylon autour du bras de levier.
      12. Laissez le muscle s’équilibrer dans la solution et déterminez la longueur optimale initiale (L0).
          1. Étirez le muscle pour le précharger à 5 mN. Étirez doucement le muscle pour modifier la précharge et stimulez-le avec une série d’impulsions uniques. La longueur optimale est atteinte lorsque la force de contraction maximale est mesurée.

Figure 1 - Préparation du nerf soléaire-sciatique. Nerf soléaire-sciatique pendant l’opération chirurgicale pour les tests fonctionnels. La sciatique est exposée à l’aide d’une paire de pinces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 - Préparation du nerf diaphragme-phrénique. L’image montre une phase de l’exérèse de préparation du nerf diaphram-phrénique (A) et la bandelette à monter pour les tests fonctionnels (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Mesurer les propriétés de la NMJ séparément de la contractilité musculaire
   1. Réglez la meilleure intensité de courant pour la stimulation à travers le nerf et vérifiez que les impulsions de courant délivrées par l’électrode d’aspiration ne provoquent pas de contraction musculaire par la propagation du courant dans le bain.
      1. Placez l’électrode d’aspiration près du muscle et tirez le nerf vers l’intérieur. Tout en augmentant doucement l’intensité du courant (à partir de 5 mA), stimulez le muscle avec une série d’impulsions uniques. La valeur optimale du courant est déterminée lorsque la force de contraction est maximale.
      2. Poussez le nerf hors de l’électrode et délivrez quelques impulsions simples. Assurez-vous que le muscle ne se contracte pas en raison d’un chevauchement avec la stimulation membranaire au moyen de la solution. Faites rentrer le nerf à nouveau.
   2. Lancez le programme et sélectionnez le fichier d’entrée pour exécuter le protocole de test souhaité.
      REMARQUE : Le fichier d’entrée comprend tous les paramètres de stimulation nécessaires à l’exécution de l’ensemble du protocole. Bien que la même structure de protocole soit utilisée pour les deux muscles, les paramètres de stimulation diffèrent selon le protocole, se réfère aux muscles soléaires ou diaphragmes.
      1. Stimulation du nerf soléaire-sciatique (voir tableau 1)
         1. Utilisez les largeurs d’impulsion suivantes pour toutes les stimulations électriques : 1,4 ms pour la stimulation du nerf sciatique et 0,1 ms pour la stimulation directe par soléaire. Le protocole complet dure environ 65 min.
      2. Stimulation du nerf diaphragme-phrénique (voir tableau 2)
         1. Utilisez les largeurs d’impulsion suivantes pour toutes les stimulations électriques : 1,8 ms pour la stimulation du nerf phrénique et 0,2 ms pour la stimulation directe du diaphragme. Le protocole complet dure environ 55 min.
      3. À la fin du protocole expérimental, mesurez la longueur et le poids humide du muscle à l’aide d’un pied à coulisse analogique d’une précision de 0,05 mm et d’une échelle de précision d’une précision de 0,1 mg, respectivement.
         1. Calculez l’aire de la section transversale (CSA) en divisant la masse musculaire par le produit de la longueur optimale des fibres (L_f) et de la densité du muscle squelettique des mammifères (1,06 mg/mm³)¹⁶.
            REMARQUE : L_f est obtenu en multipliant L₀ par le rapport longueur fibre/longueur musculaire (0,71 pour le muscle soléaire¹⁶ et 1 pour le muscle du diaphragme¹⁷).

Tableau 1 - Protocole de stimulation du nerf soléaire-sciatique. Le tableau répertorie la séquence des tests qui forment le protocole complet pour tester les préparations du nerf soléaire-sciatique.

Tableau 2 - Protocole de stimulation du nerf diaphragme-phrénique. Le tableau répertorie la séquence des tests qui forment le protocole complet pour tester les préparations du nerf diaphragme-phrène.

3. Analyse des données

REMARQUE : À la fin du protocole, calculez tous les paramètres souhaités comme suit.

1. De la stimulation par impulsion unique
   1. Calculez la force de contraction (mN ; force active maximale générée pendant la contraction) et la force de contraction spécifique (mN/mm²). Calculez-le en soustrayant la valeur de précharge initiale à la force maximale générée par le muscle. Calculez la force de contraction spécifique comme la force de contraction divisée par l’ASC musculaire.
   2. Calculez le temps jusqu’à la tension maximale (TTP) (ms) comme le temps entre la libération de l’impulsion et la force de contraction.
   3. Calculez le temps de demi-relaxation (1/2RT) (ms) comme le temps entre la force de contraction et 50 % de la force de contraction.
   4. Calculez dF/dt (mN/ms) comme valeur maximale de la dérivée de force pendant la phase contractile.
   5. Calculez -dF/dt (mN/ms) comme valeur maximale de la dérivée de force pendant la phase de relaxation.
2. À partir de stimulations de train d’impulsions
   1. Calculez la force non fusionnée (mN) et la force non fusionnée spécifique (mN/mm²). Calculez-le en soustrayant la valeur de précharge initiale à la force maximale générée par le muscle. Calculez la force spécifique non fusionnée en divisant la force non fusionnée par le muscle CSA.
      REMARQUE : La force non fusionnée est la force active maximale générée lors d’un train d’impulsions avec une fréquence inférieure à la fréquence tétanique.
   2. Calculer la force tétanique (mN) et la force tétanique spécifique (mN/mm2) ; la force maximale est la force active maximale générée lors d’un train d’impulsions délivré à la fréquence tétanique. Calculez-le en soustrayant la valeur de précharge initiale à la force maximale générée par le muscle. Calculez la force tétanique spécifique comme la force tétanique divisée par l’ASC musculaire.
   3. Calculez la courbe force-fréquence. Tracez la valeur de la force (ou de la force spécifique) obtenue pour chaque stimulation en fonction de la fréquence croissante de la stimulation. En règle générale, il commence par la stimulation à impulsion unique et se termine par la fréquence tétanique.
3. Des paradigmes de fatigue
   1. Calculer échec de neurotransmission (NF) comme suit :
      
      où MF est la diminution de force après stimulation musculaire et F est la diminution de force après stimulation nerveuse, mesurée sur le premier train d’impulsions après la stimulation musculaire.
   2. Calculer Fatigue intratétanique (FI) comme suit :
      
      où F_lp est la force générée par le muscle lors de la dernière impulsion de stimulation, et F_m est la force maximale générée par le muscle au cours du même train d’impulsions. En ce qui concerne la stimulation nerveuse, calculez la fatigue intratétanique sur le premier train d’impulsions immédiatement après la stimulation directe.

4. Analyse statistique

REMARQUE : Les modèles d’analyse statistique doivent être choisis selon que la réponse musculaire aux stimulations nerveuses et membranaires est comparée au sein d’un même modèle animal ou entre 2 modèles animaux différents^18,19.

1. Utilisez le test t de Student pour TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt si vous comparez uniquement les réponses musculaires aux stimulations directes et indirectes. Si vous comparez des préparations musculaires obtenues à partir de 2 souches de souris différentes, utilisez l’ANOVA à 2 facteurs avec le type de stimulation et la tension de la souris comme facteurs fixes. Lorsque l’ANOVA à 2 facteurs renvoie un résultat significatif, utilisez plusieurs tests de comparaison pour rechercher des différences statistiques.
2. Pour la courbe force-fréquence (si vous comparez uniquement les réponses musculaires aux stimulations directes et indirectes), utilisez l’ANOVA à 2 facteurs avec le type de stimulation et la fréquence de stimulation comme facteurs fixes. Utilisez plusieurs tests de comparaison si nécessaire.
   1. Si vous comparez des préparations musculaires obtenues à partir de 2 souches de souris différentes, utilisez l’ANOVA à 3 facteurs avec le type de stimulation, la fréquence de stimulation et la tension de la souris comme facteurs fixes.
      1. Lorsque l’ANOVA à 3 facteurs produit un effet significatif des facteurs de tension animale et de type de stimulation, utilisez l’ANOVA à 2 facteurs pour identifier les différences significatives entre 2 groupes à la fois. Par exemple, les différences entre la réponse musculaire des 2 groupes à la stimulation membranaire, ou entre la réponse musculaire aux stimulations directes et indirectes au sein d’un même groupe peuvent être évaluées.
3. Fatigue intratétanique
   REMARQUE : Étant donné que le protocole a été conçu pour induire une fatigue en réponse à la stimulation nerveuse, même chez les souris témoins, ce paramètre ne peut être utilisé que pour étudier les différences entre 2 souches de souris, et une analyse statistique au sein d’un seul groupe donnerait toujours des différences significatives.
   1. Pour comparer deux groupes, utilisez l’ANOVA à 3 facteurs avec le type de stimulation, le temps et la tension de la souris comme facteurs fixes. Lorsque l’ANOVA à 3 facteurs produit un effet significatif des facteurs de tension animale et de type de stimulation, utilisez l’ANOVA à 2 facteurs pour identifier les différences significatives entre 2 groupes à la fois, comme pour la courbe force-fréquence.
4. En cas d’échec de la neurotransmission, utilisez l’ANOVA à 2 facteurs avec la tension animale et le temps comme facteurs fixes. S’il renvoie des résultats significatifs, utilisez plusieurs tests de comparaison pour rechercher des différences statistiques.
   REMARQUE : Étant donné que ce paramètre ne renvoie qu’une seule valeur pour chaque souche de souris, il permet de comparer différents modèles de souris.
5. Pour le poids musculaire, la longueur et l'ASC, utilisez le test Student's t pour étudier les différences lors de la comparaison des préparations muscle-nerf de différents modèles animaux.

Le protocole que nous décrit fournit des informations sur une dénervation fonctionnelle dans plusieurs maladies neuromusculaires ou vieillissement-sarcopénie. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si (et, dans l’affirmative, à quel niveau) altérations musculaires sont dues à des variations sélectives qui se produisent dans le muscle lui-même ou dans la transmission neuromusculaire. Les données présentées ci-dessous sont le résultat d’un travail antérieur de notre groupe18, réalisée sur le modèle de souris transgénique SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique à la phase terminale de la maladie20. La souris transgénique SOD1G93A risque partout la mutant antioxydant enzyme superoxyde dismutase 1 (SOD1). Figures 3 et 4 montrent la dF/dt et les valeurs de force tétanique pour le nerf sciatique-soléaire (à gauche) et les préparatifs du nerf phrénique-diaphragme (à droite). Ces résultats démontrent la capacité de la technique proposée ici pour détecter les défauts fonctionnels dans les muscles transgéniques qui sont reliés aux NMJ par opposition à celles qui sont strictement liées au muscle lui-même. En effet, pour les dF/dt et force tétanique, le muscle soléaire SOD1G93A affiche une diminution de la réponse contractile, comparée à muscle témoin, lorsque stimulé directement et affiche une réduction supplémentaire quand ils sont stimulés par l’intermédiaire du nerf. En revanche, légères modifications ont été observées dans ces deux paramètres lorsque les bandes de muscle diaphragme sont stimulées à travers la membrane, alors que des modifications importantes ont été détectées quand le muscle diaphragme a été stimulé par le nerf.

Figure 3 - Cinétique contractile. Moyenne ± SEM de dF/dt pour les préparations soléaire (A) et le diaphragme (B). Spécimens du soléaire affichent un ralentissement significatif vers le bas quand directement stimulé (-27 %) et une diminution supplémentaire quand ils sont stimulés par l’intermédiaire du nerf (-58 %). Spécimens de diaphragme affichent un ralentissement uniquement lorsque stimulé par le nerf (-30 %). Adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 - Force tétanique. Moyenne ± et tétaniques force spécifique pour les préparations soléaire (A) et le diaphragme (B). Spécimens du soléaire affichent un ralentissement significatif vers le bas quand directement stimulé (-26 %) et une diminution supplémentaire quand ils sont stimulés par l’intermédiaire du nerf (-50 %). Spécimens de diaphragme affichent une diminution de la force seulement lorsque stimulé par le nerf (-44 %). Adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

L’évaluation de la fatigue intratetanic et de l’échec de la neurotransmission permis paramètres spécifiques NMJ à mesurer. La figure 5 illustre les valeurs moyennes de fatigue intratetanic (si) mesurée pendant le paradigme tétaniques fatigue de muscle soléaire (Figure 5 a) et des bandes de diaphragme (Figure 5 b). Comme indiqué dans la section du protocole, le paradigme de fatigue, que nous avons appliqué a été développé de manière à souligner la NMJ cependant pas le muscle. En conséquence, la mesurée pour la stimulation musculaire directe n’a jamais été modifiée. En effet, l’IF calculée pour la stimulation du nerf est le paramètre qui doit être considéré pour les comparaisons entre les souches de souris différents. Nos résultats montrent que l’IF était significativement plus faible dans les soléaires transgéniques et muscles du diaphragme que dans les homologues de contrôle. Cette différence est plus grande dans le diaphragme, dans lequel a été détecté un défaut de petits muscles, et plus petits dans le muscle soléaire, dans lequel les lésions musculaires importants avaient déjà mesuré. Il faut avoir à l’esprit que puisque le muscle soléaire transgénique a été considérablement endommagé, l’évaluation de NMJ n’était correcte jusqu'à 8 min de stimulation, c'est-à-dire le temps que nécessaire pour que le muscle transgénique retourner la valeur nulle de force quand ils sont stimulés. Soléaire transgénique si valeurs après 8 min de stimulation expriment fondamentalement le bruit.

Figure 5 - Fatigue intratetanic. Intratetanic fatigue pour les muscles soléaires (A) et le diaphragme (B) affiche une baisse significative des fonctionnalités NMJ transgéniques. Les valeurs sont moyenne ± SEM. adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 6 illustre l’échec de la neurotransmission à la fréquence tétanique mesurée dans le soléaire (Figure 6 a) et les spécimens de diaphragme (Figure 6 b). En accord avec les résultats de l’IF, aucun vice de neurotransmission n’a décelé dans le muscle soléaire, tandis que les spécimens de muscle diaphragme affichent une augmentation significative dans la fatigabilité de la jonction neuromusculaire.

Figure 6 -Échec de Neurotransmission. Échec de neurotransmission n’affichait pas d’altérations dans les muscles soléaires (A), bien que mis en évidence une diminution significative de la fonctionnalité NMJ dans transgénique diaphragme bandes (B). Les valeurs sont moyenne ± SEM. adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.