Une évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire (NMJ) peut fournir des informations essentielles sur la communication entre le muscle et le nerf. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer globalement les fonctionnalités NMJ tant musculaire à l’aide de deux préparations différentes muscle-nerf, c'est-à-dire soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique.
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Article de méthode
Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Fonctionnalité de la jonction neuromusculaire (NMJ) joue un rôle central dans l’étude des maladies dans lesquelles la communication entre les neurones moteurs et les muscles est altérée, comme le vieillissement et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons ici un protocole expérimental qui peut être utilisé pour mesurer la fonctionnalité NMJ en combinant deux types de stimulation électrique : direct stimulation membrane musculaire et la stimulation du nerf. La comparaison de la réponse du muscle à ces deux stimulations différentes peut aider à définir, au niveau fonctionnel, les altérations éventuelles dans le NMJ qui conduisent à un déclin fonctionnel dans le muscle.
Préparationsx vivo E sont adaptées aux études bien contrôlées. Nous décrivons ici un protocole intensif pour mesurer plusieurs paramètres de muscle et de la fonctionnalité NMJ pour la préparation de nerf sciatique-soléaire et pour la préparation du nerf phrénique-diaphragme. Le protocole dure environ 60 minutes et est réalisé sans interruption au moyen d’une mesure logiciel qui mesure les propriétés cinétiques de contraction, la relation force-fréquence de stimulation musculaire et du système nerveux et deux paramètres spécifiques aux fonctionnalités de NMJ, c'est-à-dire la défaillance de la neurotransmission et la fatigue intratetanic. Cette méthodologie a été utilisée pour détecter des dommages dans les préparations de nerf-muscle soléaire et le diaphragme à l’aide de souris transgéniques SOD1G93A , un modèle expérimental de la SLA qui risque partout la mutant antioxydant enzyme superoxyde dismutase 1 (SOD1).
Introduction
La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse chimique formée par la liaison entre la plaque de serrage moteur de la fibre musculaire et l’axone des motoneurones terminal. Le NMJ s’est avéré jouent un rôle crucial lorsque la communication entre le muscle et le nerf est altérée, comme le vieillissement ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Comme le muscle et le nerf communiquent en voie bidirectionnelle1,2, être capable de mesurer les défauts NMJ séparément des défauts de muscle peut apporter un nouvel éclairage sur leur interaction physiopathologique. En effet, cette évaluation fonctionnelle peut aider à déterminer si des altérations morphologiques ou biochimiques réduisent fonctionnalité de signalisation de la neurotransmission.
La comparaison de la réponse contractile musculaire provoquée par une stimulation nerveuse et la réponse du muscle même évoqué par stimulation directe de sa membrane a été proposée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ. En effet, depuis la neurotransmission membrane stimulation de contournement de signalisation, toutes les différences dans les deux réponses contractiles peuvent être imputés à l’évolution de la NMJ. Cette approche a été largement proposée pour rats3,4,5,6,7et également utilisée pour recueillir des informations sur des souris modèles8,9,10,11,12.
Ici, nous décrivons en détail une procédure permettant d’accise et de tester deux préparations de muscle-nerf, i. e. les préparatifs du soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique. À l’aide de fait à l’ordre logiciel, nous avons conçu un protocole d’analyse continu qui combine la mesure des différents paramètres qui caractérisent la fonctionnalité NMJ et le muscle, réduisant ainsi à une évaluation complète des dommages NMJ séparément de celui du muscle. En particulier, le protocole de mesure de la force de la contraction, la cinétique de muscle, la courbe force-fréquence direct et les stimulations nerveuses, l' échec de neurotransmission13 pour une mise à feu et les fréquences tétaniques et la fatigue intratetanic7.
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université Sapienza de Rome – Unité d'histologie et d'embryologie médicale, et ont été réalisées conformément à la version actuelle de la loi italienne sur la protection des animaux.
1. Dispositif expérimental
- Installer le système expérimental composé d’un actionneur/transducteur, de 2 stimulateurs, d’un appareil musculaire in-vitro, d’un bain de préparation tissulaire, d’une électrode de succion, d’un oscilloscope numérique, d’un stéréomicroscope, d’un éclairage à lumière froide, d’une carte d’acquisition, d’un bloc de connexion et d’un ordinateur personnel.
NOTE : Ici, le logiciel de commande a été programmé en LabView et a été conçu pour garantir une grande flexibilité, précision et reproductibilité des stimulations. Pour chaque stimulation, l’utilisateur peut sélectionner la largeur d’impulsion, la fréquence, la durée, et décider si elle est appliquée à la membrane ou via le nerf. L’utilisateur peut également choisir la durée de la période de repos avant chaque stimulation.
2. Évaluations des propriétés contractiles de la jonction neuromusculaire des muscles soléaire et diaphragme
- Préchauffage du système
- Préparer le tampon de Krebs Ringer14 et le placer dans le bain de l'appareil de montage et dans le bain tissulaire préparatoire. Placer une boîte de 60 mm préparée avec 4 ml de silicone dans le bain tissulaire préparatoire.
- Enclencher le bain d'eau circulant et régler la température à 30 °C pour le muscle soléaire et à 27 °C pour le diaphragme.
- Faire circuler un mélange de 95 % O2 - 5 % CO2 dans les deux bains.
- Enclencher l'actionneur/transducteur et les deux stimulateurs d'impulsion, puis régler les valeurs de courant à 300 mA pour la stimulation membranaire et à 5 mA pour la stimulation nerveuse.
NOTE : Une valeur de courant de 300 mA n'a précédemment induit aucune contraction significative des branches nerveuses lorsque de la D-tubocurarine est ajoutée à la solution15. La valeur de courant de 5 mA correspond à l'intensité nécessaire pour stimuler le muscle via le nerf sans chevauchement avec la stimulation membranaire induite par la solution. Étant donné que la distance entre l'électrode de succion et le muscle dépend de la longueur du nerf, cette valeur de courant doit être soigneusement ajustée avant chaque expérience, comme décrit ci-dessous.
- Disséction du soléaire et du diaphragme
- Sacrifier la souris par dislocation cervicale afin de minimiser les souffrances, puis exciser immédiatement les muscles à tester comme suit.
- Préparation soléaire-sciatique, dissection et montage
- Appliquer de l'éthanol à 70 % sur la patte de la souris et retirer la peau recouvrant la patte. Effectuer une incision dans la partie supérieure de la patte à l'aide d'une paire de ciseaux, puis tirer fermement sur la peau. Isoler le tendon d'Achille du tibia, puis couper le tendon d'Achille avec une paire de ciseaux.
- Fixer solidement le tendon avec une pince et tirer doucement sur le muscle gastrocnémien accompagné du soléaire. Une fois le tendon proximal du soléaire exposé, couper l'ensemble du mollet avec une paire de ciseaux tout en maintenant le tendon d'Achille. Placer immédiatement l'échantillon tissulaire dans le bain tissulaire préparatoire.
- Placer le bain préparatoire sous le stéréomicroscope et fixer le mollet sur la boîte en silicone à l'aide d'épingles en acier inoxydable de 0,20 mm de diamètre. À l'aide d'une pince, saisir le tendon proximal du soléaire et le tirer doucement pour exposer l'innervation sciatique.
- Une fois l'innervation exposée (Figure 1), retirer soigneusement les tissus environnants afin d'exposer environ 5 mm du nerf. Utiliser une fine paire de ciseaux pour couper le nerf. Tout en maintenant fermement le soléaire par le tendon proximal avec une pince, le tirer à nouveau et l'exciser en coupant le tendon d'Achille avec une paire de ciseaux.
- Faire passer un fil de nylon à travers le trou du bras de levier de l'actionneur/transducteur. Former un nœud coulant à l'extrémité du fil et saisir le tendon d'Achille avant de ramener le fil en arrière jusqu'à ce que le muscle atteigne le bain de l'appareil de montage. Fixer le tendon proximal dans la pince fixe et attacher le fil de nylon autour du bras de levier. Laisser le muscle s'équilibrer dans la solution.
- Déterminer la longueur optimale initiale (L0).
- Étirer d'abord le muscle pour le précharger à 10 mN (cette valeur garantit la force maximale de contraction monétique, d'après l'expérience). Ensuite, étirer doucement le muscle pour modifier la précharge et le stimuler à l'aide d'une série d'impulsions simples. La longueur optimale est atteinte lorsque la force maximale de contraction monétique est mesurée.
- Préparation diaphragme-phrénique, dissection et montage
- Appliquer de l'éthanol à 70 % sur la peau de la souris. Retirer la peau recouvrant le muscle du diaphragme en effectuant une incision au-dessus du sternum avec une paire de ciseaux et en tirant fermement sur la peau.
- Avec une paire de ciseaux, couper l'abdomen horizontalement sous le sternum et retirer doucement l'intestin et les organes à l'aide d'une pince. Utiliser une paire de ciseaux robustes pour couper la colonne vertébrale.
- Couper les côtes à environ 1 cm au-dessus du sternum, puis continuer horizontalement. Retirer doucement les organes externes à l'aide d'une pince et couper la colonne vertébrale afin d'obtenir un anneau circulaire de côtes contenant le diaphragme.
- Laver la préparation dans une boîte contenant le tampon de Krebs Ringer, puis la placer dans la boîte en silicone à l'intérieur du bain tissulaire préparatoire, le côté supérieur vers le haut et le sternum orienté vers l'avant.
- À l'aide du stéréomicroscope, retirer soigneusement les poumons et les organes restants ; le nerf phrénique sera visible du côté droit (Figure 2A).
- Rabattre les côtes pour laisser un anneau d'environ 2 mm tout autour du diaphragme.
- À l'aide d'une pince, fixer une épingle en acier inoxydable de 0,20 mm de diamètre sur le tendon central du diaphragme au point correspondant à l'innervation par le nerf phrénique, et une autre épingle sur les côtes alignée sur le même axe afin d'identifier la bande de diaphragme d'intérêt.
- Fixer deux épingles supplémentaires sur le tendon central et deux autres sur les côtes, de chaque côté de la bande sélectionnée, afin de tendre le diaphragme. Si nécessaire, nettoyer le nerf phrénique des tissus conjonctifs environnants à l'aide d'une pince.
- À l'aide d'une lame courbe, couper le diaphragme de chaque côté de l'innervation afin d'isoler une bande tendon-muscle-côtes comme indiqué sur la Figure 2B.
- Faire passer un fil de nylon à travers le trou du bras de levier de l'actionneur/transducteur. Former un nœud coulant à l'extrémité du fil et saisir le tendon avant de ramener le fil en arrière jusqu'à ce que le muscle atteigne le bain de l'appareil de montage.
- Fixer les côtes dans la pince fixe et attacher le fil de nylon autour du bras de levier.
- Laisser le muscle s'équilibrer dans la solution et déterminer la longueur optimale initiale (L0).
- Étirer le muscle pour le précharger à 5 mN. Étirer doucement le muscle pour modifier la précharge et le stimuler à l'aide d'une série d'impulsions simples. La longueur optimale est atteinte lorsque la force maximale de contraction monétique est mesurée.
Figure 1 - Préparation du nerf sciatique-soléaire. Nerf sciatique-soléaire pendant l'opération chirurgicale destinée aux tests fonctionnels. Le nerf sciatique est mis à nu à l’aide d’une paire de pinces. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2 - Préparation du nerf phrénique et du diaphragme. L'image montre une étape de l'excision de la préparation nerf phrénique-diaphragme (A) et la bande destinée à être montée pour les tests fonctionnels (B). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
- Mesure des propriétés de la jonction neuromusculaire indépendamment de la contractilité musculaire
- Régler l'intensité de courant optimale pour la stimulation du nerf et vérifier que les impulsions de courant délivrées par l'électrode de succion n'entraînent pas de contraction musculaire par diffusion du courant dans le bain.
- Placer l'électrode de succion près du muscle et aspirer le nerf à l'intérieur. En augmentant progressivement l'intensité du courant (à partir de 5 mA), stimuler le muscle par une série d'impulsions simples. La valeur d'intensité optimale est déterminée lorsque la force de la contraction est maximale.
- Repousser le nerf hors de l'électrode et délivrer quelques impulsions simples. S'assurer que le muscle ne se contracte pas en raison d'un recouvrement avec la stimulation membranaire par le biais de la solution. Réinsérer le nerf dans l'électrode.
- Lancer le programme et sélectionner le fichier d'entrée pour exécuter le protocole d'essai souhaité.
NOTE : Le fichier d'entrée contient tous les paramètres de stimulation nécessaires à l'exécution complète du protocole. Bien que la même structure de protocole soit utilisée pour les deux muscles, les paramètres de stimulation diffèrent selon que le protocole concerne le muscle soléaire ou le diaphragme.- Stimulation du nerf sciatique-soléaire (voir Tableau 1)
- Utiliser les durées d'impulsion suivantes pour toutes les stimulations électriques : 1,4 ms pour la stimulation du nerf sciatique et 0,1 ms pour la stimulation directe du soléaire. Le protocole complet dure environ 65 min.
- Stimulation du nerf phrénique-diaphragme (voir Tableau 2)
- Utiliser les durées d'impulsion suivantes pour toutes les stimulations électriques : 1,8 ms pour la stimulation du nerf phrénique et 0,2 ms pour la stimulation directe du diaphragme. Le protocole complet dure environ 55 min.
- À la fin du protocole expérimental, mesurer la longueur et la masse humide du muscle à l'aide d'un pied à coulisse analogique avec une précision de 0,05 mm et d'une balance de précision avec une précision de 0,1 mg, respectivement.
- Calculer la section transversale (CSA) en divisant la masse musculaire par le produit de la longueur optimale des fibres (Lf) et de la densité du muscle squelettique des mammifères (1,06 mg/mm3)16.
NOTE : Lf est obtenue en multipliant L0 par le rapport longueur des fibres/longueur du muscle (0,71 pour le muscle soléaire16 et 1 pour le muscle diaphragme17).
- Calculer la section transversale (CSA) en divisant la masse musculaire par le produit de la longueur optimale des fibres (Lf) et de la densité du muscle squelettique des mammifères (1,06 mg/mm3)16.
- Stimulation du nerf sciatique-soléaire (voir Tableau 1)
- Régler l'intensité de courant optimale pour la stimulation du nerf et vérifier que les impulsions de courant délivrées par l'électrode de succion n'entraînent pas de contraction musculaire par diffusion du courant dans le bain.
| Type d'expérience | Fréquence | Durée | Répétitions | Stimulation musculaire ou nerveuse | Objectif |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Muscle | Force et cinétique de la contraction simple | |
| Repos | 30 | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Nerf | ||
| Repos | 30 | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Muscle | ||
| Repos | 30 | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Nerf | ||
| Repos | 120 | ||||
| Tétanos incomplet | 40 | 0,8 | 1 | Nerf | Courbes force/fréquence pour les stimulations nerveuses et musculaires |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 60 | 0,8 | 1 | Muscle | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos complet | 80 | 0,8 | 1 | Nerf | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 20 | 0,8 | 1 | Muscle | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 60 | 0,8 | 1 | Nerf | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos complet | 80 | 0,8 | 1 | Muscle | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 20 | 0,8 | 1 | Nerf | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 40 | 0,8 | 1 | Muscle | |
| Repos | 300 | ||||
| Paradigme de fatigue | 35 | 0,8 | 1 stimulation musculaire suivie de 14 stimulations nerveuses avec un temps de repos de 1,2 s chacun, répété 20 fois | Défaillance de la neurotransmission (NF) | |
| Repos | 900 | ||||
| Paradigme de fatigue | 80 | 0,8 | 1 stimulation musculaire suivie de 14 stimulations nerveuses avec un temps de repos de 1,2 s chacun, répété 20 fois | Défaillance de la neurotransmission (NF) et fatigue intratétanique (IF) | |
Tableau 1 - Protocole de stimulation du nerf sciatique-soléaire. Le tableau énumère la séquence des tests qui constituent le protocole complet pour l'évaluation des préparations nerf sciatique-soléaire.
| Type d'expérience | Fréquence | Durée | Répétitions | Stimulation musculaire ou nerveuse | Objectif |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Muscle | Force et cinétique de la contraction simple | |
| Repos | 30 | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Nerve | ||
| Repos | 30 | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Muscle | ||
| Repos | 30 | ||||
| Contraction simple | Impulsion unique | 1 | Nerve | ||
| Repos | 120 | ||||
| Tétanos incomplet | 60 | 0,5 | 1 | Nerve | Courbes force/fréquence pour les stimulations nerveuse et musculaire |
| Repos | 120 | ||||
| Tétanos complet | 100 | 0,5 | 1 | Muscle | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 40 | 0,5 | 1 | Nerve | |
| Repos | 120 | ||||
| Tétanos incomplet | 20 | 0,5 | 1 | Muscle | |
| Repos | 120 | ||||
| Tétanos incomplet | 80 | 0,5 | 1 | Nerve | |
| Repos | 150 | ||||
| Tétanos incomplet | 80 | 0,5 | 1 | Muscle | |
| Repos | 150 | ||||
| Tétanos incomplet | 20 | 0,5 | 1 | Nerve | |
| Repos | 120 | ||||
| Tétanos complet | 100 | 0,5 | 1 | Muscle | |
| Repos | 150 | ||||
| Tétanos complet | 100 | 0,5 | 1 | Nerve | |
| Repos | 180 | ||||
| Tétanos incomplet | 60 | 0,5 | 1 | Muscle | |
| Repos | 300 | ||||
| Protocole de fatigue | 35 | 0,33 | 1 stimulation musculaire suivie de 14 stimulations nerveuses avec un temps de repos de 0,67 s chacun, répété 20 fois | Défaillance de la neurotransmission (NF) | |
| Repos | 900 | ||||
| Protocole de fatigue | 80 | 0,33 | 1 stimulation musculaire suivie de 14 stimulations nerveuses avec un temps de repos de 0,67 s chacun, répété 20 fois | Défaillance de la neurotransmission (NF) et fatigue intratétanique (IF) | |
Tableau 2 - Protocole de stimulation du nerf phrénique-diaphragme. Le tableau énumère la séquence des tests qui constituent le protocole complet pour l'évaluation des préparations nerf phrénique-diaphragme.
3. Analyse des données
REMARQUE : À la fin du protocole, calculez tous les paramètres souhaités comme suit.
- À partir de la stimulation par impulsion unique
- Calculer la force de contraction (mN ; force active maximale générée pendant la contraction) et la force de contraction spécifique (mN/mm)2). Calculez-la en soustrayant la valeur initiale de précharge de la force maximale générée par le muscle. Calculez la force de contraction spécifique comme le rapport entre la force de contraction et la section transversale du muscle (CSA).
- Calculer le temps pour atteindre la tension maximale (TTP) (ms) comme étant l'intervalle entre le relâchement de l'impulsion et la force de contraction.
- Calculer le temps de demi-relaxation (1/2RT) (ms) comme étant le temps nécessaire pour passer de la force maximale du tétanos à 50 % de cette force.
- Calculer dF/dt (mN/ms) comme la valeur maximale de la dérivée de la force pendant la phase de contraction.
- Calculer -dF/dt (mN/ms) comme la valeur maximale de la dérivée de la force pendant la phase de relâchement.
- À partir de stimulations par trains d'impulsions
- Calculer la force non fusionnée (mN) et la force spécifique non fusionnée (mN/mm2). Calculez-la en soustrayant la valeur initiale de la précharge de la force maximale générée par le muscle. Calculez la force non fusionnée spécifique en divisant la force non fusionnée par la surface de section transversale (CSA) du muscle.
REMARQUE : La force non fusionnée est la force active maximale générée au cours d'une série de stimuli dont la fréquence est inférieure à la fréquence tétrique. - Calculer la force tétrique (mN) et la force tétrique spécifique (mN/mm²) ; la force maximale correspond à la force active maximale générée pendant une série d'impulsions délivrée à la fréquence tétrique. La calculer en soustrayant la valeur initiale de précharge à la force maximale générée par le muscle. Calculer la force tétrique spécifique en divisant la force tétrique par la section transversale anatomique (CSA) du muscle.
- Calculer la courbe force-fréquence. Tracer la valeur de la force (ou de la force spécifique) obtenue pour chaque stimulation en fonction de la fréquence croissante de stimulation. Généralement, celle-ci commence par une stimulation en impulsion unique et se termine par la fréquence tétrique.
- Calculer la force non fusionnée (mN) et la force spécifique non fusionnée (mN/mm2). Calculez-la en soustrayant la valeur initiale de la précharge de la force maximale générée par le muscle. Calculez la force non fusionnée spécifique en divisant la force non fusionnée par la surface de section transversale (CSA) du muscle.
- À partir de paradigmes de fatigue
- Calculer l'échec de la neurotransmission (EN) selon :
où MF est la diminution de force suivant la stimulation musculaire et F est la diminution de force suivant la stimulation nerveuse, mesurée sur la première série d'impulsions après la stimulation musculaire. - Calculer la fatigue intratétanique (IF) selon :
où Flp est la force générée par le muscle lors de la dernière impulsion de stimulation, et Fm est la force maximale générée par le muscle au cours de la même série d'impulsions. Concernant la stimulation nerveuse, calculez la fatigue intratétanique sur la première série d'impulsions immédiatement après la stimulation directe.
- Calculer l'échec de la neurotransmission (EN) selon :
4. Analyse statistique
REMARQUE : Les modèles d'analyse statistique doivent être choisis selon que la réponse musculaire aux stimulations nerveuses et membranaires est comparée au sein du même modèle animal ou entre deux modèles animaux différents18,19.
- Utiliser le test t de Student pour le TTP, 1/2RT, dF/dt et -dF/dt lors de la comparaison uniquement des réponses musculaires aux stimulations directe et indirecte. Lors de la comparaison de préparations musculaires provenant de deux souches de souris différentes, utiliser une ANOVA à deux facteurs avec le type de stimulation et la souche de souris comme facteurs fixes. Lorsque l'ANOVA à deux facteurs donne un résultat significatif, utiliser des tests de comparaisons multiples pour rechercher des différences statistiques.
- Pour la courbe force-fréquence (si l'on compare uniquement les réponses musculaires aux stimulations directe et indirecte), utiliser une ANOVA à deux facteurs avec le type de stimulation et la fréquence de stimulation comme facteurs fixes. Utiliser des tests de comparaisons multiples si nécessaire.
- Lors de la comparaison de préparations musculaires provenant de deux souches de souris différentes, utiliser une ANOVA à trois facteurs avec le type de stimulation, la fréquence de stimulation et la souche de souris comme facteurs fixes.
- Lorsque l'ANOVA à trois facteurs révèle un effet significatif des facteurs souche animale et type de stimulation, utiliser une ANOVA à deux facteurs pour identifier les différences significatives entre deux groupes à la fois. Par exemple, on peut évaluer les différences entre la réponse musculaire des deux groupes à la stimulation membranaire, ou entre les réponses musculaires aux stimulations directe et indirecte au sein d'un même groupe.
- Lors de la comparaison de préparations musculaires provenant de deux souches de souris différentes, utiliser une ANOVA à trois facteurs avec le type de stimulation, la fréquence de stimulation et la souche de souris comme facteurs fixes.
- Fatigue intratétanique
NOTE : Étant donné que le protocole a été conçu pour induire une fatigue en réponse à une stimulation nerveuse même chez les souris témoins, ce paramètre ne peut être utilisé que pour étudier les différences entre deux souches de souris, et une analyse statistique au sein d'un seul groupe donnerait toujours des différences significatives.- Pour comparer deux groupes, utiliser une ANOVA à trois facteurs avec le type de stimulation, le temps et la souche de souris comme facteurs fixes. Lorsque l'ANOVA à trois facteurs révèle un effet significatif des facteurs souche animale et type de stimulation, utiliser une ANOVA à deux facteurs pour identifier les différences significatives entre deux groupes à la fois, comme pour la courbe force-fréquence.
- Pour l'échec de la neurotransmission, utiliser une ANOVA à deux facteurs avec la souche animale et le temps comme facteurs fixes. Si elle donne des résultats significatifs, utiliser des tests de comparaisons multiples pour rechercher des différences statistiques.
NOTE : Étant donné que ce paramètre ne fournit qu'une seule valeur pour chaque souche de souris, il permet de comparer différents modèles de souris. - Pour le poids, la longueur et la CSA du muscle, utiliser le test t de Student pour étudier les différences lors de la comparaison de préparations muscle-nerf provenant de différents modèles animaux.
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Résultats
Le protocole que nous décrit fournit des informations sur une dénervation fonctionnelle dans plusieurs maladies neuromusculaires ou vieillissement-sarcopénie. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si (et, dans l’affirmative, à quel niveau) altérations musculaires sont dues à des variations sélectives qui se produisent dans le muscle lui-même ou dans la transmission neuromusculaire. Les données présentées ci-dessous sont le résultat d’un travail antérieur de notre groupe
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Discussion
Le protocole expérimental décrit ci-dessus est un moyen idéal de mesure et de discriminer les altérations fonctionnelles qui ont eu lieu directement dans le muscle ou indirectement au niveau de la jonction neuromusculaire. Étant donné que cette technique est basée sur une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ, il ne peut servir à établir si tout défaut est lié à des changements morphologiques ou de changements biochimiques. En revanche, il fournit un moyen efficace de déterminer si des modifications morphologiques ou...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Travail en laboratoire des auteurs a été pris en charge par Fondazione Roma et téléthon (subvention no. GGP14066).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Système de levier bimode ; | Aurora Scientific Inc. | Actionneur/transducteur | 300B |
| Stimulateur biphasé haute puissance ; | Aurora Scientific Inc. | Stimulateur d’impulsions | 701B |
| Stimulateur biphasé haute puissance ; | Aurora Scientific Inc. | Stimulateur d’impulsions | 701C |
| Appareil musculaire in vitro ; | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Bain tissulaire préparatoire | Radnoti | 158400 | |
| Électrode d’aspiration monopolaire | A-M Systems | 573000 | avec une référence maison ; |
| Oscilloscope ; | Tektronix | TDS2014 | |
| Stéréomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Illuminateur à lumière froide. | Photonic Optics | PL 3000 | |
| National Instruments | NI PCIe-6353 | ||
| Bloc de connexion | National Instruments | NI 2110 | |
| Ordinateur personnel | AMD Phenom II x4 970 | Processeur 3.50 Ghz avec Windows 7 | |
| Logiciel LabView 2012 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Tampon ; | Sigma-Aldrich | K4002 ; | tampon physiologique |
| Bicarbonate | de sodium Sigma-Aldrich | S5761 ; | |
| Chlorure de calcium CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydre, poudre, &ge ; 97 % |
| Tampon HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | &ge ; 99.5 % (titrage) |
| Plats 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrène |
| Silicone | Sylgard ; | 184 Silicone ; | Kit élastomère 0,5 kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pompe | Newa Mini | MN 606 | pour aquarium |
| Résistance à la chaleur Thermocâble | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Seau | n’importe quel 10 litres | Polypropylène | |
| O2 + 5 %CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps ; | Outils de science fine | 11252-20 | 2 pièces |
| Ciseaux à ressort - Lames de 8 mm | Outils de science fine | 15024-10 | excision |
| nerveuse Ciseaux tranchants ; | Outils de science fine ; | 14059-11 | ablation musculaire |
| Ciseaux délicats | Wagner | 02.06.32 | externe de l’animal |
| Scalpel d’étudiant Manche #3 | Fine Science Tools ; | 91003-12 ; | |
| Lames de scalpel #10 | Outils de science fine ; | 10010-00 | |
| Lames de scalpel #11 | Outils de science fine ; | 10011-00 | |
| fil de nylon & Oslash ; 0,16 mm | n’importe quel |
Références
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
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