Name: Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez l'évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire par préparations ex vivo du muscle soleus et du nerf sciatique. Cette méthode électrophysiologique permet d'étudier les maladies neuromusculaires chez la souris.

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Travail en laboratoire des auteurs a été pris en charge par Fondazione Roma et téléthon (subvention no. GGP14066).

<ol><li>Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bdying-back%26%2334%3B+phenomenon+of+motor+neurons+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The &#34;dying-back&#34; phenomenon of motor neurons in ALS.</a> J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle+Is+a+Primary+Target+of+SOD1G93A-Mediated+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity.</a> Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).</li>
<li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+improve+neuromuscular+transmission+in+the+adult+rat+diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivity-induced+remodeling+of+neuromuscular+junctions+in+rat+diaphragmatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle.</a> Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).</li>
<li>Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+in+rodent+diaphragm+muscle+fibers+vs.+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions.</a> Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).</li>
<li>Van Lunteren, E., Moyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DAP+on+diaphragm+force+and+fatigue%2C+including+fatigue+due+to+neurotransmission+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure.</a> J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).</li>
<li>Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+myasthenia+gravis+on+rat+phrenic+diaphragm+contractile+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance.</a> J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+show+profound+defects+in+neuromuscular+development+even+in+the+absence+of+failure+in+neuromuscular+transmission+or+loss+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons.</a> Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).</li>
<li>Personius, K. E., Sawyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+failure+of+neurotransmission+in+the+diaphragm+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disord%22%5BJournal%5D)">Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice.</a> Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).</li>
<li>Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+myosin+Va+in+the+plasticity+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo.</a> PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).</li>
<li>Chevessier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+congenital+myasthenic+syndrome+due+to+MuSK+mutations+reveals+defects+in+structure+and+function+of+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions.</a> Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).</li>
<li>Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acetylcholinesterase+overexpression+induces+multilevelled+aberrations+in+mouse+neuromuscular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology.</a> J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).</li>
<li>Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+contribution+of+neurotransmission+failure+to+diaphragm+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%28Bethesda%2C+Md%3A+1985%29%22%5BJournal%5D)">Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue.</a> J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).</li>
<li>Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+properties%2C+including+isotonic+fatigue%2C+of+fast+and+slow+MLC%2FmIgf-1+transgenic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle.</a> Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+diaphragm+muscle+strips+from+mdx+and+control+mice+after+clenbuterol+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment.</a> Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).</li>
<li>Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Neuromuscular+Junction+Functionality+in+the+SOD1+G93A+Animal+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng+%22%5BJournal%5D)">Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Ann Biomed Eng . 43, (2015).</li>
<li>Soliani, L. <a target="_blank" href="http://www.dsa.unipr.it/soliani/soliani.html">Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche</a>. , (2004).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole expérimental décrit ci-dessus est un moyen idéal de mesure et de discriminer les altérations fonctionnelles qui ont eu lieu directement dans le muscle ou indirectement au niveau de la jonction neuromusculaire. Étant donné que cette technique est basée sur une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ, il ne peut servir à établir si tout défaut est lié à des changements morphologiques ou de changements biochimiques. En revanche, il fournit un moyen efficace de déterminer si des modifications morphologiques ou...

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse chimique formée par la liaison entre la plaque de serrage moteur de la fibre musculaire et l’axone des motoneurones terminal. Le NMJ s’est avéré jouent un rôle crucial lorsque la communication entre le muscle et le nerf est altérée, comme le vieillissement ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Comme le muscle et le nerf communiquent en voie bidirectionnelle1,2, être capable de mesurer les défauts NMJ séparément des défauts de muscle peut apporter un nouvel éclairage sur leur interaction physiopathologique. En effet, cette évaluation fonctionnelle peut aider à déterminer si des altérations morphologiques ou biochimiques réduisent fonctionnalité de signalisation de la neurotransmission.
La comparaison de la réponse contractile musculaire provoquée par une stimulation nerveuse et la réponse du muscle même évoqué par stimulation directe de sa membrane a été proposée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ. En effet, depuis la neurotransmission membrane stimulation de contournement de signalisation, toutes les différences dans les deux réponses contractiles peuvent être imputés à l’évolution de la NMJ. Cette approche a été largement proposée pour rats3,4,5,6,7et également utilisée pour recueillir des informations sur des souris modèles8,9,10,11,12.
Ici, nous décrivons en détail une procédure permettant d’accise et de tester deux préparations de muscle-nerf, i. e. les préparatifs du soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique. À l’aide de fait à l’ordre logiciel, nous avons conçu un protocole d’analyse continu qui combine la mesure des différents paramètres qui caractérisent la fonctionnalité NMJ et le muscle, réduisant ainsi à une évaluation complète des dommages NMJ séparément de celui du muscle. En particulier, le protocole de mesure de la force de la contraction, la cinétique de muscle, la courbe force-fréquence direct et les stimulations nerveuses, l' échec de neurotransmission13 pour une mise à feu et les fréquences tétaniques et la fatigue intratetanic7.

<table><tbody><tr><td>Système de levier bimode&nbsp ;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Actionneur/transducteur</td> <td>300B</td></tr><tr><td>Stimulateur biphasé haute puissance&nbsp ;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Stimulateur d’impulsions</td> <td>701B</td> (nerf)</tr><tr><td>Stimulateur biphasé haute puissance&nbsp ;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Stimulateur d’impulsions</td> <td>701C</td> (muscle)</tr><tr><td>Appareil musculaire in vitro&nbsp ;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>800A</td><td></td></tr><tr><td>Bain tissulaire préparatoire</td><td>Radnoti</td><td>158400</td><td></td></tr><tr><td>Électrode d’aspiration monopolaire</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>avec une référence maison&nbsp ;</td></tr><tr><td>Oscilloscope&nbsp ;</td><td>Tektronix</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 800</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur à lumière froide.</td>Carte d’acquisition <td>Photonic Optics</td><td>PL 3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6353</td><td></td></tr><tr><td>Bloc de connexion</td><td>National Instruments</td><td>NI 2110</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur personnel</td><td>AMD Phenom II x4 970</td><td></td><td>Processeur 3.50 Ghz avec Windows 7</td></tr><tr><td>Logiciel LabView 2012</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer Bicarbonate Tampon&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4002&nbsp ;</td><td>tampon physiologique</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S5761&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>anhydre, poudre, &ge ; 97 %</td></tr><tr><td>Tampon HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>&ge ; 99.5 % (titrage)</td></tr><tr><td>Plats 60mm x 15mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Polystyrène</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Sylgard&nbsp ;</td><td>184 Silicone&nbsp ;</td><td>Kit élastomère 0,5 kg.</td></tr><tr><td>Thermostat</td><td>Dennerle</td><td>DigitalDuomat 1200</td><td></td></tr><tr><td>Pompe</td><td>Newa Mini</td><td>MN 606</td><td>pour aquarium</td></tr><tr><td>Résistance à la chaleur Thermocâble</td><td>Lucky Reptile</td><td>61403-1</td><td>50/60Hz 50W</td></tr><tr><td>Seau</td><td>n’importe quel 10 litres</td><td></td><td>Polypropylène</td></tr><tr><td>O2 + 5 %CO2</td><td>siad</td><td></td><td>Mix gas</td></tr><tr><td>#5 Forceps&nbsp ;</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-20</td><td>2 pièces</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort - Lames de 8 mm</td><td>Outils de science fine</td><td>15024-10</td><td>excision</td></tr><tr><td>nerveuse Ciseaux tranchants&nbsp ;</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>14059-11</td><td>ablation musculaire</td></tr><tr><td>Ciseaux délicats</td><td>Wagner</td><td>02.06.32</td><td>externe de l’animal</td></tr><tr><td>Scalpel d’étudiant Manche #3</td><td>Fine Science Tools&nbsp ;</td><td>91003-12&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel #10</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel #11</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>fil de nylon & Oslash ; 0,16 mm</td><td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Fonctionnalité de la jonction neuromusculaire (NMJ) joue un rôle central dans l’étude des maladies dans lesquelles la communication entre les neurones moteurs et les muscles est altérée, comme le vieillissement et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons ici un protocole expérimental qui peut être utilisé pour mesurer la fonctionnalité NMJ en combinant deux types de stimulation électrique : direct stimulation membrane musculaire et la stimulation du nerf. La comparaison de la réponse du muscle à ces deux stimulations différentes peut aider à définir, au niveau fonctionnel, les altérations éventuelles dans le NMJ qui conduisent à un déclin fonctionnel dans le muscle.
Préparationsx vivo E sont adaptées aux études bien contrôlées. Nous décrivons ici un protocole intensif pour mesurer plusieurs paramètres de muscle et de la fonctionnalité NMJ pour la préparation de nerf sciatique-soléaire et pour la préparation du nerf phrénique-diaphragme. Le protocole dure environ 60 minutes et est réalisé sans interruption au moyen d’une mesure logiciel qui mesure les propriétés cinétiques de contraction, la relation force-fréquence de stimulation musculaire et du système nerveux et deux paramètres spécifiques aux fonctionnalités de NMJ, c'est-à-dire la défaillance de la neurotransmission et la fatigue intratetanic. Cette méthodologie a été utilisée pour détecter des dommages dans les préparations de nerf-muscle soléaire et le diaphragme à l’aide de souris transgéniques SOD1G93A , un modèle expérimental de la SLA qui risque partout la mutant antioxydant enzyme superoxyde dismutase 1 (SOD1).

Le protocole que nous décrit fournit des informations sur une dénervation fonctionnelle dans plusieurs maladies neuromusculaires ou vieillissement-sarcopénie. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si (et, dans l’affirmative, à quel niveau) altérations musculaires sont dues à des variations sélectives qui se produisent dans le muscle lui-même ou dans la transmission neuromusculaire. Les données présentées ci-dessous sont le résultat d’un travail antérieur de notre groupe<sup class...

Une évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire (NMJ) peut fournir des informations essentielles sur la communication entre le muscle et le nerf. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer globalement les fonctionnalités NMJ tant musculaire à l’aide de deux préparations différentes muscle-nerf, c'est-à-dire soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire au moyen d'une approche expérimentale ex vivo. Cela est réalisé en stimulant la préparation du nerf musculaire de deux façons : directement sur la membrane musculaire et par l'intermédiaire du nerf. Étant donné que la stimulation membranaire contourne la signalisation de la transmission neurogène, toute différence entre les deux réponses contractiles peut être considérée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire.Ici, nous présentons cette procédure sur une préparation du nerf sciatique du muscle soléaire. Le muscle est disséqué conjointement avec son nerf et placé dans un bain tissulaire perfusé. Il est fixé à un contrôleur de force et de longueur, et une paire d'électrodes en platine est positionnée parallèlement au muscle.Une électrode de succion en verre est ensuite approchée de l'extrémité coupée du nerf. Un protocole d'essai complet est alors appliqué afin d'évaluer minutieusement à la fois la jonction neuromusculaire et la fonction musculaire. La connexion fonctionnelle entre le muscle et le nerf est concluante pour la partie et les deux fractions survivantes.Dans la première région du niveau de chacun des deux tissus, les cellules communiquent au niveau de la jonction neuromusculaire, qui présente normalement une morphologie en plaque motrice. Toutefois, dans plusieurs conditions pathologiques, l'interaction fonctionnelle entre le muscle et le nerf est gravement compromise et la jonction neuromusculaire perd son organisation morphologique complexe. L'objectif général de notre protocole est d'étudier la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire en utilisant une approche expérimentale ex vivo.Cela est réalisé en stimulant la préparation du nerf musculaire de deux manières : l'une en stimulant directement la membrane musculaire, l'autre en stimulant le nerf afin d'analyser les propriétés musculaires. Allumez le bain-marie à circulation d'eau et réglez la température à 30 degrés Celsius.Remplissez le bain avec la solution de Krebs-Ringer. Laissez passer une pression de 0,4 bar de mélange gazeux à travers l'oxitube et dans le bain. Allumez le transducteur de l'actuateur et les deux stimulateurs à impulsions.Régler les valeurs de courant à 300 millions de paires pour la stimulation membranaire et à cinq millions de paires pour la stimulation nerveuse. Après avoir sacrifié la souris par dislocation cervicale, retirer la peau des pattes. Couper maintenant le tendon d'Achille et, tout en pinçant fermement le tendon, tirer ensemble vers le haut le muscle gastrocnémien et le muscle soléaire.Une fois le tendon proximal du muscle soléaire exposé, sectionner l'ensemble du mollet au-dessus de ce tendon et placer rapidement l'échantillon dans le bain tissulaire préparatoire situé sous le microscope stéréo. À l'aide d'une paire de forceps, pincer fermement le tendon proximal du soléaire et tirer doucement pour exposer l'innervation sciatique. Une fois l'innervation exposée, retirer les tissus environnants afin de dégager environ cinq millimètres du nerf.Ensuite, utilisez une paire de ciseaux fins pour couper délicatement le nerf. Terminez l'excision du muscle et du nerf en sectionant le tendon d'Achille afin de séparer le muscle soléaire du gastrocnémien. Le prélèvement musculo-nerveux est maintenant prêt à être monté sur l'appareil de test.Créez un nœud coulant à l'extrémité du fil de nylon et serrez-le autour du tendon d'Achille. Fixez le tendon proximal dans la pince fixe et attachez le fil de nylon au bras de levier du capteur de force. Laissez le muscle s'équilibrer dans la solution.Pour déterminer la longueur initiale optimale, stimulez le muscle à l'aide d'une série d'impulsions simples tout en modifiant délicatement la valeur de la charge de fluage. La longueur optimale est atteinte lorsque la force de contraction est maximale. Placez les électrodes à aspiration près du muscle et introduisez le nerf à l'intérieur.Ensuite, tout en modifiant délicatement la valeur du courant de stimulation, stimulez le muscle à l'aide d'une série d'impulsions simples. La force de contraction provoquée par le muscle lorsqu'il est stimulé par le nerf doit être égale aux valeurs mesurées lors de la stimulation directe sur la membrane. Une fois la valeur optimale de courant déterminée, retirez le nerf de l'électrode et appliquez quelques impulsions de courant.Si l'intensité du courant précédemment sélectionnée est excessive, les impulsions de courant délivrées par l'électrode d'aspiration provoquent la contraction musculaire en conduisant le courant à travers le bain. À l'aide d'un logiciel conçu par nos soins, nous avons mis au point un protocole de test automatisé pour l'étude de la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire du muscle soléaire. Le protocole dure environ 65 minutes et se compose de quatre parties différentes.Dans la première partie, le muscle est stimulé par quatre impulsions simples : deux appliquées directement et deux transmises par le nerf. Le temps pour atteindre le pic, le temps de demi-relâchement, la valeur maximale de la dérivée de la force et la force du sursaut sont ensuite mesurés à partir des réponses de sursaut.Dans la deuxième partie, le muscle est stimulé à l’aide d’une série d’impulsions allant de 20 hertz à 80 hertz, qui correspond à la fréquence tétrique. Pour calculer les courbes force-fréquence, des stimulations nerveuses et directes sont utilisées. Dans la troisième et la quatrième partie du protocole, le muscle est soumis à deux paradigmes de fatigue afin de mesurer l’échec de la transmission neuro-musculaire et la fatigue intra-tétrique.Au cours de ces paradigmes de fatigue, le muscle est stimulé en continu par une série d'impulsions délivrée sur la membrane, suivie de 14 séries d'impulsions délivrées par le nerf. La séquence entière est répétée 20 fois. Le premier paradigme est appliqué à une fréquence de décharge de 35 hertz.Le second à la fréquence tétanique de 80 hertz. On pense que l'échec de la transmission neuro-musculaire joue un rôle important dans le développement de la fatigue, car il est lié au blocage externe de la propagation du potentiel d'action, à la diminution de la libération du neurotransmetteur et à la diminution de l'excitabilité de la plaque motrice et de la capacité de la jonction neuromusculaire à résister à la fatigue. Un autre aspect de la capacité de la jonction neuromusculaire à résister à la fatigue est clairement exprimé par la fatigue intratétanique, qui est une estimation de la capacité du muscle à maintenir la force pendant une contraction tétanique unique et qui reflète la fatigue à haute fréquence.À la fin du protocole, la longueur nette et le poids du muscle sont mesurés à l’aide d’un pied à coulisse analogique et d’une balance de précision afin de calculer la section transversale musculaire. Des études menées sur le modèle murin transgénique SOD1 de la sclérose latérale amyotrophique ont mis en évidence le potentiel de cette méthodologie. En effet, les muscles soléaires transgéniques présentent une réponse contractile réduite, tant pour la dérivée de la force que pour la force tétrique, lorsqu’ils sont stimulés directement, et une réduction encore plus marquée lorsqu’ils sont stimulés par le nerf.En ce qui concerne par exemple la force tétrique, ces expériences ont montré que la contractilité musculaire représente 25 % des lésions, tandis qu'une part supplémentaire de 45 % est liée à des défauts de la transmission neuro-musculaire. Un autre point intéressant est l'absence de différence dans les muscles témoins lorsqu'ils sont stimulés directement ou indirectement. Cette observation démontre que la méthodologie n'induit aucun artefact technique, puisque la jonction neuromusculaire est censée être pleinement fonctionnelle chez les animaux témoins.En ce qui concerne la fatigue intratétanique, les résultats ont montré des valeurs significativement plus faibles dans les muscles soléaires transgéniques par rapport à leurs homologues contrôles. Fait intéressant, le muscle soléaire transgénique est significativement endommagé par une stimulation répétée, ce qui signifie que la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire peut être évaluée pendant une durée maximale de stimulation de huit minutes. Après huit minutes, le muscle transgénique retrouve une valeur de force presque nulle lorsqu'il est stimulé.Après avoir visionné la vidéo, vous devriez avoir compris comment mesurer la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire et du muscle soléaire de la souris. Étant donné que cette technique repose sur une mesure indirecte de la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire, elle ne permet pas de déterminer si les anomalies observées sont liées à des modifications morphologiques ou biochimiques. En revanche, cette approche constitue un moyen essentiel pour évaluer si ces agressions affectent la fonctionnalité du signal de transmission neuro-musculaire.Enfin, la proposition de protocole peut être facilement adoptée pour mesurer la fonctionnalité des jonctions neuromusculaires du diaphragme, un autre muscle souvent impliqué dans des maladies pathologiques.

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Le protocole décrit dans cet article utilise le muscle levator auris longus (LAL) souris pour enregistrer spontanée et évoquée par le nerf des potentiels post-synaptiques (courant-clamp) et des courants (voltage clamp) à la jonction neuromusculaire. Utilisation de cette technique peut éclairer les clés dans les mécanismes de la transmission synaptique dans des conditions normales et la maladie.

Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage

La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier

Nous décrivons une méthode pour générer des unités motrices humaines dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce en co-cultivant des motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme avec des myotubes primaires dérivés de mésoangioblastes humains, ce qui entraîne la formation de jonctions neuromusculaires fonctionnellement actives.

Génération d’unités motrices humaines avec des jonctions neuromusculaires fonctionnelles dans des dispositifs microfluidiques

Ce protocole décrit une méthode d’analyse morphométrique des jonctions neuromusculaires par microscopie confocale et STED combinée qui est utilisée pour quantifier les changements pathologiques dans les modèles murins de SMA et de CMS liés à ColQ.

Caractérisation des jonctions neuromusculaires chez la souris par microscopie confocale et super-résolution combinée

Nous décrivons un système d’imagerie reproductible, automatisé et impartial pour caractériser la fonction de la jonction neuromusculaire à l’aide de tissus musculaires squelettiques et de motoneurones optogénétiques. Ce système permet la quantification fonctionnelle de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et détecte la diminution de la fonction neuromusculaire causée par les neurotoxines et la myasthénie grave du sérum du patient.

Ingénierie et caractérisation d’un modèle optogénétique de la jonction neuromusculaire humaine

Le protocole montre une méthode pour examiner la corrélation spatiale entre les terminaux pré-synaptiques, les récepteurs post-synaptiques et les cellules de Schwann péri-synaptiques dans le muscle gastrocnémien médian du rat en utilisant l’immunohistochimie fluorescente avec différents biomarqueurs, à savoir le neurofilament 200, le transporteur vésiculeux d’acétylcholine, l’alpha-bungarotoxine et S100.

Visualiser les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire dans le muscle gastrocnémien médian du rat

Dans cette étude, nous démontrons un protocole d’électromyographie à fibre unique (SFEMG) affiné pour permettre la mesure in vivo de la transmission de la jonction neuromusculaire (JNM) dans des modèles de rongeurs. Une approche étape par étape de la technique SFEMG est décrite pour permettre la quantification de la variabilité et de l’échec de la transmission de la JNM dans le muscle gastrocnémien du rat.

Électromyographie monofibre stimulée (SFEMG) pour l’évaluation de la transmission des jonctions neuromusculaires dans des modèles de rongeurs

Découvrez l'évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire par préparations ex vivo du muscle soleus et du nerf sciatique. Cette méthode électrophysiologique permet d'étudier les maladies neuromusculaires chez la souris.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

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