Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire au moyen d'une approche expérimentale ex vivo. Cela est réalisé en stimulant la préparation du nerf musculaire de deux façons : directement sur la membrane musculaire et par l'intermédiaire du nerf. Étant donné que la stimulation membranaire contourne la signalisation de la transmission neurogène, toute différence entre les deux réponses contractiles peut être considérée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire.

Ici, nous présentons cette procédure sur une préparation du nerf sciatique du muscle soléaire. Le muscle est disséqué conjointement avec son nerf et placé dans un bain tissulaire perfusé. Il est fixé à un contrôleur de force et de longueur, et une paire d'électrodes en platine est positionnée parallèlement au muscle.

Une électrode de succion en verre est ensuite approchée de l'extrémité coupée du nerf. Un protocole d'essai complet est alors appliqué afin d'évaluer minutieusement à la fois la jonction neuromusculaire et la fonction musculaire. La connexion fonctionnelle entre le muscle et le nerf est concluante pour la partie et les deux fractions survivantes.

Dans la première région du niveau de chacun des deux tissus, les cellules communiquent au niveau de la jonction neuromusculaire, qui présente normalement une morphologie en plaque motrice. Toutefois, dans plusieurs conditions pathologiques, l'interaction fonctionnelle entre le muscle et le nerf est gravement compromise et la jonction neuromusculaire perd son organisation morphologique complexe. L'objectif général de notre protocole est d'étudier la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire en utilisant une approche expérimentale ex vivo.

Cela est réalisé en stimulant la préparation du nerf musculaire de deux manières : l'une en stimulant directement la membrane musculaire, l'autre en stimulant le nerf afin d'analyser les propriétés musculaires. Allumez le bain-marie à circulation d'eau et réglez la température à 30 degrés Celsius.

Remplissez le bain avec la solution de Krebs-Ringer. Laissez passer une pression de 0,4 bar de mélange gazeux à travers l'oxitube et dans le bain. Allumez le transducteur de l'actuateur et les deux stimulateurs à impulsions.

Régler les valeurs de courant à 300 millions de paires pour la stimulation membranaire et à cinq millions de paires pour la stimulation nerveuse. Après avoir sacrifié la souris par dislocation cervicale, retirer la peau des pattes. Couper maintenant le tendon d'Achille et, tout en pinçant fermement le tendon, tirer ensemble vers le haut le muscle gastrocnémien et le muscle soléaire.

Une fois le tendon proximal du muscle soléaire exposé, sectionner l'ensemble du mollet au-dessus de ce tendon et placer rapidement l'échantillon dans le bain tissulaire préparatoire situé sous le microscope stéréo. À l'aide d'une paire de forceps, pincer fermement le tendon proximal du soléaire et tirer doucement pour exposer l'innervation sciatique. Une fois l'innervation exposée, retirer les tissus environnants afin de dégager environ cinq millimètres du nerf.

Ensuite, utilisez une paire de ciseaux fins pour couper délicatement le nerf. Terminez l'excision du muscle et du nerf en sectionant le tendon d'Achille afin de séparer le muscle soléaire du gastrocnémien. Le prélèvement musculo-nerveux est maintenant prêt à être monté sur l'appareil de test.

Créez un nœud coulant à l'extrémité du fil de nylon et serrez-le autour du tendon d'Achille. Fixez le tendon proximal dans la pince fixe et attachez le fil de nylon au bras de levier du capteur de force. Laissez le muscle s'équilibrer dans la solution.

Pour déterminer la longueur initiale optimale, stimulez le muscle à l'aide d'une série d'impulsions simples tout en modifiant délicatement la valeur de la charge de fluage. La longueur optimale est atteinte lorsque la force de contraction est maximale. Placez les électrodes à aspiration près du muscle et introduisez le nerf à l'intérieur.

Ensuite, tout en modifiant délicatement la valeur du courant de stimulation, stimulez le muscle à l'aide d'une série d'impulsions simples. La force de contraction provoquée par le muscle lorsqu'il est stimulé par le nerf doit être égale aux valeurs mesurées lors de la stimulation directe sur la membrane. Une fois la valeur optimale de courant déterminée, retirez le nerf de l'électrode et appliquez quelques impulsions de courant.

Si l'intensité du courant précédemment sélectionnée est excessive, les impulsions de courant délivrées par l'électrode d'aspiration provoquent la contraction musculaire en conduisant le courant à travers le bain. À l'aide d'un logiciel conçu par nos soins, nous avons mis au point un protocole de test automatisé pour l'étude de la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire du muscle soléaire. Le protocole dure environ 65 minutes et se compose de quatre parties différentes.

Dans la première partie, le muscle est stimulé par quatre impulsions simples : deux appliquées directement et deux transmises par le nerf. Le temps pour atteindre le pic, le temps de demi-relâchement, la valeur maximale de la dérivée de la force et la force du sursaut sont ensuite mesurés à partir des réponses de sursaut.

Dans la deuxième partie, le muscle est stimulé à l’aide d’une série d’impulsions allant de 20 hertz à 80 hertz, qui correspond à la fréquence tétrique. Pour calculer les courbes force-fréquence, des stimulations nerveuses et directes sont utilisées. Dans la troisième et la quatrième partie du protocole, le muscle est soumis à deux paradigmes de fatigue afin de mesurer l’échec de la transmission neuro-musculaire et la fatigue intra-tétrique.

Au cours de ces paradigmes de fatigue, le muscle est stimulé en continu par une série d'impulsions délivrée sur la membrane, suivie de 14 séries d'impulsions délivrées par le nerf. La séquence entière est répétée 20 fois. Le premier paradigme est appliqué à une fréquence de décharge de 35 hertz.

Le second à la fréquence tétanique de 80 hertz. On pense que l'échec de la transmission neuro-musculaire joue un rôle important dans le développement de la fatigue, car il est lié au blocage externe de la propagation du potentiel d'action, à la diminution de la libération du neurotransmetteur et à la diminution de l'excitabilité de la plaque motrice et de la capacité de la jonction neuromusculaire à résister à la fatigue. Un autre aspect de la capacité de la jonction neuromusculaire à résister à la fatigue est clairement exprimé par la fatigue intratétanique, qui est une estimation de la capacité du muscle à maintenir la force pendant une contraction tétanique unique et qui reflète la fatigue à haute fréquence.

À la fin du protocole, la longueur nette et le poids du muscle sont mesurés à l’aide d’un pied à coulisse analogique et d’une balance de précision afin de calculer la section transversale musculaire. Des études menées sur le modèle murin transgénique SOD1 de la sclérose latérale amyotrophique ont mis en évidence le potentiel de cette méthodologie. En effet, les muscles soléaires transgéniques présentent une réponse contractile réduite, tant pour la dérivée de la force que pour la force tétrique, lorsqu’ils sont stimulés directement, et une réduction encore plus marquée lorsqu’ils sont stimulés par le nerf.

En ce qui concerne par exemple la force tétrique, ces expériences ont montré que la contractilité musculaire représente 25 % des lésions, tandis qu'une part supplémentaire de 45 % est liée à des défauts de la transmission neuro-musculaire. Un autre point intéressant est l'absence de différence dans les muscles témoins lorsqu'ils sont stimulés directement ou indirectement. Cette observation démontre que la méthodologie n'induit aucun artefact technique, puisque la jonction neuromusculaire est censée être pleinement fonctionnelle chez les animaux témoins.

En ce qui concerne la fatigue intratétanique, les résultats ont montré des valeurs significativement plus faibles dans les muscles soléaires transgéniques par rapport à leurs homologues contrôles. Fait intéressant, le muscle soléaire transgénique est significativement endommagé par une stimulation répétée, ce qui signifie que la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire peut être évaluée pendant une durée maximale de stimulation de huit minutes. Après huit minutes, le muscle transgénique retrouve une valeur de force presque nulle lorsqu'il est stimulé.

Après avoir visionné la vidéo, vous devriez avoir compris comment mesurer la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire et du muscle soléaire de la souris. Étant donné que cette technique repose sur une mesure indirecte de la fonctionnalité de la jonction neuromusculaire, elle ne permet pas de déterminer si les anomalies observées sont liées à des modifications morphologiques ou biochimiques. En revanche, cette approche constitue un moyen essentiel pour évaluer si ces agressions affectent la fonctionnalité du signal de transmission neuro-musculaire.

Enfin, la proposition de protocole peut être facilement adoptée pour mesurer la fonctionnalité des jonctions neuromusculaires du diaphragme, un autre muscle souvent impliqué dans des maladies pathologiques.