Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour l’établissement d’un système in vitro rapide qui soutient la culture tridimensionnelle et la différenciation luminale ultérieure des cellules épithéliales primaires de la prostate.

Résumé

cellules conditionnellement reprogrammées (CRC) fournissent une méthode durable pour la culture cellulaire primaire et la capacité de développer de vastes "biobanques de vie» des patients provenant des lignées cellulaires. Pour de nombreux types de cellules épithéliales, diverses approches en trois dimensions (3D) de la culture ont été décrits qui soutiennent une amélioration de l'état différencié. Alors que CRCs conservent leur engagement lignée du tissu à partir duquel ils sont isolés, ils ne parviennent pas à exprimer un grand nombre de marqueurs de différenciation associés au tissu d'origine lorsqu'elles sont cultivées dans deux conditions (2D) de la culture tridimensionnelle normale. Afin d'améliorer l'application des CRCs patient dérivées pour la recherche sur le cancer de la prostate, un format de culture 3D a été défini qui permet une différenciation rapide (2 semaines au total) luminale des cellules dans les cellules épithéliales prostatiques normales et tumorales dérivées. Ici, un format à base d'insert de filtre est décrit pour la culture et la différenciation des deux CRCs de la prostate normales et malignes. A deDescription queue des procédures requises pour la collecte des cellules et le traitement pour la coloration immunohistochimique et immunofluorescence sont fournis. Collectivement, le format de la culture 3D est décrit, combiné avec les lignes primaires CRC, fournit un moyen important pour High- système modèle débit pour la recherche de la prostate sur la base des échantillons biologiques.

Introduction

L'identification et l'utilisation des thérapies du cancer qui sont personnalisés aux personnes sont un objectif primordial dans la recherche sur le cancer. Récemment, de nouvelles approches ont été développées qui permettent une plus grande facilité dans la mise en place de cultures de cellules primaires, ce qui pourrait fournir des moyens à la fois identifier et tester des thérapies personnalisées. Par exemple, la prostate à base de R-spondine approche organoïde ¹ permet en trois dimensions (3D) la culture des cellules cancéreuses de la prostate normales et métastatiques dans une matrice extracellulaire commercial (par exemple,

Protocole

1. Mise en place de la Cellule 3D Culture Système d'insertion

1. Placer les inserts 2 en polycarbonate de culture cellulaire dans une orientation inversée (côté filtre vers le haut) vers le bas dans une plaque de 6 puits (figure 1A).
2. Appliquer une fine couche de gélatine à 0,1% dans de l'eau à la face inférieure de l'insert et laisser sécher (10 à 20 min) dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité.
3. Répétez l'étape 1.2 deux fois de plus pour un total de 3 applications de gélatine à 0,1% sur les inserts.
   NOTE: Le revêtement de gélatine va aider à limiter la diffusion entre les....

Résultats

Le système basé sur insert de culture cellulaire est une procédure relativement simple et rapide pour produire des cultures 3D de la prostate CRCs qui soutient la différenciation des cellules luminale. Un schéma du système est représenté (figure 1A) mettant en évidence l'application de la couche de gélatine sur la surface inférieure de la cartouche filtrante. Les inserts ne sont renversées pour l'application de la gélatine. Dans la figure 1B les .......

Discussion

lignées de cellules primaires sont une plate-forme importante et en développement rapide pour la recherche sur le cancer. Le système de culture 3D basé insert de culture soutient la différenciation des CRC primaires de la prostate dans un délai de deux semaines. La méthode du filtre CRC représente une nouvelle méthode, de débit moyen pour la recherche de la prostate. modèles PDX de souris existantes sont longues et extrêmement coûteux, et beaucoup d'échantillons PDX ne peuvent pas être cultivées en culture, ce qui l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Corning Costar Snapwell Insert de culture	Corning	3801
Inserts de culture cellulaire Millicell	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 puits	Falcon	353046
gélatine 0,1 % dans l’eau	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Scalpel standard stérile 11 lames	Integra Miltex	4411
RIPA Tampon de lyse et d’extraction	Thermofisher Scientific	89900
Fluorure de sodium	Fishcer Scientific	S299-100
Vanadate de sodium	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Cocktail d’inhibiteurs de protéase (AEBSF, aprotinine, béstatine, E-64, leupeptine et pepstatine A)	Sigma-Aldrich	P8340
0,25 % trypsine-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081& nbsp ;
Pénicilline Streptomycine	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Mélange de nutriments	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dichlorhydrate Inhibiteur de roche	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insuline	Thermofisher Scientific	12585-014
Toxine cholérique	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicine	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Réactif	Invitrogen	15596026
Histogel Gel de traitement des échantillons ( agarose hydroxyéthyle (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Pansement non adhérent	Telfa	KDL2132Z
Boîte de culture cellulaire	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Cassettes de traitement / enrobage de tissus	Crystalgen	CG-M492