Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

L'identification et l'utilisation des thérapies du cancer qui sont personnalisés aux personnes sont un objectif primordial dans la recherche sur le cancer. Récemment, de nouvelles approches ont été développées qui permettent une plus grande facilité dans la mise en place de cultures de cellules primaires, ce qui pourrait fournir des moyens à la fois identifier et tester des thérapies personnalisées. Par exemple, la prostate à base de R-spondine approche organoïde ¹ permet en trois dimensions (3D) la culture des cellules cancéreuses de la prostate normales et métastatiques dans une matrice extracellulaire commercial (par exemple, le Matrigel), tandis que la méthode conditionnellement reprogrammant des cellules (CRC) développé à Georgetown ^{2, 3} utilise plus des conditions de culture 2D standard. Plus précisément, la combinaison d'un inhibiteur de la Rho kinase (Y-27632) et de cellules irradiées J2 nourricières de fibroblastes de souris conduit à la mise en culture indéfinie CRCs de kératinocytes ^2. La méthodologie CRC estextrêmement robuste, avec des lignées cellulaires primaires avec succès établies et maintenues indéfiniment de la prostate et d'autres tissus épithéliaux normaux et malins ^3. Surtout, notre technologie CRC a permis l'identification rapide de la base étiologique de papillomatose respiratoire récurrente chez un patient qui avait échoué un certain nombre de traitements médicamenteux précédents. En outre, en utilisant CRCs normales et tumorales dérivées, l'identification réussie d'un médicament approuvé par la FDA, le vorinostat, a été faite dans les deux semaines de la biopsie initiale du tissu. Le patient a été placé sur le vorinostat, ce qui entraîne le traitement réussi de la maladie ^4.

La glande prostatique normale est constituée d'luminale, la base et les rares cellules neuroendocrines ^5. luminale des cellules forment la couche épithéliale de la glande et expriment le récepteur d'androgène (AR), ainsi que d'autres marqueurs tels que luminal cytokératines 8 et 18 et proantigène spécifique de l' état (PSA) ^6. A l' inverse, les cellules basales sont localisés sous la couche luminale et expriment la cytokératine 5 et p63, mais de faibles niveaux de l'AR ^5. Nous ^{7, 8, 9} et ¹⁰ autres ont utilisé avec succès CRC de la prostate dans précliniques mécanistes enquêtes de sensibilité aux médicaments. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de culture tissulaire standard 2D, ces cellules ne parviennent pas à engager pleinement un EA de signalisation ^10. Il est important, lorsqu'il est placé sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, le CRC a repris l'architecture glandulaire de la prostate normale et la fonction indiquant que les CRC de la prostate conservent leur engagement de lignage lorsqu'il est placé dans un environnement permissif. La mise au point du système de culture de cellules à base d'insert de filtre décrit ici permet aux rapides (2 semaines) la différenciation in vitro de CRCs de la prostate comme le montre by l'augmentation de l'expression des gènes cibles et AR AR ainsi qu'une diminution des niveaux de p63.

Les éléments filtrants utilisés contiennent des membranes de polycarbonate (taille des pores 0,4 um) qui peuvent supporter la culture de cellules de mammifères. Le système, tel que développé, utilise des CRCs de la prostate normales et malignes, des boîtes de culture de 6 puits et les éléments filtrants. Milieux de culture cellulaire conditionnés par des cellules J2 ¹¹ est placé dans les médias de fond la chambre et de la prostate différenciation dans la chambre supérieure. Les techniques décrites ici soutiennent la différenciation des cellules de la prostate luminale dans un délai de 2 semaines, compatible avec les objectifs de la médecine personnalisée. Il était également impératif de développer des méthodes qui permettent le profilage moléculaire, génétique et cellulaire complète des cultures. Approches pour isoler l'ADN, l'ARN et des protéines à partir de cellules libérées de la surface du filtre ont été développés et rationalisé pour la répétition exacte de traitement des échantillons. Finally, la méthodologie nécessaire pour retirer le filtre pour permettre l'incorporation, sectionner et pour H & E, immunohistochimique et immunofluorescence, est entièrement décrite.

1. Mise en place de la Cellule 3D Culture Système d'insertion

1. Placer les inserts 2 en polycarbonate de culture cellulaire dans une orientation inversée (côté filtre vers le haut) vers le bas dans une plaque de 6 puits (figure 1A).
2. Appliquer une fine couche de gélatine à 0,1% dans de l'eau à la face inférieure de l'insert et laisser sécher (10 à 20 min) dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité.
3. Répétez l'étape 1.2 deux fois de plus pour un total de 3 applications de gélatine à 0,1% sur les inserts.
   NOTE: Le revêtement de gélatine va aider à limiter la diffusion entre les chambres.
4. Pour recueillir les CRC primaires des conditions de culture standard, ajouter 5 ml de PBS pour laver le flacon de culture.
   1. Trypsiniser les cellules en utilisant 1 ml (pour un T-25 et de 2 ml pour un T-75) 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Tapoter doucement le côté du flacon pour aider à déloger les cellules. Ensuite, passez à arrêter la réaction de la trypsine et de recueillir les cellules en ajoutant 5 ml de DMEM complet.
   2. Collecte les cellules dans un tube de 15 ml. Centrifuger le tube à 4 ° C et 188 xg et compter l'aide d'un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.
   3. Re-suspendre 600.000 CRC dans 250 pi médias (CM) conditionnés et ajouter à la orientée correctement (côté filtre vers le bas) culture insert (figure 1B). Ceci est désigné comme la chambre intérieure.
      Note: CM-F milieux conditionnés par des cellules irradiées J2 et contient 10 um Y-27632 comme décrit précédemment ^{7, 8, 9, 11.}
5. Appliquer 2 ml de CM à la chambre extérieure de la plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit (pendant au moins 18 h).
6. Retirez délicatement le CM sur la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter lentement les médias de différenciation (DM) à la chambre intérieure avec une pipette 1 mL jusqu'au complet. Faites attention à ne pas perturber la couche cellulaire.

1. Vérifiez les cultures tous les jours. Les cellules saines apparaissent comme représenté sur la figure 2.
2. Changer le CM dans la chambre extérieure tous les jours ou tous les deux jours suivant le métabolisme des cellules.
3. Lorsque les médias de l'intérieur de couleur (jaune) change de chambre, retirer délicatement les médias sur la chambre de filtre interne avec un mL 1 ou 200 pi pipette.
4. Aspirer les médias dans la chambre extérieure 6 plaque bien avec une pointe d'aspiration.
5. En utilisant une pipette de 1 mL, appliquer lentement DM frais à la chambre intérieure jusqu'au complet. Veillez à ne pas gratter ou autrement déloger la couche cellulaire.
6. Remplacez le support dans la chambre extérieure avec 2 ml de CM frais.
7. Maintenir les cultures pendant 2 semaines, et ensuite procéder à un traitement pour l'isolement bimoléculaire souhaité.
   NOTE: Chaque ligne de la plaque 6 puits, un total de six inserts (figure 1B), doit être traité par expérience pour acquérir suffisamment de cellules pour DNUn ARN ou d'une protéine pour l'analyse.
8. Aspirer le milieu dans la chambre extérieure et rincer avec 2 ml du tampon phosphate salin (PBS).
9. Retirez délicatement les médias de la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter 500 ul de PBS. Évitez de raclage ou autrement perturber les cellules sur la membrane.
10. Aspirer PBS à partir de la chambre extérieure et retirez le PBS de la chambre intérieure avec un 1 ml ou 200 ul pipette. Une fois que le PBS a été retiré, passez directement à l'application appropriée détaillé ci-dessous. Ne pas laisser la membrane sécher. La culture peut être maintenue brièvement dans le PBS jusqu'à ce que l'application est prête à commencer.

3. Traitement des Filtres pour Pellet Banking

1. Ajouter 100 ul de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque chambre intérieure et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C.
2. En bref et soigneusement agiter / racler les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette de 200 pi pendant pipetage vers le haut et vers le bas (pour éviter puncturation la membrane). Incuber pendant 1 min à 37 ° C.
3. Ajouter 250 ul de CM à la première chambre intérieure et la pipette de haut en bas doucement pour rincer le filtre.
4. Le transfert des cellules remises en suspension dans la chambre de filtre adjacente qui contient les mêmes conditions de presse et répéter pipetage vers le haut et vers le bas.
5. Répétez cette procédure pour chacun des inserts d'une seule condition. Collecter et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml.
6. Rincer chaque chambre intérieure avec un 100-200 ul supplémentaire de CM pour recueillir toutes les cellules restantes. Ajouter au tube de 1,5 ml centrifugeuse à l'étape 3.5.
7. Faire tourner les cellules à 423 x g dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min.
8. Aspirer le surnageant et laver le culot cellulaire une fois avec 1000 ul de PBS.
9. Spin à nouveau à 423 xg dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min.
10. Aspirer PBS et congélation à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. Traitement des filtres à ARN ou ADN Isolation

Le système basé sur insert de culture cellulaire est une procédure relativement simple et rapide pour produire des cultures 3D de la prostate CRCs qui soutient la différenciation des cellules luminale. Un schéma du système est représenté (figure 1A) mettant en évidence l'application de la couche de gélatine sur la surface inférieure de la cartouche filtrante. Les inserts ne sont renversées pour l'application de la gélatine. Dans la figure 1B les filtres sont dans l'orientation appropriée pour la culture. L' utilisation d' un insert de cellule transparente, une image représentative d'une culture de la prostate CRC 3D sain est représenté (10X) (Figure 2). La superposition dense de CRCs sains démontré est typique après l'établissement et peut être visualisé en utilisant la microscopie optique standard. Au cours de l'établissement initial, il est essentiel de visualiser la couche de cellules formées pour faire en sorte que le procédé est compatible avec une lignée cellulaire donnée, et que la fixation appropriée etYering de cellules se sont produits.

HEA est appliquée à l'intérieur de l'insert tel que décrit ci-dessus. Après application de la HEA, des précautions doivent être prises lors marquant le filtre pour le supprimer de l'insert (figures 3A, 3B). Dans toutes les étapes (figures 3A-3D), les soins doit également être exercé pour réduire au minimum les mouvements inutiles de la couche de HEA sur le filtre avec les cellules. La couche CRC peut être facilement perturbé et endommagé pendant le transfert à l'H & E cassette (Figure 3D). Après excision du filtre HEA revêtu du cylindre en matière plastique (figures 3A à 3C), le filtre peut être réduit de moitié et traitée pour sectionner et de coloration en utilisant des cassettes d' encastrement standard (Figure 3D). Fractionnement du filtre dans la moitié est important de maximiser la surface disponible pour la coupe transversale sur H & E et IF.

coloration immunofluorescenteainsi que le champ lumineux (BF) des images des cellules cultivées sur la couche de filtre ont été recueillies à l'aide d'un microscope avec DSU (unité de numérisation du disque) disque rotatif capacités confocale. Des résultats représentatifs pour l' histologie et la coloration H & E sont représentés dans une section transversale de l'insert de filtre et des cellules (20X) (figure 4). Avec des soins appropriés, nous démontrons qu'une couche CRC sur les inserts de filtre peut être sectionné et coloré, comme pratique courante pour l'histologie des tissus. Pendant la coupe, il est possible pour le CRC à se détacher du filtre en tant que couche intacte de cellules comme le montre (Figure 4). L'image BF montre les couches de cellules à plusieurs couches sur le dessus de la membrane poreuse (figure 5A). Les images individuelles fluorescentes pour les noyaux (DAPI, figure 5B), p63 (Figure 5C) et l'AR (Figure 5D) sont représentés, de même que la fusion des trois marqueurs de fluorescence (Figure 5E). Enfin, un composite BF et IF superposition est représenté (figure 5F), l' établissement de la localisation du signal de fluorescence par rapport aux cellules et le filtre. La superposition de la tache DAPI avec le p63 IF coloration démontre clairement certaines cellules encore dans un état prolifératif. La localisation des AR IF coloration dans le noyau est une indication de la réactivation fonctionnelle des AR dans les cellules de la prostate.

Une comparaison entre l'IF du système d'insertion de filtre et d' un tissu de la prostate est représentée en coupe (figures 6A, 6B) afin de démontrer la similitude dans le développement de la couche d'insertion de CRC à celle de l'épithélium de la prostate. Le conduit de la prostate montre l'expression de p63, compatible avec les cellules de la prostate basales. p63 coloration est également observée dans les CRC sur l'insert. Un pourcentage plus élevé de cellules exprimant p63 a été observée dans la pièce rapportée par rapport à la section de tissu intact. En outre, à la fois nucléaire et cytoplasmique AR sont vus dans le tis de la prostate poursuivre la section et tandis que les CRC sur le spectacle d'insertion de filtre expression moins générale des AR, à la fois l'expression d'AR nucléaire et une coloration cytoplasmique est considérée, similaire à la prostate intacte.

Figure 1: Images représentatives du 6 puits Culture Dish et Insert qui constituent le système Culture 3D. (A) des inserts renversées pour l' application du revêtement de gélatine sur la face inférieure du filtre (flèche). Une image plus grande de l'insert et le filtre est show (encadré). (B) inserts correctement placés. Les chambres intérieure et extérieure du système sont représentés (flèches). La ligne en boîte en B montre comment les échantillons multiples sont obtenus pour une condition expérimentale donnée. A la fin de la période de croissance de 2 semaines ces inserts peuvent être regroupés pour donner suffisamment de matériau pour l'analyse."Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: une image représentative d'une couche de santé CRC ensemencée sur un filtre à membrane transparente est montré. Les deux chambres intérieure et extérieure contenaient un milieu conditionné. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: une image représentative d'un filtre en moitiés en deux sections et placé dans une cassette de paraffine pour les Embedding. (A) Filtre insert avec revêtement HEA après avoir marqué et avant l' enlèvement. (B) La cartouche filtrante libéré du cylindre de polycarbonate. ( (D) Le positionnement correct et l' orientation des deux moitiés à l' intérieur de la cassette d'intégration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Section Stained Cross Représentant H & E de l'insert de filtre et de cellules (20X). Tant la membrane (en bas) et la couche de cellule (en haut) sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Une série de Représentant lumineux Champ (BF) et immunofluorescence (IF) Images deLes cellules sectionnées sur le filtre (40X). des coupes transversales du filtre et les cellules sont montrées. Une image BF non colorées des cellules sur la surface du filtre (5A) est accompagné d'images pour le noyau DAPI colorant (5B) et une coloration immunofluorescente pour deux protéines différentes, p63 (5C) et le récepteur androgénique (AR, 5D). Un revêtement composite des sections de cellule (5E, F) qui définit la localisation des signaux IF dans le contexte des cellules et filtre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Un représentant immunofluorescence (IF) Image de cellules sectionnées sur le filtre par rapport à une section de la prostate Epithelium de tissus (20X).Une image en coupe transversale de notre élément filtrant est représenté (figure 6A) par rapport aux couches epitheliales canalaires d'une prostate intacte (figure 6B). La coloration de la p63, l'AR et le noyau a été effectué comme dans la figure 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.