Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

L’objectif global de ce système de culture 3D basé sur des inserts filtrants pour les cellules primaires dérivées de patients est d’établir un système de modèle in vitro plus pertinent sur le plan biologique pour la recherche sur le cancer de la prostate. En utilisant des cellules humaines primaires, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement de la prostate ainsi qu’en cancer de la prostate. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthodologie in vitro relativement rapide pour l’établissement de cellules primaires de la prostate différenciées qui permet également l’isolement rapide de biomolécules telles que l’ARN, l’ADN et les protéines.

La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle car le traitement des cellules sur l’insert filtrant pour l’histologie ou pour la collecte d’ARN et de protéines est délicat et sensible au temps. Pour aider à limiter la diffusion entre les chambres d’une enceinte de sécurité biologique, appliquez une fine couche de gélatine à 0,1 % sur la face inférieure des inserts et laissez-les sécher. Répétez cette procédure deux fois de plus.

Appliquez ensuite les cellules dans la chambre intérieure des inserts enrobés de gélatine et cultivez-les jusqu’à deux semaines. Après deux semaines, appliquez les inserts filtrants de culture directement sur l’une des applications en aval appropriées détaillées dans ce qui suit. Pour commencer cette procédure, aspirez le PBS de la chambre extérieure et retirez soigneusement le PBS de la chambre intérieure.

Les inserts de culture peuvent être conservés brièvement dans du PBS jusqu’à ce que l’application soit prête à commencer, mais ne laissez pas la membrane se dessécher. Ajoutez ensuite 100 microlitres de 0,25 % de trypsine EDTA dans chaque chambre intérieure. Ensuite, incubez-les pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, grattez brièvement et soigneusement les cellules à la surface de la membrane avec une pipette de 200 microlitres tout en pipetant de haut en bas. Ensuite, incubez-les pendant une minute à 37 degrés Celsius. Après une minute, ajoutez 250 microlitres de média conditionné dans la première chambre intérieure et pipetez doucement de haut en bas pour rincer le filtre.

Ensuite, transférez les cellules remises en suspension dans la chambre de filtre adjacente qui contient les mêmes conditions de fluide et répétez le pipetage de haut en bas. Répétez cette procédure pour chacune des insertions d’une même condition. Ensuite, collectez les cellules et transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Rincez chaque chambre intérieure avec 100 à 200 microlitres supplémentaires de milieu conditionné pour recueillir toutes les cellules restantes et ajoutez-les dans le tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tourner les cellules dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et lavez une fois la pastille cellulaire avec 1 000 microlitres de PBS.

Faites tourner à nouveau les cellules dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cinq minutes, aspirez le PBS et congelez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Dans cette procédure, ajoutez 200 microlitres de guanidinium, de thiocyanate, de phénol, de chloroforme ou d’un réactif d’extraction similaire dans la chambre interne et agitez brièvement les cellules à la surface de la membrane en pipetant de haut en bas.

Ensuite, incubez les cellules dans le réactif d’extraction pendant cinq minutes à température ambiante et laissez la chambre extérieure sèche. Ensuite, lavez la membrane filtrante en pipetant la solution d’extraction de haut en bas. Recueillez autant de réactif d’extraction que possible en inclinant la plaque à six puits et en aspirant tout liquide résiduel.

Veuillez noter que le filtre peut se dissocier de l’insert. Lavez la membrane filtrante dissociée si elle est fixée. Ensuite, recueillez autant de réactif d’extraction que possible et suivez le protocole du fabricant pour la purification et la récupération de l’ADN, de l’ARN ou des protéines.

Des précautions doivent être prises lors du lavage des cellules et du filtre avec du thiocyanate de guanidinium, car une agitation excessive peut produire un ARN de mauvaise qualité. Afin d’isoler les protéines de l’insert filtrant, placez l’insert filtrant dans la plaque à six puits sur de la glace. Ajoutez ensuite 10 microlitres de tampon de lyse des protéines dans la chambre intérieure.

Agitez et raclez les cellules à la surface de la membrane avec une pipette de 20 microlitres tout en pipetant de haut en bas et évitez de générer des bulles dans le tampon de lyse. Ensuite, incubez la plaque à six puits avec des inserts filtrants sur de la glace pendant dix minutes. Répétez le grattage, puis rincez la surface de la membrane avec le tampon de lyse.

Prélevez les lysats des six inserts et transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre sur de la glace. Ensuite, rincez la première membrane avec 10 microlitres supplémentaires de tampon de lyse et transférez-la dans le filtre suivant. Répétez cette procédure pour tous les inserts d’une condition expérimentale donnée, en recueillant toute solution tampon de lyse résiduelle et ajoutez-la au tube de 1,5 millilitre.

Incuber l’échantillon sur de la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, faites-le tourner à vitesse maximale pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois terminé, pipetez le lysat dans un tube frais de 1,5 millimètre.

Procédez ensuite à l’analyse de la concentration en protéines ou stockez les lysats à moins 80 degrés Celsius. Dans cette procédure, ajoutez 500 microlitres et un millilitre de 10 % NBF dans les chambres intérieure et extérieure respectivement. Incuber-les toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, aspirez le NBF de la chambre extérieure et ajoutez un millilitre de gel de traitement HEA dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Faites fondre lentement l’agarose au micro-ondes à l’aide d’impulsions de faible puissance et répétées pendant 10 secondes jusqu’à ce que l’agarose soit fondue. Conservez le HEA dans un bain chaud à 37 degrés Celsius pour éviter la solidification jusqu’au moment de l’utiliser.

Retirez ensuite le FBN de la chambre intérieure. Appliquez 25 microlitres de HEA fondu dans la chambre intérieure et laissez l’agarose se solidifier pendant deux à cinq minutes. Ensuite, mouillez deux coussinets d’histologie en mousse dans 10 % de FBN et placez un tampon dans une cassette d’enrobage.

La sauvegarde de l’intégrité des couches cellulaires sur l’insert filtrant à l’aide d’HistoGel est une étape critique pour la préservation de la couche cellulaire intacte pour le sectionnement histologique. Après cela, utilisez un scalpel à lame numéro 11 pour marquer le filtre à partir de la face inférieure de la chambre d’insertion en plastique, en le libérant partiellement. Placez 100 à 200 microlitres de FBN dans une boîte de Pétri et plongez le filtre partiellement délogé dans le FBN.

À l’aide d’un scalpel à lame numéro 10, appuyez doucement contre le milieu du filtre depuis l’intérieur de la chambre d’insertion pour déloger complètement le filtre du barillet de l’insert. S’il y a une partie du filtre qui est encore attachée au canon, coupez-la avec le scalpel. Coupez ensuite le filtre revêtu de HEA en deux.

Placez chaque moitié du filtre sur le tampon en mousse de la cassette d’histologie préparée. Ajoutez ensuite la deuxième éponge imbibée de 10 % de NBF dans la cassette, en prenant le filtre en sandwich. Ensuite, fermez la cassette.

Placez-le dans NBF et incubez-le pendant la nuit. Cette image en champ clair montre des strates cellulaires multicouches au-dessus de la membrane poreuse. Les images fluorescentes individuelles pour les noyaux, P63 et le récepteur des androgènes sont montrées, ainsi que la fusion des trois marqueurs de fluorescence.

Enfin, une superposition composite de fond clair et d’immunofluorescence est présentée, établissant la localisation du signal fluorescent par rapport aux cellules et au filtre. Ici, une image en coupe transversale de notre insert filtrant est montrée, comparée aux couches épithéliales canalaires d’une prostate intacte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines, avec une isolation finale des cellules et de l’insert filtrant ou de la biomolécule souhaitée, prenant moins de 30 minutes si elle est effectuée correctement.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de toujours se rappeler de faire preuve de prudence lorsque vous travaillez avec les inserts filtrants, afin de ne pas endommager la couche cellulaire ou le filtre sous-jacent. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que les transferts de Western, les analyses de microréseaux d’ARN et de protéome peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à l’analyse des voies et aux cellules cancéreuses. Cette technique aidera les chercheurs dans le domaine du cancer de la prostate à mieux explorer la biologie de la prostate ainsi que les fondements du cancer de la prostate à l’aide de cellules primaires de la prostate.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une excellente compréhension de la façon de configurer et de récupérer correctement les cellules primaires de la prostate cultivées à partir de ce système de culture 3D.