Name: Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de culture 3D sur inserts filtrants pour différencier rapidement des cellules épithéliales prostatiques primaires. Cette technique permet l'isolation efficace d'ARN, d'ADN et de protéines pour la recherche sur le cancer de la prostate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été soutenue par T32 (CA 9686-18) et TL1 (TL1TR001431) l&#39;attribution des subventions de formation postdoctorale (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), ainsi que U01 PAR-12-095 (Kumar) et P30 CA051008-21 (Weiner). fixation de l&#39;échantillon, sectionner et la coloration a été réalisée dans le Lombardi Comprehensive Cancer Centre histologie et de tissus de ressources partagées. Nous remercions Richard Schlegel pour des discussions utiles. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.

1. Mise en place de la Cellule 3D Culture Système d&#39;insertion <ol><li> Placer les inserts 2 en polycarbonate de culture cellulaire dans une orientation inversée (côté filtre vers le haut) vers le bas dans une plaque de 6 puits (figure 1A). </li><li> Appliquer une fine couche de gélatine à 0,1% dans de l&#39;eau à la face inférieure de l&#39;insert et laisser sécher (10 à 20 min) dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.2 deux fois de plus pour un total de 3 applications de gélatine à 0,1% sur les inserts. NOTE: Le revêtement de gélatine va aider à limiter la diffusion entre les chambres. </li><li> Pour recueillir les CRC primaires des conditions de culture standard, ajouter 5 ml de PBS pour laver le flacon de culture. <ol><li> Trypsiniser les cellules en utilisant 1 ml (pour un T-25 et de 2 ml pour un T-75) 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Tapoter doucement le côté du flacon pour aider à déloger les cellules. Ensuite, passez à arrêter la réaction de la trypsine et de recueillir les cellules en ajoutant 5 ml de DMEM complet. </li><li> Collecte<html> les cellules dans un tube de 15 ml. Centrifuger le tube à 4 ° C et 188 xg et compter l&#39;aide d&#39;un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre. </li><li> Re-suspendre 600.000 CRC dans 250 pi médias (CM) conditionnés et ajouter à la orientée correctement (côté filtre vers le bas) culture insert (figure 1B). Ceci est désigné comme la chambre intérieure. Note: CM-F milieux conditionnés par des cellules irradiées J2 et contient 10 um Y-27632 comme décrit précédemment 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Appliquer 2 ml de CM à la chambre extérieure de la plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit (pendant au moins 18 h). </li><li> Retirez délicatement le CM sur la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter lentement les médias de différenciation (DM) à la chambre intérieure avec une pipette 1 mL jusqu&#39;au complet. Faites attention à ne pas perturber la couche cellulaire. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Entretien des cultures 3D <ol><li> Vérifiez les cultures tous les jours. Les cellules saines apparaissent comme représenté sur la figure 2. </li><li> Changer le CM dans la chambre extérieure tous les jours ou tous les deux jours suivant le métabolisme des cellules. </li><li> Lorsque les médias de l&#39;intérieur de couleur (jaune) change de chambre, retirer délicatement les médias sur la chambre de filtre interne avec un mL 1 ou 200 pi pipette. </li><li> Aspirer les médias dans la chambre extérieure 6 plaque bien avec une pointe d&#39;aspiration. </li><li> En utilisant une pipette de 1 mL, appliquer lentement DM frais à la chambre intérieure jusqu&#39;au complet. Veillez à ne pas gratter ou autrement déloger la couche cellulaire. </li><li> Remplacez le support dans la chambre extérieure avec 2 ml de CM frais. </li><li> Maintenir les cultures pendant 2 semaines, et ensuite procéder à un traitement pour l&#39;isolement bimoléculaire souhaité. NOTE: Chaque ligne de la plaque 6 puits, un total de six inserts (figure 1B), doit être traité par expérience pour acquérir suffisamment de cellules pour DNUn ARN ou d&#39;une protéine pour l&#39;analyse. </li><li> Aspirer le milieu dans la chambre extérieure et rincer avec 2 ml du tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Retirez délicatement les médias de la chambre intérieure avec un mL 1 ou 200 pi pipette et ajouter 500 ul de PBS. Évitez de raclage ou autrement perturber les cellules sur la membrane. </li><li> Aspirer PBS à partir de la chambre extérieure et retirez le PBS de la chambre intérieure avec un 1 ml ou 200 ul pipette. Une fois que le PBS a été retiré, passez directement à l&#39;application appropriée détaillé ci-dessous. Ne pas laisser la membrane sécher. La culture peut être maintenue brièvement dans le PBS jusqu&#39;à ce que l&#39;application est prête à commencer. </li></ol> 3. Traitement des Filtres pour Pellet Banking <ol><li> Ajouter 100 ul de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque chambre intérieure et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C. </li><li> En bref et soigneusement agiter / racler les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette de 200 pi pendant pipetage vers le haut et vers le bas (pour éviter puncturation la membrane). Incuber pendant 1 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 250 ul de CM à la première chambre intérieure et la pipette de haut en bas doucement pour rincer le filtre. </li><li> Le transfert des cellules remises en suspension dans la chambre de filtre adjacente qui contient les mêmes conditions de presse et répéter pipetage vers le haut et vers le bas. </li><li> Répétez cette procédure pour chacun des inserts d&#39;une seule condition. Collecter et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml. </li><li> Rincer chaque chambre intérieure avec un 100-200 ul supplémentaire de CM pour recueillir toutes les cellules restantes. Ajouter au tube de 1,5 ml centrifugeuse à l&#39;étape 3.5. </li><li> Faire tourner les cellules à 423 x g dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et laver le culot cellulaire une fois avec 1000 ul de PBS. </li><li> Spin à nouveau à 423 xg dans une microcentrifugeuse à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Aspirer PBS et congélation à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Traitement des filtres à ARN ou ADN Isolation <ol&gt; <li> Ajouter 200 pi de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme ou le réactif d&#39;extraction similaire à la chambre intérieure et agiter brièvement les cellules à la surface de la membrane par pipetage vers le haut et vers le bas. </li><li> Incuber dans le réactif d&#39;extraction pendant 5 min à température ambiante avec la chambre extérieure sèche. <ol><li> Comme le filtre peut se dissocier de l&#39;insert, laver la membrane filtrante dissociées par pipetage de la solution d&#39;extraction vers le haut et vers le bas. Recueillir autant du réactif d&#39;extraction possible en inclinant la plaque à 6 puits et aspirer tout liquide résiduel. </li></ol></li><li> Suivre le protocole du fabricant pour la purification et la récupération de l&#39;ADN, l&#39;ARN ou une protéine. </li></ol> 5. Traitement des Filtres pour Protein Isolation <ol><li> Placer la cartouche filtrante dans la plaque à 6 puits sur de la glace. À la chambre intérieure, ajouter 10 ul de tampon de lyse protéine supplémenté avec 1 mM de fluorure de sodium (NaF), 1 mM de vanadate de sodium (NaV), 100 mM dithiothreitol (DTT) et 100 ul d&#39;un cocktail anti-protéase. </li><li> Agiter / gratter les cellules sur la surface de la membrane avec une pipette 20 ul pendant le pipetage vers le haut et vers le bas. Éviter de générer des bulles dans le tampon de lyse. </li><li> Incuber la plaque à 6 puits avec des inserts de filtre sur la glace pendant 10 min. </li><li> Répéter le grattage, puis rincer la surface de la membrane avec le tampon de lyse. </li><li> Ramassez les lysats des 6 inserts et transfert à un tube de 1,5 ml centrifugeuse sur la glace. </li><li> Rincer la première membrane avec un 10 pi supplémentaires de tampon de lyse et le transfert à l&#39;autre filtre. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.6 pour tous les inserts, collecte toute solution résiduelle de tampon de lyse et ajouter au tube de 1,5 ml (étape 5.5). </li><li> Incuber l&#39;échantillon sur de la glace pendant 5 minutes supplémentaires. </li><li> Spin à la vitesse maximale (16873 xg dans une centrifugeuse de table) pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Pipette lysat surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Procéder à l&#39;analyse de la concentration en protéine ou store lysats à -80 ° C. </li></ol> 6. Traitement pour H &amp; E et Immuno-coloration <ol><li> Ajouter 500 ul et 1 ml de 10% FBN (neutre de formol tamponné) à la chambre intérieure et extérieure et laisser incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Aspirer le FBN de la chambre extérieure et ajouter 1 mL hydroxyéthyl agarose (HEA) traitement du gel à une centrifugeuse de 1,5 ml. Faire fondre lentement l&#39;agarose dans un micro-ondes en utilisant une faible puissance et répété 10-20 de les impulsions jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose soit fondu. </li><li> Gardez le HEA dans un bain chaud à 37 ° C pour empêcher la solidification jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Retirez la FBN de la chambre intérieure et appliquer 25 ul de HEA fondu à la chambre intérieure et permettre à l&#39;agarose à solidifier pendant 2-5 min. </li><li> Wet pads histologiques 2 de mousse à 10% FBN et placer un tampon dans une cassette incorporation (voir la figure 3D). </li><li> Utilisez une lame scalpel n ° 11 (qui a une lame très forte, pointe fine) pour marquer le filtre du côté inférieur de l&#39;insertchambre, en libérant partiellement de la chambre d&#39;insertion en plastique. </li><li> Placer une petite quantité (100-200 pi) de FBN dans une boîte de Pétri et immerger le filtre partiellement délogé dans la FBN (figure 3A). </li><li> Avec une lame scalpel # 10, appuyez doucement contre le milieu du filtre, de l&#39;intérieur de la chambre d&#39;insertion, pour déloger complètement le filtre de l&#39;insert canon (figure 3B). S&#39;il y a une partie du filtre qui est toujours fixée au canon, rompre avec le scalpel. </li><li> Couper le filtre HEA revêtu en deux avec la lame de scalpel n ° 10 (figure 3C). </li><li> Placer chaque moitié du filtre sur le tampon de mousse dans la cassette d&#39;histologie préparé à l&#39; étape 6.4 (figure 3D). </li><li> Ajouter la seconde 10% FBN éponge imbibée de la cassette, intercalant le filtre. </li><li> Snap sceller la cassette, dans FBN, et incuber pendant la nuit. </li><li> les filtres de processus dans des blocs de paraffine pour sectionner et coloration comme12 décrit précédemment. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

lignées de cellules primaires sont une plate-forme importante et en développement rapide pour la recherche sur le cancer. Le système de culture 3D basé insert de culture soutient la différenciation des CRC primaires de la prostate dans un délai de deux semaines. La méthode du filtre CRC représente une nouvelle méthode, de débit moyen pour la recherche de la prostate. modèles PDX de souris existantes sont longues et extrêmement coûteux, et beaucoup d&#39;échantillons PDX ne peuvent pas être cultivées en culture, ce qui l...

L&#39;identification et l&#39;utilisation des thérapies du cancer qui sont personnalisés aux personnes sont un objectif primordial dans la recherche sur le cancer. Récemment, de nouvelles approches ont été développées qui permettent une plus grande facilité dans la mise en place de cultures de cellules primaires, ce qui pourrait fournir des moyens à la fois identifier et tester des thérapies personnalisées. Par exemple, la prostate à base de R-spondine approche organoïde 1 permet en trois dimensions (3D) la culture des cellules cancéreuses de la prostate normales et métastatiques dans une matrice extracellulaire commercial (par exemple, le Matrigel), tandis que la méthode conditionnellement reprogrammant des cellules (CRC) développé à Georgetown 2, 3 utilise plus des conditions de culture 2D standard. Plus précisément, la combinaison d&#39;un inhibiteur de la Rho kinase (Y-27632) et de cellules irradiées J2 nourricières de fibroblastes de souris conduit à la mise en culture indéfinie CRCs de kératinocytes 2. La méthodologie CRC estextrêmement robuste, avec des lignées cellulaires primaires avec succès établies et maintenues indéfiniment de la prostate et d&#39;autres tissus épithéliaux normaux et malins 3. Surtout, notre technologie CRC a permis l&#39;identification rapide de la base étiologique de papillomatose respiratoire récurrente chez un patient qui avait échoué un certain nombre de traitements médicamenteux précédents. En outre, en utilisant CRCs normales et tumorales dérivées, l&#39;identification réussie d&#39;un médicament approuvé par la FDA, le vorinostat, a été faite dans les deux semaines de la biopsie initiale du tissu. Le patient a été placé sur le vorinostat, ce qui entraîne le traitement réussi de la maladie 4. La glande prostatique normale est constituée d&#39;luminale, la base et les rares cellules neuroendocrines 5. luminale des cellules forment la couche épithéliale de la glande et expriment le récepteur d&#39;androgène (AR), ainsi que d&#39;autres marqueurs tels que luminal cytokératines 8 et 18 et proantigène spécifique de l&#39; état (PSA) 6. A l&#39; inverse, les cellules basales sont localisés sous la couche luminale et expriment la cytokératine 5 et p63, mais de faibles niveaux de l&#39;AR 5. Nous 7, 8, 9 et 10 autres ont utilisé avec succès CRC de la prostate dans précliniques mécanistes enquêtes de sensibilité aux médicaments. Toutefois, lorsqu&#39;elles sont cultivées dans des conditions de culture tissulaire standard 2D, ces cellules ne parviennent pas à engager pleinement un EA de signalisation 10. Il est important, lorsqu&#39;il est placé sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, le CRC a repris l&#39;architecture glandulaire de la prostate normale et la fonction indiquant que les CRC de la prostate conservent leur engagement de lignage lorsqu&#39;il est placé dans un environnement permissif. La mise au point du système de culture de cellules à base d&#39;insert de filtre décrit ici permet aux rapides (2 semaines) la différenciation in vitro de CRCs de la prostate comme le montre by l&#39;augmentation de l&#39;expression des gènes cibles et AR AR ainsi qu&#39;une diminution des niveaux de p63. Les éléments filtrants utilisés contiennent des membranes de polycarbonate (taille des pores 0,4 um) qui peuvent supporter la culture de cellules de mammifères. Le système, tel que développé, utilise des CRCs de la prostate normales et malignes, des boîtes de culture de 6 puits et les éléments filtrants. Milieux de culture cellulaire conditionnés par des cellules J2 11 est placé dans les médias de fond la chambre et de la prostate différenciation dans la chambre supérieure. Les techniques décrites ici soutiennent la différenciation des cellules de la prostate luminale dans un délai de 2 semaines, compatible avec les objectifs de la médecine personnalisée. Il était également impératif de développer des méthodes qui permettent le profilage moléculaire, génétique et cellulaire complète des cultures. Approches pour isoler l&#39;ADN, l&#39;ARN et des protéines à partir de cellules libérées de la surface du filtre ont été développés et rationalisé pour la répétition exacte de traitement des échantillons. Finally, la méthodologie nécessaire pour retirer le filtre pour permettre l&#39;incorporation, sectionner et pour H &amp; E, immunohistochimique et immunofluorescence, est entièrement décrite.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Insert de culture</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire Millicell</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 puits</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>gélatine 0,1 % dans l’eau</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel standard stérile 11 lames</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampon de lyse et d’extraction</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Vanadate de sodium</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase (AEBSF, aprotinine, béstatine, E-64, leupeptine et pepstatine A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081& nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Mélange de nutriments</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate Inhibiteur de roche</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Toxine cholérique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Gel de traitement des échantillons ( agarose hydroxyéthyle (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Pansement non adhérent</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Cassettes de traitement / enrobage de tissus</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

un système de culture 3d basé sur insérer filtre rapide pour prostate primaire différenciation cellulaire

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

cellules conditionnellement reprogrammées (CRC) fournissent une méthode durable pour la culture cellulaire primaire et la capacité de développer de vastes &quot;biobanques de vie» des patients provenant des lignées cellulaires. Pour de nombreux types de cellules épithéliales, diverses approches en trois dimensions (3D) de la culture ont été décrits qui soutiennent une amélioration de l&#39;état différencié. Alors que CRCs conservent leur engagement lignée du tissu à partir duquel ils sont isolés, ils ne parviennent pas à exprimer un grand nombre de marqueurs de différenciation associés au tissu d&#39;origine lorsqu&#39;elles sont cultivées dans deux conditions (2D) de la culture tridimensionnelle normale. Afin d&#39;améliorer l&#39;application des CRCs patient dérivées pour la recherche sur le cancer de la prostate, un format de culture 3D a été défini qui permet une différenciation rapide (2 semaines au total) luminale des cellules dans les cellules épithéliales prostatiques normales et tumorales dérivées. Ici, un format à base d&#39;insert de filtre est décrit pour la culture et la différenciation des deux CRCs de la prostate normales et malignes. A deDescription queue des procédures requises pour la collecte des cellules et le traitement pour la coloration immunohistochimique et immunofluorescence sont fournis. Collectivement, le format de la culture 3D est décrit, combiné avec les lignes primaires CRC, fournit un moyen important pour High- système modèle débit pour la recherche de la prostate sur la base des échantillons biologiques.

Le système basé sur insert de culture cellulaire est une procédure relativement simple et rapide pour produire des cultures 3D de la prostate CRCs qui soutient la différenciation des cellules luminale. Un schéma du système est représenté (figure 1A) mettant en évidence l&#39;application de la couche de gélatine sur la surface inférieure de la cartouche filtrante. Les inserts ne sont renversées pour l&#39;application de la gélatine. Dans la figure 1B les ...

Ici, nous présentons une méthode pour l’établissement d’un système in vitro rapide qui soutient la culture tridimensionnelle et la différenciation luminale ultérieure des cellules épithéliales primaires de la prostate.

Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Le but général de ce système de culture 3D basé sur des inserts filtrants pour des cellules primaires dérivées de patients est d'établir un modèle in vitro plus pertinent sur le plan biologique pour la recherche sur le cancer de la prostate. En utilisant des cellules humaines primaires, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement de la prostate ainsi qu'en cancer de la prostate. Le principal avantage de cette technique est qu'il s'agit d'une méthodologie in vitro relativement rapide permettant l'établissement de cellules primaires de la prostate différenciées, tout en facilitant l'isolement rapide de biomolécules telles que l'ARN, l'ADN et les protéines.La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle, car le traitement des cellules sur l'insert filtrant destiné à l'histologie ou à la collecte d'ARN et de protéines est délicat et sensible au temps. Afin de limiter la diffusion entre les chambres dans une hotte de sécurité biologique, appliquez une fine couche de gélatine à 0,1 % sur la face inférieure des inserts et laissez-les sécher. Répétez cette procédure deux fois supplémentaires.Ensuite, appliquez les cellules dans la chambre interne des inserts revêtus de gélatine et cultivez-les pendant deux semaines au maximum. Après deux semaines, appliquez directement les inserts filtrants cultivés à l'une des applications en aval appropriées décrites ci-après. Pour commencer cette procédure, aspirez le PBS de la chambre externe et retirez soigneusement le PBS de la chambre interne.Les inserts cultivés peuvent être conservés brièvement dans du PBS jusqu'à ce que l'application soit prête à commencer, mais ne laissez pas la membrane sécher. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de trypsine EDTA 0,25 % dans chaque chambre interne. Incubez ensuite pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, grattez brièvement et soigneusement les cellules présentes sur la surface de la membrane à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, tout en pipetant par aspiration et distribution. Incubez ensuite pendant une minute à 37 degrés Celsius. Après une minute, ajoutez 250 microlitres de milieu conditionné dans la première chambre interne et pipetez doucement par aspiration et distribution afin de rincer le filtre.Après ce transfert, transférez les cellules en suspension vers la chambre de filtration adjacente contenant les mêmes conditions de milieu et répétez les pipetages ascendants et descendants. Répétez cette procédure pour chacun des inserts d'une même condition. Ensuite, récupérez les cellules et transférez-les dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Rincer chaque chambre interne avec un supplément de 100 à 200 microlitres de milieu conditionné afin de récupérer les cellules restantes, puis les ajouter au tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifuger les cellules dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Par la suite, aspirer le surnageant et laver le culot cellulaire une fois avec 1 000 microlitres de PBS.Faire centrifuger à nouveau les cellules dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, aspirer le PBS et congeler l'échantillon à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Dans cette procédure, ajouter 200 µL de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme ou d'un réactif d'extraction similaire dans la chambre intérieure et agiter brièvement les cellules à la surface de la membrane en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Incubez ensuite les cellules dans le réactif d'extraction pendant cinq minutes à température ambiante et laissez la chambre externe sèche. Rincez ensuite la membrane filtrante en aspirant et expulsant la solution d'extraction à l'aide d'une pipette. Récupérez le maximum de réactif d'extraction possible en inclinant la plaque à six puits et en aspirant tout liquide résiduel.Veuillez noter que le filtre peut se dissocier de l'insert. Lavez la membrane de filtre dissociée si elle est attachée. Ensuite, récupérez autant de réactif d'extraction que possible et suivez le protocole du fabricant pour la purification et la récupération de l'ADN, de l'ARN ou des protéines.Il convient de manipuler avec précaution les cellules et le filtre avec du thiocyanate de guanidinium, car une agitation excessive peut produire des ARN de mauvaise qualité. Afin d'isoler les protéines à partir du filtre, placez le filtre dans la plaque à six puits sur de la glace. Ajoutez ensuite 10 microlitres de tampon de lyse protéique dans la chambre intérieure.Agiter et racler les cellules à la surface de la membrane à l’aide d’une pipette de 20 microlitres tout en aspirant et expulsant plusieurs fois, en évitant de former des bulles dans le tampon de lyse. Incuber ensuite la plaque à six puits avec les inserts filtrants sur de la glace pendant dix minutes. Répéter le raclage, puis rincer la surface de la membrane avec le tampon de lyse.Recueillir les lysats provenant des six inserts et les transférer dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre placé sur de la glace. Rincer ensuite la première membrane avec 10 microlitres supplémentaires de tampon de lyse et la transférer vers le filtre suivant. Répéter cette procédure pour tous les inserts d'une condition expérimentale donnée, en récupérant toute solution résiduelle de tampon de lyse et en l'ajoutant au tube de 1,5 millilitre.Incuber l'échantillon sur de la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Puis le centrifuger à vitesse maximale pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois terminé, prélever le lysat à l'aide d'une pipette et le transférer dans un tube de 1,5 millimètre neuf.Ensuite, procéder à l'analyse de la concentration en protéines ou conserver les lysats à moins 80 degrés Celsius. Dans cette procédure, ajouter 500 microlitres et un millilitre de FBN à 10 % respectivement dans la chambre intérieure et la chambre extérieure. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, aspirez le formol tamponné au paraffiné (NBF) de la chambre externe et ajoutez un millilitre de gel de traitement HEA dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Faites fondre lentement l'agarose au micro-ondes en utilisant une puissance faible et des impulsions répétées de 10 secondes jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondue. Conservez le HEA dans un bain à 37 degrés Celsius pour éviter la solidification jusqu'au moment de l'utiliser.Ensuite, retirez le NBF de la chambre intérieure. Appliquez 25 microlitres de HEA fondu dans la chambre intérieure et laissez l'agarose durcir pendant deux à cinq minutes. Humidifiez ensuite deux tampons histologiques en mousse dans du NBF à 10 % et placez un tampon dans une cassette d'inclusion.La protection de l'intégrité des couches cellulaires sur l'insert filtrant à l'aide de HistoGel est une étape cruciale pour préserver la couche cellulaire intacte destinée à la section histologique. Ensuite, utilisez un scalpel à lame n°11 pour griffer le filtre par la face inférieure de la chambre en plastique de l'insert, en le libérant partiellement. Placez 100 à 200 microlitres de NBF dans une boîte de Pétri et immergez-y le filtre partiellement détaché.À l’aide d’un scalpel à lame n°10, appuyez doucement au milieu du filtre depuis l’intérieur de la chambre d’insertion afin de détacher complètement le filtre du baril d’insertion. S’il reste une partie du filtre encore attachée au baril, coupez-la avec le scalpel. Ensuite, coupez en deux moitiés le filtre revêtu de HEA.Placer chaque moitié du filtre sur le tampon en mousse dans la cassette d'histologie préparée. Ensuite, ajouter la deuxième éponge imprégnée de NBF à 10 % dans la cassette, en sandwich autour du filtre. Puis fermer hermétiquement la cassette.Placez-le dans du NBF et incubez-le toute la nuit. Cette image en champ clair montre des strates cellulaires pluristratifiées situées au-dessus de la membrane poreuse. Les images fluorescentes individuelles des noyaux, de P63 et du récepteur des androgènes sont présentées, ainsi que la superposition des trois marqueurs de fluorescence.Enfin, un chevauchement composite de champ clair et d'immunofluorescence est présenté, établissant la localisation du signal fluorescent par rapport aux cellules et au filtre. Ici, une image en coupe transversale de notre insert filtrant est montrée, comparée aux couches épithéliales ductales d'un prostate intact. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines, l'isolement final des cellules et de l'insert filtrant ou de la biomolécule souhaitée prenant moins de 30 minutes si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours faire preuve de prudence lors de la manipulation des inserts filtrants, afin d'éviter tout dommage à la couche cellulaire ou au filtre sous-jacent. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les immunotransferts (Western blot), les puces à ARN et les analyses protéomiques peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à l'analyse des voies biologiques et aux cellules cancéreuses. Cette technique permettra aux chercheurs dans le domaine du cancer de la prostate d'explorer plus efficacement la biologie prostatique ainsi que les mécanismes sous-jacents du cancer de la prostate à l'aide de cellules prostatiques primaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une excellente compréhension de la manière de mettre correctement en place et de récupérer des cellules prostatiques primaires cultivées à partir de ce système de culture en 3D.

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Dans cette vidéo, nous démontrons la culture de cellules épithéliales de prostate isolées de souris à l’aide d’une technique de culture basée sur un gel matriciel. Cette approche peut fournir des informations complémentaires sur la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate à former des structures glandulaires 3D en réponse à une manipulation génétique ou pharmacologique.

Dosage des organoïdes de la prostate : une technique de culture ex vivo basée sur un anneau de gel matriciel pour étudier la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Ce protocole décrit comment produire les cellules épithéliales pigmentaire rétinien (EPR) de cellules souches pluripotentes. La méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour diriger la différenciation des cellules souches en RPE immature en quatorze jours et RPE mature et fonctionnel après trois mois.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

Souris génétiquement modifiées sont des modèles utiles pour l’étude des mécanismes du cancer de la prostate. Nous présentons ici un protocole en vue d’identifier et de disséquer les lobes de la prostate depuis un système urogénital de la souris, de différencier basé sur l’histologie et d’isoler et de culture primaire de cellules prostatiques in vitro comme sphéroïdes pour analyses en aval.

Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture

Nous présentons ici un protocole visant à guider la manipulation humaine primaire organoïde la prostate puis indiquent les points de terminaison pour évaluer le phénotype. Semis, entretien de la culture, recouvrement de gel de matrice, quantification morphologique, enrobage et sectionnement, FFIP sectionnement, entier-montez coloration et application d’essais commerciaux sont décrites.

Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

Les organoïdes de prostate de souris représentent un contexte prometteur pour évaluer des mécanismes qui règlent la différenciation. Cet article décrit une approche améliorée pour établir des organoïdes de prostate, et introduit des méthodes pour (1) recueillir le lysate de protéine des organoïdes, et (2) fixer et tacher des organoïdes pour la microscopie confocale de monture entière.

Évaluer la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate de la souris à l'aide de la culture organoïde

Présenté ici est un protocole pour étudier des réponses pharmacologiques dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes ressemblent beaucoup à la biologie in vivo et récapitulent la génétique des patients, ce qui en fait des systèmes modèles attrayants. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des prostates sauvages de type, des modèles génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé.

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

Utilisant les cellules épithéliales primaires humaines de prostate, nous rapportons une nouvelle méthode biomarqueur-libre de caractérisation fonctionnelle des cellules de tige-comme par un test sphéroïde-basé d'étiquette-rétention. Un protocole étape par étape est décrit pour l'étiquetage des cellules BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formation sphénoïde tridimensionnelle; identification des cellules souches de conservation de l'étiquette par immunocytochimie; et l'isolement par FACS.

Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles

Ce protocole décrit une méthode pour établir un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique humaine (BHE). Les cellules endothéliales et les péricytes sont ensemencés de chaque côté d’un filtre à insert (compartiment sanguin), et les astrocytes sont ensemencés dans le puits inférieur (compartiment cérébral). Le modèle caractérisé a été utilisé pour des expériences de transport de nanoparticules.

Un système cellulaire à triple culture modélisant la barrière hémato-encéphalique humaine

Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

Ce protocole fournit une procédure complète pour isoler, étendre et immortaliser les fibroblastes des prostatectomies radicales. De plus, il décrit des tests développés pour évaluer les effets fonctionnels de la diaphonie fibroblaste-cellule tumorale, en tirant parti à la fois du traitement avec un milieu conditionné et de la co-culture.

Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes associés au cancer de la prostate

Découvrez une méthode de culture 3D sur inserts filtrants pour différencier rapidement des cellules épithéliales prostatiques primaires. Cette technique permet l'isolation efficace d'ARN, d'ADN et de protéines pour la recherche sur le cancer de la prostate.

Un système de culture 3D basé sur Insérer Filtre rapide pour Prostate primaire Différenciation Cellulaire

Explorer plus de vidéos