Synthèse de cristaux liquides biocompatibles mousses élastomères comme échafaudages cellulaires pour les cultures de cellules spatiales 3D

Résumé

Cette étude présente une méthode pour préparer 3D, biodégradables, des échafaudages de cellules en forme de mousse à base d'élastomères à cristaux liquides biocompatibles de la chaîne latérale (LCES). Des expériences de microscopie confocale montrent que LCES comme mousse permettent la fixation des cellules, la prolifération et l'alignement spontané de myoblastes C2C12s.

Résumé

Nous présentons ici une préparation étape par étape d'un échafaudage cellulaire 3D, biodégradable, comme la mousse. Ces échafaudages ont été préparés par co-polymères séquences de réticulation étoile comportant des unités de cholestérol en tant que groupes latéraux de la chaîne latérale, ce qui entraîne smectique A (SmA) des élastomères à cristaux liquides (LCES). Echafauds comme mousse, préparés en utilisant des modèles métalliques, disposent microcanaux interconnectés, ce qui les rend appropriés comme échafauds de culture cellulaire 3D. Les propriétés combinées de la structure régulière de la mousse métallique et du résultat élastomère dans un échafaudage cellulaire 3D qui favorise non seulement la prolifération cellulaire supérieure par rapport aux films templated poreux classiques, mais aussi une meilleure gestion du transport de masse (c. -à- nutriments, gaz, déchets , etc.). La nature du modèle métallique permet la manipulation aisée des formes en mousse ( par exemple, des rouleaux ou des films) et pour la préparation des échafauds de différentes tailles de pores pour les études de cellules différentes , tout en préservant la interconnected nature poreuse du modèle. Le procédé de gravure ne modifie pas la composition chimique des élastomères, en préservant leur nature biocompatible et biodégradable. Nous montrons que ces LCES smectiques, lorsqu'elles sont cultivées pendant des périodes longues, permettent l'étude des constructions de tissus cliniquement pertinentes et complexes, tout en favorisant la croissance et la prolifération des cellules.

Introduction

Il existe plusieurs exemples de matériaux synthétiques et biologiques biocompatibles destinés à être appliqués dans des études cellulaires et pour la régénération des tissus visant à la fixation des cellules et la prolifération ^{1, 2, 3, 4, 5.} Il y a eu quelques exemples de matériaux biocompatibles, connus comme des élastomères de cristaux liquides (LCES), qui peut répondre à des stimuli externes avec la commande anisotrope moléculaire ^{6, 7.} LCES sont des matériaux stimuli sensibles qui combinent les propriétés mécaniques et élastiques des élastomères avec la fonctionnalité optique et la commande moléculaire de cristaux liquides ^{8, 9.} LCES peuvent subir des modifications de forme, la déformation mécanique, un comportement élastique et des propriétés optiques en réponse à stim externesuli (ie., de la chaleur, le stress, la lumière, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Des études antérieures ont montré que les cristaux liquides (LC) peuvent détecter la croissance et l' orientation des cellules ^{4, 17.} Il est donc possible de supposer que LCES peuvent être appropriés pour des applications pertinentes biologiquement et médicalement, notamment échafaudage de cellules et d'alignement. Nous avons déjà signalé la préparation de smectiques LCES biocompatibles, biodégradables, coulé moulés et des films minces , avec une morphologie poreuse « type suisse de fromage » ^{6, 18.} Nous avons également préparé LCES biocompatibles nématiques avec la morphologie globulaire comme Echafaudages pour la croissance des cellules ^{19 , 20. Notre travail vise à affiner les propriétés mécaniques des matériaux pour correspondre à celles du tissu d'intérêt 21. En outre, ces études mettent l'accent sur la compréhension des interactions cellule-élastomère, ainsi que la réponse cellulaire lorsque les élastomères sont soumis à des stimuli externes.}

Les principaux défis étaient en partie pour adapter la porosité des LCES pour permettre la fixation des cellules et la pénétration à travers la matrice élastomère et pour un meilleur transport de masse. La porosité de ces couches minces ⁶ a permis de permeation cellulaire à travers la masse de la matrice, mais pas tous les pores sont entièrement interconnectés ou avaient une taille de pores plus régulière (homogène). Nous avons rapporté ensuite les élastomères LCE nématiques biocompatibles avec morphologies globulaires. Ces élastomères nématiques autorisés pour la fixation et la prolifération des cellules, mais la taille des pores ne variaient de 10 à 30 um, ce qui a empêché ou limité l'utilisation de cesles élastomères ayant une plus grande variété de lignées de cellules ^{19, 20.}

Les travaux antérieurs de Kung et al. relative à la formation de mousses de graphène à l' aide d' un gabarit métallique « sacrificielle » a montré que la mousse de graphène obtenu avait une morphologie poreuse très régulier imposé par le gabarit métallique choisi ^22. Cette méthode offre un contrôle total de la taille de la porosité et pores. En même temps, la malléabilité et la flexibilité du modèle métallique permettent la formation de différentes formes modèle avant la préparation de la mousse. D' autres techniques, telles que le lessivage matériau ^23, le gaz texturation ^24, ou des fibres électro-filage ^{25, 26} offrent également le potentiel pour la préparation de matériaux poreux, mais ils sont plus longues et, dans certains cas, la taille des pores est limitée à seulement quelques micromètres. Mousse-comme LCES 3D préparés en utilisant des gabarits métalliques permettent une charge de cellule plus élevée; un taux de prolifération améliorée; co-culture; et, last but not least, une meilleure gestion des transports de masse (c. -à- nutriments, les gaz et les déchets) afin d' assurer le plein développement des tissus ^27. Mousseuse LCES 3D apparaissent également pour améliorer l'alignement des cellules; cela est probablement en relation avec les pendentifs LC détection de la croissance cellulaire et l'orientation des cellules. La présence de fragments de LC au sein du LCE semble améliorer l'alignement des cellules par rapport à l'emplacement de la cellule à l'intérieur de l'échafaudage pour LCE. Les cellules alignées dans les entretoises du LCE, alors qu'aucune orientation claire est observée lorsque les entretoises se rejoignent (jonctions) ^27.

Dans l'ensemble, notre plate-forme d'échafaudage de cellules LCE comme milieu de support cellulaire offre la possibilité de régler la morphologie des élastomères et des propriétés élastiques et pour diriger spécifiquement l'alignement des types de cellules (individuels) pour créer un arrangements spatiaux ordonnés, of cellules semblables à des systèmes vivants. En plus de fournir un échafaudage capable de soutenir et de diriger la croissance cellulaire à long terme et la prolifération, LCES permettent également des expériences dynamiques, où l'orientation des cellules et les interactions peuvent être modifiées à la volée.

Protocole

REMARQUE: Les étapes suivantes pour la préparation de mousse de type LCE 3D en utilisant le copolymère séquencé en étoile 3-bras sont représentés sur la figure 1. Pour la caractérisation par résonance magnétique nucléaire (RMN), les spectres sont enregistrés dans le chloroforme deutéré _(CDCI3) à la température ambiante sur un instrument Bruker DMX 400 MHz et interne référencée pics résiduels à 7,26. Transformation de Fourier des spectres infrarouge (FT-IR) sont enregistrés en utilisant un spectromètre 33 Bruker Vector FT-IR en utilisant le mode de réflectance totale atténuée. Pour chaque étape du protocole suivant, il est important de porter des vêtements de protection individuelle (EPI).

1. Synthèse de l' α-chloro-ε-caprolactone (monomère) (selon la procédure de Jérôme et al. ²⁸⁾

1. Avant de commencer la synthèse, purifier 27 g d'acide 3-chloroperbenzoïque comme suit:
   1. Dans 800 ml d'eau distillée, ajouter 1,28 g de sodiummonohydrate monobasique de phosphate et 8,24 g de phosphate de sodium dibasique heptahydraté. Ajuster le pH à 7,4 (en utilisant de l'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique) et de réserve de 30 ml de cette solution; ceci est la solution tampon.
   2. En utilisant une ampoule à décanter, on dissout de l'acide 3-chloroperbenzoïque dans 35 ml d'éther diéthylique. Laver la solution organique avec 10 ml de solution tampon (préparé à l'étape 1.1.1.). Répétez le lavage à trois reprises.
   3. Ajouter 3 g de sulfate de sodium directement à la solution organique; cet agent de séchage absorbe l'eau de la solution organique.
   4. Filtrer la solution pour éliminer l'agent de séchage. On concentre le filtrat sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 850 mbar et 40 ° C.
2. Solubiliser 18,5 g de purifié acide 3-chloroperbenzoïque dans 150 ml de dichlorométhane anhydre en agitant dans un bain à ultrasons; ce procédé prend typiquement 20 min. Placer la solution dans une ampoule à décanter.
3. A l'intérieur d'un à deux cols, ballon à fond rond,dissoudre 13,1 g de 2-chlorocyclohexanone dans 15 ml de dichlorométhane sec à l'aide d'un agitateur magnétique sous atmosphère d'azote. Continuez à remuer.
4. Monter l'ampoule à décanter contenant une solution d'acide 3-chloroperbenzoïque (à partir de l'étape 1.2) dans le ballon à deux cols dans l'étape 1.3. Rincer le système avec de l'azote gazeux. Régler l'ouverture de l'entonnoir de séparation de telle sorte que la solution d'acide chloroperbenzoïque tombe goutte à goutte dans la solution de 2-chlorocyclohexanone (1 goutte toutes les deux secondes) et continuer à agiter le mélange sous azote gazeux pendant 96 h.
5. On refroidit le mélange réactionnel à -20 ° C pendant 1 heure pour précipiter l'acide m - chlorobenzoïque (m -CBA) sous - produit.
6. On filtre le m - chlorobenzoïque acide (m -CBA) et laver la solution résiduelle avec des solutions saturées de thiosulfate de sodium, le bicarbonate de sodium, et de chlorure de sodium.
7. Eliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 850 mbar et 40 ° C. Purifier le LIQU jaune pâle, visqueuxid par distillation sous pression réduite à 2,3 torr et 96 ° C.
8. Surveiller le succès de la synthèse en utilisant les pics ¹ H RMN suivants. ¹ H RMN (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 4,75 à 4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37 à 4,26 (m, 1H, C H ₂ O), 4.18 à 4.5 (m, 1 H , C H ₂ O), et 2,06 à 1,58 (m, 6H, -C H ₂ -) ^{6, 27.}

2. Synthèse de l' α-étoile à trois bras copolymère à blocs (SBC-αCl) par copolymérisation Anneau d'ouverture (Sharma et al ^6. Et Amsden et al. ²⁹⁾

1. Avant la synthèse, silaniser une ampoule de 20 ml en le remplissant avec une solution de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane 2% (v / v) dans du toluène et on agite pendant environ 24 h. Rincer avec de l'alcool isopropylique et le sécher en le plaçant dans un four à 140 ° C pendant 30 min.
2. Ajouter 30,64 g d'ε-caprolactone distillée, 0,5 g d'α-chloro-ε-caprolactone et 0,25 ml de glycerol à l'ampoule. Mélanger à l'aide d'un vortex pendant 1 min.
3. Ajouter 4,90 g de D, L - lactide à l'ampoule et le purger avec de l' azote. Placer l'ampoule dans une étuve à 120 ° C pour faire fondre le D, L - lactide; ce processus prend environ 2 h. Mélanger à l' aide à nouveau un vortex pour vous assurer que tous les contenus sont bien mélangés et ajouter 66 pl d'étain (II) 2-éthylhexanoate (Sn (Oct) ₂₎ à l'ampoule.
   NOTE: D, L - lactide se refroidira au cours de ce processus et devra être réchauffés au four pour faire fondre.
4. Vigoureusement mélanger une dernière fois à l'aide du vortex et rincer avec de l'azote.
5. Fermer l'ampoule par un bouchon en caoutchouc. Placer une aiguille reliée à un tube à vide (le vide interne est généralement suffisant) à travers le bouchon en caoutchouc. Allumer le vide et, à l'aide d'une flamme, faire fondre le long cou du verre, la torsion lentement jusqu'à ce que le glass s'effondre sur lui-même. Veillez à ne pas faire fondre le bouchon en caoutchouc. Une fois que l'ampoule est scellée à la flamme, le placer dans un bain de sable, un four, ou d'un élément chauffant approprié à 140 ° C pendant 48 h.
6. Sortez l'ampoule et le laisser refroidir à la température ambiante.
7. Briser l'ampoule à la marque scellé et on dissout le liquide très visqueux en ajoutant 10 mL de dichlorométhane. Transférer la solution dans une ampoule à décanter.
8. Préparer un ballon contenant 100 ml de methanol froid (refroidi en utilisant un bain de glace / acétone sec à une température d'environ -78 ° C). Fixer l'ampoule à décanter (étape 2.7) sur le dessus du flacon. Régler l'ouverture de l'ampoule à décanter afin que environ deux gouttes tombent toutes les deux secondes (goutte à goutte).
9. Recueillir le précipité blanc par filtration (en utilisant un filtre en papier) et le sécher dans un four sous vide entre 50 et 60 ° C.
10. Surveiller le succès de la synthèse en utilisant les pics de RMN ¹ H et FT-IR suivantes. ¹ H RMN (400 MHz, CDCl ₃, Δ [ppm]): 5.29 à 5.3 (m, COC H _CH3), 4,43 à 4,25 (m, C H Cl), 4.24 à 4.12 (m, C H ₂ O), 04.11 à 04.03 (t, J = 4,6 Hz, C H ₂ O), 3,80 à 3,68 (m, C H C H _2), 3,09 à 2,64 (s large, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, H α-), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-) et 1,77 à 1,25 (m, C H _2, C H _3); FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, et 735 (m) ^{6, 27.}
    Remarque: Pour préparer une procédure LCE 3D plus hydrophile, préparer un copolymère séquencé linéaire (LBC) à la place d'un SBC, après la copolymérisation par ouverture de cycle (ROP) décrit ci-dessus.
    1. Ajouter 0,3 g de polyethylene glycol (PEG), 3,15 g ε-caprolactone, 1,0 g d'α-chloro-ε-caprolactone et 5,0 g de D, L-lactide dans le mélange flacon silanisé.

3. Modification de synthèse de α-Cl-Three Arm SBC à aN ₃ (selon Sharma et al. ⁶⁾ -trois Arm SBC (SBC-aN ₃₎

1. Dans un ballon à fond rond et sous atmosphère d' azote, on dissout 5 g de SBC-αCl dans 30 ml de N, N » -diméthylformamide.
2. Ajouter 0,22 g d'azoture de sodium et laisser réagir pendant une nuit à la température ambiante.
   Attention: azoture de sodium est toxique; porter des vêtements de protection individuelle (EPI).
3. Retirer le N, N » -diméthylformamide sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 11 mbar et 40 ° C. On dissout le mélange dans 30 ml de toluène. Centrifuger la solution trois fois à 2800 g pendant 15 min pour éliminer le sel formé. On évapore le toluène sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 77 mbar et 40 ° C.
4. Surveiller le succès de la substitution de l' azide en utilisant des pics ¹ H RMN et FT-IR.
   REMARQUE: ^{Spectre de RMN 1H était similaire au parent SBC-αCl, à l'exception de l'apparition d'un pic à 3,90 ppm en rapport avec le groupe azide; FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2928, 2108 (s, azide), 1754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), et 696 (m).}

4. Synthèse de cholestéryle 5-Hexynoate (LC Moitié) (Selon Sharma et al ^6. Et Donaldson et al. ³⁰⁾

1. Dans un ballon à fond rond, mélanger 3 g d'acide 5-hexynoïque et 130 ml de dichlorométhane. On refroidit à 0 ° C en utilisant un bain de glace.
2. Dans un autre ballon à fond rond, mélanger 8,28 g de N, N » dicyclohexylcarbodiimide, 10,3 g de cholestérol et 0,2 g de 4-diméthylaminopyridine.
3. Transférer la solution goutte à goutte de l'acide 5-hexynoïque dans le ballon contenant le mélange de cholestérol et de maintenir le mélange final à 0 ° C pendant 1 h.
4. Laisser le mélange se réchauffer à température ambiante jusqu'au lendemain.
5. Retirez le précipité de dicyclohexylurée obtenu par filtration en utilisant une teneur 415 filtre en papier et le jeter.
6. On concentre le filtrat sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 850 mbar et 40 ° C. Dissoudre le résidu recueilli dans 150 ml d'hexane.
7. On évapore le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 335 mbar et 40 ° C. Ajouter 350 ml d'éthanol au résidu huileux pour recueillir le produit final. Laver le solide blanc cassé formé avec de l'éthanol et sécher le produit solide sous vide à 50 ° C.
8. Surveiller la synthèse en utilisant les pics ¹ H RMN et FT-IR suivantes. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCI3, [ppm] δ): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C H = C), 4,70 à 4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H ₂ CO), 2,34 (m, 2H, C H ₂ -C H =), 2,31 (m, 2H, C H ₂ C H ₂ -COO), 2,28 (s, 1H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H _2), 2.7 à 1.6 (m, 2H, C H _2, C H), 0,94 (s, 3H, C H _3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H ₃ C H) et 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H ₃ -C H), 0,67 (s, 3H, C H _3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2,830-2,990 (large et pic intense), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s) et 667 (s).

5. Modification synthétique de α-N ₃ -Trois Arm SBC a-cholestéryle-trois bras SBC (SBC-αCLC) via un azoture-Acétylène Huisgen réaction de cyclo-addition (réaction "Cliquez") pour obtenir SBC-Chol (Selon Sharma et al. ⁶⁾

1. Dans un ballon à fond rond, on dissout 1 équivalent molaire de SBC-aN ₃ (1,5 g) dans 100 ml de tétrahydrofuranne fraîchement distillé (THF). Ajouter 1,2 équivalen molairest de cholestéryle 5-hexynoate (1,94 g), 0,1 équivalent molaire de cuivre (I) de l'iodure (0,06 g) et de 0,1 équivalent molaire de triéthylamine (0,03 g). On agite le mélange pendant une nuit à 35 ° C sous atmosphère d'azote.
2. On évapore le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 357 mbar et 40 ° C.
3. Dissoudre le mélange résiduel dans 80 ml de dichlorométhane et on centrifuge pendant 5 min à 2800 x g à température ambiante pour éliminer les matériaux non réagis et les produits secondaires.
4. Surveiller la synthèse en utilisant les pics ¹ H RMN et FT-IR suivantes. ¹ H RMN (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazole), 5,43 à 5,34 (m, C = cholestérol CH), 05.10 à 05.06 (m, COCHCH _3), 4,68 -4,55 (m, cholestérol O-CH), 4.24 à 4.19 (m, CH ₂ O), 4.18 à 4.13 (t, J = 5,0 Hz, CH ₂ O), 4.11 à 4.5 (t, J = 4,4 Hz, CH ₂ O), 2,47 à 2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH _2), 2.31 à 2.25 (m, COCH _2), 2.7 à 1.2 (m, CH ₂ , _CH3), 1.5 à 1.3 (s, _{CH2, CH3),} 0,96 à 0,92 (d, J = 3,3 Hz, _{CH2, CH3),} 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, _CH3), et de 0,71 à 0,68 (s, _CH3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s) et 668 (s).

6. Synthèse du 2,2-bis (1-caprolactone-4-yl) propane (agent de réticulation, BCP) (Selon Gao et al. ²⁷ et Albertsson et al. ³¹⁾

1. Dans un ballon à fond rond, de préparer une solution contenant 10,8 g de 2-bis (4-hydroxy-cyclohexyl) propane et 52 ml d'acide acétique.
2. Préparer une solution contenant 11 g de trioxyde de chrome dans 50 ml d'acide acétique et 8 ml d'eau distillée. Ajouter cette solution goutte à goutte à la solution préparée à l' étape 6.1 , tout en maintenant la température du mélange entre 17 et 20 ° C (par exemple dans unbain d'eau); ce procédé de goutte à goutte dure 2 h. Une fois que le processus est terminé, permettre à la solution sous agitation pendant environ 30 min.
3. Ajouter 50 ml de 2-propanol. Incorporer la solution pendant la nuit à la température ambiante.
4. Concentrer la solution violet foncé sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 137 mbar et 40 ° C. Ajouter 300 ml d'eau distillée pour précipiter; le précipité doit être violet clair.
5. Filtrer le produit brut en utilisant une teneur 415 filtre en papier. Laver la matière solide avec ~ 250 mL d'eau distillée ou jusqu'à ce que le solide devient blanc.
6. Dissoudre la matière solide dans 15 ml de benzène à 40 ° C et laisser recristalliser à 25 ° C.
7. Ajouter 8,34 g de dicétone sec dissous dans du dichlorométhane anhydre et une solution contenant 6,0 g d'acide 3-chloroperbenzoïque dans 75 ml de dichlorométhane dans le ballon.
8. Reflux la solution à 40 ° C pendant 24 h.
9. On refroidit le mélange réactionnel à -20 ° C pendant 10 minutes pour précipiter le m sous-produit de l'acide chlorobenzoïque.
10. Retirer l' acide m - chlorobenzoïque par filtration ( en utilisant un filtre en papier) et on concentre la solution sous pression réduite.
11. Laver le produit brut de viscose avec 200 ml de 2-heptanone et sécher le précipité sous vide à 50 ° C pendant une nuit.
12. Surveiller la synthèse en utilisant les pics ¹ H RMN et FT-IR suivantes. ¹ H RMN (400 MHz, CDCl _3, δ [ppm]): 4,42 à 4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H ₂ OC = O), 4.21 à 4.15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H ₂ OC = O), 2,80 à 2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,63 à 2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,04 à 1,93 (m, 4H, -C H ₂ CH ₂ OC = O), 1,70 à 1,56 (m, 4H, -C H ₂ C H ₂ COO), 1,48 à 1,38 (m, 2H, - C H C (CH _{3) 2),} et 0,84 (s, 6H, C H ₃ C-).

7. Création d'Porous 3D Elastomère Échafaudage utilisant soit hexaméthylène diisocyanate (HDI) ou le 2,2-bis (1-caprolactone-4-yl) propane (PCA) ²⁷ comme agents de reticulation (Selon Gao et al. ²⁷⁾

1. Préparer le mélange d'élastomère à trois bras en utilisant 0,75 g de SBC-αCLC en ajoutant 0,25 ml de HDI (ou 0,45 mL de PCA) et 0,24 ml de monomère ε-caprolactone distillée. Ajouter 60 pi de Sn (Oct) _2. Si vous utilisez BCP au lieu de HDI, mélanger SBC-αCLC et BCP à l'aide d'un vortex et placez-les dans un four à 140 ° C jusqu'à ce que le BCP fond complètement et se dissout (cette étape peut prendre jusqu'à 2 h). Une fois que le BCP a été dissous, le sortir du four et, le Sn (Oct) ₂ et vortex.
2. Préparer un modèle en mousse de nickel « sacrificielle » par découpe d'un 1 x 4 cm pièce métallique. Passer à partir de l' une des extrémités courtes de telle sorte que le rouleau final est d' environ un 1 x 1 cm pièce métallique (voir la figure 4).
3. Mettre la mousse de nickel dans un emballage de feuille flacon en verre ou en aluminium et verser le mélange préparé à l'étape 7.1 pour couvrir entièrement la mousse pendant 2 min. Retirez le mélange en excès avec une pipette Pasteur. Laissez-le dans un four pendant la nuit à 80 ° C.
4. Décoller la feuille d'aluminium ou de briser le verre. En utilisant une lame de rasoir, raser l'élastomère autour de la mousse métallique afin d'exposer le métal de nickel.
5. Solution dans 100 ml d'eau Préparer 1 M de fer (III) chlorure (FeCl _3). Placez la mousse dans un flacon et ajouter 70 ml de solution _FeCl3. Remuez pendant trois jours à la température ambiante et changer la solution _FeCl3 tous les jours. Avant chaque changement, mélanger la mousse avec de l'eau désionisée pendant 0,5 h.
   NOTE: Le processus de gravure est généralement terminée au bout de trois jours. Pour veiller à ce que le processus de gravure est terminée, effectuer des tests de compression tactiles jusqu'à ce que les mousses se sentent doux. la résistance de la mousse à des essais de compression tactiles indique la présence d'un modèle de métal résiduel.
6. Rincer le elastmousse omer avec de l'éthanol et le placer dans un four à vide pendant une nuit à 40 ° C.
7. Caractériser les matériaux en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM), la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), des essais mécaniques de compression, et l' analyse gravimétrique thermique (TGA) ^27.
   NOTE: Pour la préparation d'un LCE 3D plus hydrophile, remplacer le SBC avec LBC (en veillant à ce que la LBC contient également un fragment LC) suivant les étapes décrites à l'étape 7.5.

8. Ensemencement des Échafaudage avec Elastomère SH-SY5Y neuroblastome et culture stériles Utilisation des techniques

1. Stériliser l'élastomère en lavant deux fois avec 1 ml d'éthanol à 70%. Effectuer une irradiation UV pendant 10 minutes et on lave avec 1 ml d'éthanol à 70%. Rincer deux fois avec 1 mL d'eau stérile et 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placer les élastomères dans 24 puits des plaques de culture.
2. Préparer un milieu de croissance des cellules SH-SY5Y pour contenant 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémENTED avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep).
3. Après avoir compté les cellules en utilisant un hémocytomètre, préparer 1,5 x 10 ⁵ cellules SH-SY5Y en suspension dans 100 ul de milieu de croissance (solution d'amorçage). Ajouter la solution au-dessus des élastomères, en veillant à former une goutte.
4. Incuber les élastomères ensemencées à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 heures pour favoriser l' adhérence cellulaire. Ajouter 0,5 ml de milieu de croissance. Incuber à nouveau à 37 ° C avec 5% de CO _2.
5. Changer le support tous les jours après le lavage avec 1 ml de PBS.

9. L'imagerie microscopique de Construct Elastomère

1. Fixer les cellules cultivées sur les élastomères avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 15 min. Rincer avec 3 ml de PBS trois fois pendant 5 minutes chacune et placer l'élastomère avec les cellules fixées dans une boîte de culture avec une lamelle couvre-joint.
   Attention: PFA est toxique. Porter des vêtements de protection individuelle (EPI).
2. Stadans les échantillons fixés avec 0,1% de 4' , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 500 pl de PBS pendant 10 minutes et rincer deux fois avec 1 ml de PBS pendant 5 min.
3. Immédiatement images élastomères en utilisant la microscopie confocale à fluorescence DAPI, l'acquisition des piles d'images qui couvrent l'échantillon.
   REMARQUE: Ici, des piles d'images ont été acquises à l'aide d'un objectif 20x et un objectif 60x.
4. Analyser les piles d'images confocale optique en utilisant ImageJ ^32.

Résultats

Ce rapport indique le procédé de préparation d'un LCE 3D poreux comme un échafaudage pour la culture cellulaire en utilisant une matrice de métal de nickel. Le 3D obtenu LCE démontre un réseau de canaux interconnectés complexe qui permet l' infiltration de cellules facile, ainsi que le transport de masse plus appropriée ^27. Il a été constaté que les cellules sont capables de pénétrer entièrement le réseau de canaux interconnectés et sont également en mesur...

Discussion

élastomères cristaux liquides ont récemment été étudiés comme échafauds de cellules biocompatibles en raison de leur réactivité stimuli. Ils se sont avérés être des plates-formes idéales comme échafauds cellulaires. Cependant, un facteur important de garder à l'esprit lors de la préparation et la conception d'un nouvel échafaudage LCE est la porosité. L'incorporation de solides lessivables ²³ ou de gaz ne se traduit pas toujours dans la porosité homogène ou pores totalement interconne...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Agent silanisant
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Réactif
2-chlorohexanone  ;	Alfa Aesar	A18613	Réactif
2-heptanone  ;	Sigma Aldrich	W254401	Solvant
2-propanol  ;	Sigma Aldrich		278475 Solvant
acide 3-chloroperbenzoïque, m-CPBA	Sigma Aldrich		273031 Réactif
4-diméthylaminopyridine	Alfa Aesar A13016		Réactif
4',6-diamidino-2-phénylindole, DAPI  ;	Invitrogen	D1306	Teinture nucléaire
Acide 5-hexynoïque  ;	Alfa Aesar	B25132-06	Réactif
Acide acétique	VWR	36289	Solvant
Acétone	Sigma Aldrich	34850	Solvant
Alcool 200 proof ACS Grade  ;	VWR	71001-866	Réactif
Benzène	Alfa Aesar	AA33290	Solvant
&epsilon ;-caprolactone  ;	Alfa Aesar	A10299-0E	Réactif
Chloroforme	VWR	BDH1109	Solvant
Cholestérol	Sigma Aldrich	C8503
Réactif Oxyde de chrome(VI)	Sigma Aldrich	232653	Réactif
Iodure de cuivre(I)	Strem Chemicals	100211-060	Réactif
D,L-Lactide  ;	Alfa Aesar	L09026	Réactif
Dichlorométhane	Sigma Aldrich	320269	Solvant
Éther diéthylique  ;	Emd Millipore	EX0190	Solvant
N,N-diméthylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvant
Dulbecco' s milieu Eagle modifié, DEME  ;	CORNING Cellgo	10-013	Cell
Media Éthanol	Alfa Aesar	33361	Solvant
Formaldéhyde  ;	SIGMA Life Science	F8775	Sérum bovin
fœtal fixateur, FBS  ;	HyClone	SH30071.01	Media Component
Papier filtre, grade 415, qualitatif, crêpe	VWR	28320
Filtration Glycérol	Sigma Aldrich	G5516	Nœud central (3 bras)
Diisocyanate d’hexaméthylène, HDI	Sigma Aldrich	52649	Réticulant
Chlorure de fer(III)  ;	Alfa Aesar	12357	Agent de gravure
Alcool isopropylique	VWR	BDH1133	Solvant
Méthanol	Alfa Aesar	L13255	Solvant
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvant
N,N-diméthylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvant
Gabarit en métal nickel	American Elements	Ni-860	Gabarit en mousse
Cellules de neuroblastomes (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Lignée cellulaire
Pénicilline streptomycine  ;	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotiques
Polyéthylène glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Réactif
Azoture de sodium  ;	VWR	97064-646	Réactif
Bicarbonate de sodium	AMRESCO	865	Sel de séchage
Chlorure de sodium	BDH	BDH9286	Sel de séchage
Phosphate de sodium dibasique heptahydraté	Fisher Scientific	S-374	Sel de séchage
Phosphate de sodium monobasique monohydraté	Sigma Aldrich	S9638	Sel de séchage
Sulfate de sodium	Sigma Aldrich	239313	Sel de séchage
Tétrahydrofurane	Alfa Aesar	41819	Solvant
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Sel de séchage
Tin(II) 2-éthylhexanoate	Aldrich	S3252	Réactif
Toluène	Alfa Aesar	22903	Solvant
Triéthylamine	Sigma Aldrich	471283	Réactif
Trypsine	HyClone	SH30042.01	Détachement de cellules
Olympus FV1000