Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l'efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées Mycobacterium tuberculosis

La tuberculose (TB) reste une menace pour la santé mondiale sérieuse malgré la disponibilité de traitements de chimiothérapie anti-tuberculose depuis plus de 40 ans ^1. Cela est dû en partie à l'exigence pour des périodes de plus de 6 mois de traitement longs en utilisant de multiples combinaisons de médicaments, ce qui conduit à des patients non-conformité ^2. L'émergence de la tuberculose résistante aux médicaments au cours des dernières années a encore aggravé les problèmes dans un domaine où un développement réussi des médicaments cliniquement approuvés est pratiquement inexistante ^3. En effet, en dépit de l' anti-développement des antituberculeux exhaustive, un seul médicament a été approuvé par la FDA pour une utilisation clinique au cours des 40 dernières années ^4. Ainsi, de nouvelles générations de médicaments anti-tuberculeux sont nécessaires de toute urgence pour remédier à ce problème.

Un problème clé dans la découverte de médicaments antituberculeux est le manque de succès du transfert à partir de composés ayant une activité in vitro à l' efficacité dans le cadre clinique= "référence externe"> ^{5, 6, 7.} Initialement, les approches cibles basées ont été utilisés pour le dépistage de médicaments anti - Mtb ^5, qui a échoué à traduire dans des cellules bactériennes entières. Même lorsque les cellules sont utilisées Mtb, elle est souvent réalisée en utilisant le bouillon cultivé des cultures, qui ne permettent pas de prédire avec précision l' efficacité du médicament in vivo , ^{8, 9.} Ces problèmes ont été reconnus et des essais de criblage de médicaments contre les macrophages contenant Vtt ou Mtb latente ont été établis avec succès ^{8, 10, 11, 12.} Toutefois, même ces tests plus avancés ne donnent pas suffisamment compte des barrières de pénétration que les médicaments rencontrent dans les lésions pulmonaires non-vascularisées, et dans les foyers nécrotiques sur le site de l'infection. Effectivement, Même pour la première ligne de médicaments antituberculeux rifampicine, le dosage sous-optimal a été remise en question en raison de l' insuffisance dans les tissus in vivo et cérébral liquide céphalo - rachidien (LCR) pénétration ^{13, 14, 15} ainsi qu'une diminution de l' efficacité contre intracellulaire Vtt ^{8, 9.} En tant que tel, de nouveaux modèles et des analyses qui prennent en compte ces paramètres au cours du processus de développement avance rapide sans aucun doute améliorer la tuberculose des efforts de découverte de médicaments.

Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis sur pied un bon marché, rapide et BSL-2 modèle d'infection de remplacement compatible pour les tests d'efficacité des médicaments Vtt ^16. Ce modèle d'infection produit dense Vtt au sein de grandes structures globales macrophage, qui récapitulait les barrières de pénétration cellulaire physiologiquement pertinents et généré repiquées macrophage Mtb latente. Vtt dérivée de ce modèle d'infection a été combiné avec le dosage résazurine de microtitrage (REMA) pour évaluer l' efficacité du médicament, ce qui a produit des résultats cohérents avec d' autres modèles d'infection intracellulaire et une bonne corrélation avec la capacité déclarée de médicaments courants TB pour atteindre des concentrations élevées de CSF par rapport à des concentrations sériques ^16.

Ici , nous décrivons en détail la génération de Mtb / structures globales macrophage pour produire macrophage-repiquées Vtt approprié pour les tests de sensibilité aux médicaments en utilisant REMA. En particulier, nous montrons comment ce système d'infection pourrait être adapté à un format de 96 puits pour la compatibilité avec le criblage à des candidats médicaments anti-TB.

NOTE: Comme M. tuberculosis mc ² 6206 est une souche avirulente ^{17, 18,} tous les travaux dans ce protocole peut être effectué dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).

1. Conditions de culture pour Green Fluorescent Protein Exprimer M. tuberculosis mc ² 6206 (Vtt GFP)

NOTE: Le M. tuberculosis H37Rv dérivé auxotrophe souche mc ² 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) transformée avec le plasmide exprimant la GFP pMN437 est utilisé dans ce protocole ^16. Il est possible de remplacer la souche Vtt GFP avec gfp non exprimant souche de type sauvage pour permettre un accès plus facile de la souche pour les chercheurs. Cependant, l' expression gfp est souhaitable pour permettre une confirmation visuelle de la phagocytose et la formation d'agrégats Mtb / macrophage. Pour LONg stockage à long terme, Vtt GFP ont été congelés à -80 ° C dans 7H9 milieux complets (décrits à l' étape 1.1) additionné de 20% de glycérol.

1. Préparer toutes les supports Vtt GFP (7H9-C) en la complétant 7H9 milieu avec 10% de Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, / mL acide D-pantothénique de 24 pg, 50 pg / ml de L-leucine et 50 pg / ml d' hygromycine B.
2. Décongelez un flacon de Vtt GFP et ajouter 10 ml de 7H9-C dans un carré ballon à fond de PETG 30 ml.
3. Incuber à 37 ° C sur un agitateur rotatif (50 rpm). Prendre des mesures de densité optique (DO ₆₀₀₎ tous les quelques jours jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ atteigne 1,0 (environ 5-8 jours).
4. Diluer la culture et de passage au besoin pour maintenir une _DO600 entre 0,2-1,0.
5. Pour l' infection, en utilisant une culture établie de Mtb GFP au sein de la phase de croissance logarithmique (DO ₆₀₀ de 0,6 à 1). Pour éviter les cultures grumeaux, sonication la culture flacon Vtt dans un bain d'eau (130 W; 3 impulsions s x 5) once ou deux fois par semaine

2. Conditions de culture pour Les cellules THP-1

1. Préparer toutes les cellules THP-1 milieu cellulaire (RPMI-C) en complétant le milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin, 2 mM de L-glutamine et 10 mM de HEPES.
2. Incuber les cellules dans un flacon T-75 à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2.
3. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou cytométrie en flux tous les deux jours et maintenir les cellules THP-1 à une densité comprise entre 0,1 à 0600000 par mL.

3. Protocole d'infection pour générer Vtt / macrophage Aggregate Structures

1. THP-1 préparation de cellules (par plaque de 96 puits)
   1. Centrifuger de 7 x 10 ⁶ cellules THP-1 à 250 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 7 ml de RPMI-C.
2. Préparation Vtt GFP
   1. Centrifugeuse 2,8 x 10 ⁸ Vtt GFP à 3.200 xg pendant 5 min dans une centrifugeuse oscillant seau uchanter une conversion de ₆₀₀ OD 1.0 = 3 x 10 ⁸ bactéries / ml.
   2. Laver une fois avec du RPMI-C et centrifuger comme à l'étape 3.2.1.
   3. Remettre en suspension dans 7 ml de RPMI-C et vortex pendant 10 s.
3. Infection
   REMARQUE: Voir la Figure 1 pour le modèle.
   1. Préparer une plaque à 96 puits en ajoutant 200 pi d'eau stérile dans les rangées A et H, et les colonnes 1 et 12 pour un rebord d'eau pour empêcher l'évaporation du milieu de culture.
   2. Ajouter 200 ul de RPMI-C à la colonne 2 (B2 à G2) pour le contrôle d'arrière-plan (vierge).
   3. Pour infecter, ajouter Vtt GFP suspension (étape 3.2) THP-1 suspension de cellules (étape 3.1) et bien mélanger par pipetage. La densité finale de cellules THP-1 est de 5 x 10 ⁵ par ml et la multiplicité correspondante de l' infection est de 40.
   4. Verser le / Vtt GFP suspension dans un réservoir de 25 ml THP-1.
   5. Ajouter 200 pi de THP-1 / Vtt GFP suspension à tous les 96 puits restants (B3 à G11) usinga multi-canal pipette.
      NOTE: Si vous travaillez avec des plaques multiples à 96 puits, resuspendre régulièrement le THP-1 / Vtt suspension restante dans le réservoir pour assurer un mélange homogène est ajouté à chaque puits.
   6. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 7-10 jours.
   7. Changer les médias tous les 2 jours en retirant lentement 100 uL passé médias de la partie supérieure de chaque puits et doucement en ajoutant 100 pi de pré-chauffé RPMI-C à l'aide d'une pipette multi-canal. Ne pas remettre en suspension des puits et de perturber les agrégats Vtt / macrophage sur le fond des puits.
   8. Examiner visuellement les puits par microscopie à fluorescence (objectif 4-10X) par jour, en prenant note de la taille des agrégats Mtb / macrophage. Par jour 7-10, Mtb agrégats / macrophage devraient être suffisamment grande (voir figure 2 pour référence) de procéder pour les tests l' efficacité des médicaments (section 4).
   9. Si on le désire, de capturer des images des 96 puits en utilisant un système d'imagerie de cellules automatique montéesavec le champ lumineux et filtre GFP fixe pour documenter Vtt / formation d' agrégats macrophage.
      NOTE: Si les utilisateurs ne pas avoir accès à un système d'imagerie automatisée, des images de puits représentatifs peuvent être prises à l'aide tout microscope approprié avec la GFP et sur le terrain lumineux capacités.

4. inhibition de la croissance de dosage pour évaluer l' efficacité des médicaments contre Vtt Dérivé de Mtb / macrophage Granulats

1. Préparation des médicaments (conditions triple pour deux médicaments)
   REMARQUE: Voir la figure 1A pour modèle.
   1. Dans une plaque de 96 puits séparé, ajouter 125 ul de médias 7H9-C à B2 jusqu'à G10.
   2. Préparer deux médicaments au double de la concentration finale la plus élevée souhaitée dans 1 ml de 7H9-C pour tenir compte de la dilution dans l'étape 4.2.4.
   3. Ajouter 250 ul de chaque médicament à des puits B11-C11-D11 et E11-F11-G11, respectivement pour les traitements en triple.
   4. En utilisant une pipette multi-canal, en série dilute les médicaments d'essai deux fois en déplaçant 125 pi de B11-G11 dans B10-G10. Mélanger par pipetage 5 fois à chaque étape.
   5. Continuez à déplacer 125 pi de colonne en colonne (droite à gauche) à travers la plaque, et arrêter après la colonne 4.
   6. Après mélange colonne 4, jeter 125 ul dans un conteneur de déchets. Les colonnes 2 et 3 ne doivent pas contenir de médicaments pour permettre une utilisation comme fond (blanc) et les contrôles de croissance positifs.
      REMARQUE: Vous pouvez également suivre modèle dans la figure 1B pour les bibliothèques des tests de drogue. Chaque plaque de 96 puits peut accueillir 58 médicaments à une seule concentration. Préparer cette plaque de médicament à l'aide du double de la concentration finale souhaitée car elle sera diluée dans la moitié à l'étape 4.2.4.
2. Traitement médical:
   1. Récupérer la plaque de 96 puits contenant le Vtt macrophages infectés par l (agrégats Vtt / macrophages).
   2. Décanter avec soin tous les puits concernés (B2 par G11) avec une pipette multi-canal.Effectuez cette manière en deux étapes: d'abord supprimer 150 pi sans incliner la plaque, puis retirez les médias restants (~ 50 pi) en inclinant la plaque et l'insertion de la pointe de la pipette sur le bord inférieur du puits. En ce Mtb / macrophage agrégats sont adhérentes au fond du puits, aucun matériau ne soit perdu.
   3. Ajouter délicatement 100 pi de 7H9-C médias à tous les puits pertinents (B2 par G11) de la plaque contenant les agrégats / macrophage Mtb.
   4. En utilisant une pipette à canaux multiples, transférer 100 ul du médicament contenant plaque à 96 puits (étape 4.1) dans les puits correspondants de la plaque d'infection.
   5. Placer dans un sac scellé et incuber pendant 3 jours à 37 ° C.

5. Quantification de l'efficacité des médicaments en utilisant le test résazurine microplaque

1. Préparer la résazurine solution mère à une concentration finale de 0,8 mg / ml dans H ₂ O. Filtre 0,22 um pores membrane taille de PVDF pour la stérilisation.
2. Préparer la résazurine solution de travail en mélangeant la résazurine solution mère, H ₂ O et du Tween-80 (solution à 20% en H ₂ O) dans un rapport de 2: 1: 1. Les concentrations finales sont de 0,4 mg / mL résazurine et 5% de Tween-80.
3. En utilisant un lecteur de plaque, mettre en place un programme pour lire la fluorescence à 530 nm excitation et 590 nm émission toutes les 30 minutes pendant 24 heures à 37 ° C. lecteur de plaque pré-chaude à 37 ° C.
4. Ajouter 20 ul de solution de travail de la résazurine dans tous les puits appropriés (B2 à G11) de la plaque de médicament traitée (étape 4.11) à l'aide d'une pipette multicanaux.
5. Placer la plaque sur le lecteur de plaque et démarrer le programme mis en place à l'étape 5.3.
   NOTE: Pour faciliter le traitement des volumes élevés de plaques d'essai, il est suffisant pour développer le dosage dans un incubateur à 37 ° et effectuer fluorescence unique lit toutes les 24 h. Ceci est également applicable aux utilisateurs qui ne disposent pas de l'accès à un lecteur de plaque avec des capacités cinétiques et d'incubation.

Pour confirmer la robustesse de l' adaptation de ce modèle d'infection à 96 puits format de plaque, nous avons ici examiné la sensibilité aux médicaments de Vtt dérivé de notre 96 puits adapté modèle d'infection à la rifampicine (RIF) et moxifloxacine (Moxi) selon le modèle donné dans la figure 1A. Nous démontrons que la génération de Mtb / structures agrégées macrophage clés pour ce dosage peut être produit de manière fiable dans un format de plaque à 96 puits (figure 2), permettant ainsi la compatibilité de débit (figure 1B). Repiqué macrophage Vtt produit de cette manière peut être directement utilisé pour le test d'efficacité de médicament en utilisant le test de microtitrage résazurine bien caractérisé (figure 3).

Le dosage de la résazurine repose sur les espèces oxydantes produites par Mtb métaboliquement active pour convertir la résazurine bleue à la fluorineEscent résorufine rose, le changement de couleur et la fluorescence peut être utilisé comme un marqueur de substitution pour déterminer le montant de la croissance bactérienne. Sur la figure 3A, nous montrons qu'il existe une sensibilité suffisante dans le dosage de résazurine pour détecter de manière fiable les bactéries Mtb viables capables de se répliquer en l'absence de médicaments après seulement 3 jours d'incubation. Alors que la confirmation visuelle du changement de couleur de point final est seulement une évaluation approximative de la croissance, nous pouvons quantifier avec précision en mesurant cinétiquement la conversion de résazurine en son métabolite fluorescent résorufine en utilisant un lecteur de plaque (figure 3B). L' utilisation de ces données, la normalisation du contrôle de la croissance positive (absence de médicaments) permet le calcul de sensibilité courbes tuer pour visualiser l' efficacité des médicaments contre le macrophage-repiquées Vtt (Figure 4).

Ici, les résultats représentatifs des figures 3 4 montrent que la concentration minimale inhibitrice (CMI), définie comme étant la concentration la plus faible de l'antibiotique à laquelle une inhibition de croissance de 90% est observée, est supérieure à 2 pg / mL pour les deux rifampicine et la moxifloxacine contre Vtt dérivé de notre modèle d'infection. Cela démontre que notre modèle d'infection prédit l' efficacité des médicaments anti - Mtb qui sont plus en ligne avec les valeurs de CMI déterminées contre intracellulaire Vtt 8, et reflète les propriétés de barrière de diffusion qui sont négligés dans la plupart des Mtb tests de sensibilité aux médicaments en utilisant des cellules bactériennes de bouillon cultivé ainsi.

Fait important, les données obtenues en utilisant l'essai décrit au format 96 puits ont montré des résultats très comparables à ceux que nous avions préalablement déterminée pour la rifampicine et la moxifloxacine contre macrophage-repiquées Vtt 16.

Figure 2: Génération de Vtt / structures globales macrophage en plaque de 96 puitsformat. (A) champ lumineux représentant et GFP fusionné images de Mtb agrégats -macrophage sur 9 jours après l' infection. Les images ont été capturées avec un objectif 4X au moyen d'un programme d'imagerie cellulaire automatisé qui documente l'ensemble bien en cousant un montage de 3 par 3 images capturées individuellement. (B) une image individuelle non cousue à partir du champ visuel représenté en (A). Image lumineuse sur le terrain et la GFP (C) Un représentant a fusionné d'une / structure agrégée macrophage Vtt capturée avec un objectif 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Utilisation de l'analyse de microtitrage résazurine pour mesurer Vtt viabilité. (A) La présence de viablcellules e Mtb peuvent être simplement déterminés par la conversion du résazurine colorant bleu à sa rose, forme réduite. Les résultats représentatifs sont présentés ici à l' aide de la rifampicine (RIF) et à la moxifloxacine (Moxi) en fonction du gabarit de la figure 1A. (B) Pour mesurer quantitativement la conversion de la résazurine, la fluorescence des puits individuels (correspondant à la figure 3A) a été contrôlée cinétiquement pendant 24 h comme décrit à l' étape 5. mini-graphiques représentatifs montrent les unités relatives de fluorescence (axe des y) en fonction du temps (x -axe). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Détermination de la sensibilité aux médicaments tuant des courbes à partir des données REMA. unités relatives de fluorescence au moment de la resaz maximalesignal de urin en (A) et la rifampicine (B) moxifloxacine traité puits ( à partir de la figure 3B) ont été normalisées au pas de contrôle de la drogue (croissance Vtt maximale) 100% de survie. le contrôle de fond des signaux (vierges) ont été soustraits de tous les puits d'échantillon. La survie a été tracée pour cent pour chaque concentration individuelle d'un traitement médicamenteux pour générer une courbe de mise à mort. Les données de cette figure représentent les moyens ± écart-type de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.