Une procédure pour fabriquer des préparations en face de l'artère carotide et de l'aorte de la souris est décrite. De telles préparations, lorsqu'elles sont colorées par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques, nous permettent d'étudier la localisation des protéines et l'identification des types de cellules dans toute la paroi vasculaire par microscopie confocale.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les sections de tissus intégrés à la paraffine sont habituellement utilisées pour étudier l'histologie tissulaire et l'histopathologie. Cependant, il est difficile de déterminer quelles sont les morphologies tissulaires tridimensionnelles issues de ces sections. En outre, les sections de tissus examinés peuvent ne pas contenir la région dans le tissu qui est nécessaire aux fins de l'étude en cours. Cette dernière limitation entrave les études histopathologiques des vaisseaux sanguins, car les lésions vasculaires se développent de manière focalisée. Cela nécessite une méthode qui nous permet d'examiner une large zone de la paroi des vaisseaux sanguins, de sa surface à des régions plus profondes. Une préparation complète des vaisseaux sanguins répond à cette exigence. Dans cet article, nous allons démontrer comment faire des préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide et les tacher immunofluorescents pour la microscopie confocale et d'autres types d'imagerie à base de fluorescence.
Introduction
Pour les études histopathologiques par microscopie optique, des morceaux tridimensionnels de tissus biologiques sont systématiquement traités pour l'emboîtement de la paraffine, suivis d'une coupe et d'une coloration. Un échantillon de tissu qui a été encastré en paraffine peut être plusieurs millimètres dans les trois dimensions. Cependant, dans le but de la microscopie optique, il faut d'abord sectionner afin que la lumière puisse passer et ensuite tachée afin que la section mince donne suffisamment de contraste pour l'imagerie. Parce que les spécimens sectionnés ont généralement une épaisseur de 5 à 10 μm, on ne voit qu'une très petite fraction de l'échantillon entier en deux dimensions à la fois. Il est possible de collecter des sections séquentielles et, après l'imagerie de chaque section individuellement, effectuer une reconstruction assistée par ordinateur des images 3D, mais il s'agit d'un travail fastidieux en effet. L'histopathologie des vaisseaux sanguins, en particulier pour l'étude de la pathogenèse de l'athérosclérose, présente des problèmes uniques. L'athérosclérose est une maladie focalisée qui se développeLocalement dans les zones où survient le flux sanguin perturbé. En outre, la maladie est initiée dans l'intima, un tissu mince consistant en une monocouche de cellules endothéliales et une matrice extracellulaire, de grandes artères. Pour ces raisons, il est difficile de localiser et d'étudier les lésions précoces en utilisant des vaisseaux sanguins sectionnés car on peut facilement manquer de sectionner la lésion. Même si une section comprend une zone malade, on ne verra qu'une portion de 5 à 10 μm contenant des cellules endothéliales et d'autres cellules de la paroi vasculaire dans les médias et l'adventice.
Les préparations en montage intégral (prononcé än fäs) nous permettent d'examiner une vaste zone de la surface des vaisseaux sanguins, telle que l'aorte entière de la racine aortique jusqu'à l'artère iliaque commune. En utilisant un tel échantillon coloré avec des anticorps spécifiques et d'autres sondes spécifiques, on peut cerner l'emplacement des lésions et aussi où divers événements moléculaires se produisent dans les cellules endothéliales en conjonction avecThétéogenèse telle que les changements dans l'expression, la localisation et les modifications postraductionnelles des protéines. En plus d'étudier l'athérogenèse, la forme de la cellule endothéliale observée dans les préparations en visage est utilisée comme indicateur du taux de flux sanguin dans la moyenne régionale. De telles données sont importantes pour l'étude de la mechanosignaling des cellules endothéliales in situ. À cette fin, les vaisseaux sanguins histologiques systématiques ne sont pas utiles. Ainsi, pour la médecine vasculaire et la biologie, il est particulièrement important d'acquérir une technique pour fabriquer des préparations en face des vaisseaux sanguins qui permet d'observer une grande surface de la surface du vaisseau ainsi que les zones souterraines profondes du vaisseau.
Comme l'ont décrit Jelev et Surchev 1 , les biologistes vasculaires ont développé diverses méthodes pour observer le revêtement des vaisseaux sanguins en face. Des méthodes ingénieuses ont été développées dans les années 1940 et 1950. En utilisant ces méthodes, ils étaient Capable d'étudier l'organisation fondamentale des cellules endothéliales qui bordent la surface interne des vaisseaux sanguins. Cependant, en raison de la façon dont ces préparations en face sont préparées (la soi-disant méthode Hautchen 2 , 3 , 4 ou décollage de la surface du vaisseau 5 ) et la façon dont l'échantillon a été coloré, il n'a pas toujours été possible d'obtenir une morphologie ininterrompue Des informations provenant de la surface du vaisseau dans les zones plus profondes de la paroi des vaisseaux sanguins. La préparation complète des vaisseaux de montage en face combinée à la coloration par immunofluorescence nous a permis non seulement d'étudier la morphologie des cellules endothéliales et l'expression et la localisation des protéines dans ces cellules, mais aussi d'étendre ces études à la région sous-endothéliale de la paroi vasculaire. Les premières études utilisant des préparations de vaisseaux sanguins en visage, des immunodilures colorés ont commencé à apparaître dans les années 1980 6 ,F "> 7. Avec l'avènement de la microscopie confocale à balayage laser et plus récemment la microscopie multiphotonique, on peut maintenant obtenir des images claires et claires de la structure de la paroi des vaisseaux sanguins dans des échantillons de vaisseaux endurcis à l'immunofluorescence ainsi que dans le réseau vasculaire des animaux vivants 8 , 9 , 10 , 11. Ces techniques d'imagerie par ordinateur créent des images en coupe optique focalisées et, en empilant ces images, on peut obtenir des images 3D reconstruites de la paroi du vaisseau et du réseau vasculaire dans les tissus. Peut générer des images d'une section réalisée le long de l'axe Z de l'image reconstruite 12 , 13 .
Dans cet article, nous allons illustrer un procédé pour préparer des préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide pour la coloration immunofluorescente. Préparations de visagePeuvent être réalisés même après que ces navires aient été expérimentalement manipulés. Par exemple, une artère carotide peut être partiellement ligaturée, puis une préparation en face faite après une telle intervention chirurgicale. Pour cette raison, nous décrirons également dans cet article comment on fait une ligature partielle sur l'artère carotide. Par rapport à la fabrication de préparations similaires à partir d'animaux plus grands tels que les rats, les lapins et les humains, les vaisseaux de souris sont de petite taille et plus fragiles, ce qui nécessite des soins supplémentaires pour la manipulation lors de l'isolement chirurgical des vaisseaux et leur préparation pour la coloration et la microscopie des anticorps. Étant donné que le modèle animal le plus couramment utilisé pour la modification génétique est la souris, il devient essentiel pour de nombreux chercheurs de manipuler les vaisseaux de souris sans les endommager. Dans ce manuscrit, nous décrirons comment traiter les vaisseaux sanguins de souris lors de préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide. Aux fins de la démonstration, nous utiliserons des souris de type sauvage C57 / b6.
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Protocole
Les protocoles pour la ligature de la carotide partielle de la souris et l'isolement de l'aorte de la souris et de l'artère carotide pour l'immunocoloration sur le visage sont approuvés par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux (IBT 2014-9231).
1. Ligature de l'artère carotide partielle gauche
- Préparez l'espace chirurgical en plaçant un coussin chauffant de 12 pouces x 14 pouces sur la table et couvrez le coussinet et le dessus de table avec un grand drap chirurgical propre. Réglez le bras du support de la poutre de sorte que le champ de vision du stéréomicroscope se trouve dans la zone centrale du coussin chauffant.
- Allumez le coussin chauffant sur la table et réglez la molette de réglage 3 réglages sur le niveau de chaleur moyen. À ce réglage de la température, la surface du panneau chirurgical (voir 1.6.1) sera de 38 à 40 ° C.
- Placez une cage propre sur un autre coussin chauffant. Tournez le coussin chauffant comme indiqué ci-dessus. Cette cage sera utilisée pour le rétablissement après la chirurgie (voir 1.16) ainsi que le logement.
- Sur la table chirurgicale, placez une poche de stérilisation autoclavée contenant des ciseaux d'iris (1 paire), une pince à tissus (1 paire), une pince super grip (2 paires), des ciseaux à ressort (1 paire), un rétracteur contondant (1 paire, 2,5 mm de large) , Porte aiguilles rondes (1), suture de soie stérilisée 6-0, applicateurs à pointe de coton, mini applicateurs à pointe de coton, rideaux chirurgicaux et éponges de gaze de 2 "x 2". Placez également une bouteille de compression contenant 70% d'éthanol et une autre contenant du chlorure de chlorhexidine dans la table chirurgicale.
- Peser une souris. Le poids corporel est nécessaire pour déterminer la quantité appropriée d'analgésie, qui sera administrée immédiatement avant la chirurgie.
- Placez une souris dans la chambre d'induction.
- Allumez le réservoir d'oxygène et le vaporisateur anesthésique afin d'anesthésier la souris dans la chambre d'induction. Maintenir le niveau d'isoflurane à 2%. Il faut 3-5 minutes avant que la souris ne bouge.
- Alors que la souris est anesthée, Placez un petit morceau de drap chirurgical stérile (24 pouces x 24 pouces) sous le stéréomicroscope pour créer une surface chirurgicale. Ensuite, placez un panneau chirurgical acrylique (qui a été nettoyé avec 70% d'alcool) sur la surface drapée. Le panneau chirurgical devrait donc être sur le coussin chauffant mais séparé par deux couches de draps chirurgicaux.
- Lorsque la souris cesse de se déplacer dans la chambre d'induction, transférez la souris dans une zone de préparation pré-chirurgicale et placez son nez dans le cône du nez connecté au vaporisateur (2% d'isoflurane). Retirez les cheveux autour de la zone cervicale à l'aide d'un coupe-coupe électrique ou d'une lotion démaquillante. Nous recommandons la lotion anti-cheveux, car cette méthode ne produira pas de morceaux de cheveux lâches, ce qui est difficile à éliminer complètement de la zone chirurgicale.
- Avec le cône du nez en place, déplacez la souris vers le panneau chirurgical.
- Tapez les pattes avant droite et gauche sur le panneau chirurgical. Tapez les deux pattes arrièreSur le côté droit de la souris. Cela provoque une légère rotation du corps de la souris de sorte que le côté gauche de la zone du cou de la souris devienne mieux positionné pour une opération chirurgicale.
- Désinfectez la zone d'incision avec 70% d'alcool, le frottis chirurgical à la chlorhexidine et à nouveau avec 70% d'alcool. Couvrez la souris avec un drap chirurgical stérilisé, sauf pour la zone d'incision cervicale.
- Confirmez par pincement que la souris est complètement anesthésiée et donne une analgésie (Caprofen 3-5 mg / kg) par injection intraperitoneale ou sous-cutanée.
- Sous le microscope de dissection, faites une incision de la ligne médiane ventrale autour de la zone cervicale en utilisant un scalpel ou des ciseaux d'iris.
REMARQUE: Nous utilisons des ciseaux car la distance de travail du stéréomicroscope est limitée, ce qui rend difficile l'utilisation d'un scalpel. - Exposer l'artère carotide commune gauche (LCCA) en repoussant et en repositionnant les glandes salivaires qui couvrent les vaisseaux sanguins vers le côté gauche de la aNimal.
- Identifiez tous les vaisseaux sanguins dans le champ chirurgical ( figure 1 ). La LCCA se bifurque dans l'artère carotide interne gauche (ICA) et l'artère carotide externe gauche (ECA). L'artère thyroïdienne superficielle (STA) provient de la CEA du côté médian. L'artère occipitale (OA) provient habituellement de la CEA, mais chez certaines souris, elle provient de l'ICA.
- Relier toutes les branches de l'artère à l'exception de l'OA en utilisant une suture de soie stérilisée 6-0. Pour ce faire, effectuez les deux ligatures suivantes.
- Retirez doucement le tissu conjonctif autour et en dessous de l'artère carotide interne gauche (ICA). Prenez un morceau de suture de soie précueuse 6-0 (~ 2,5 cm) avec une pince et passez sous l'artère. En utilisant une autre pince, tirez la suture environ 1/3 de sa longueur et ligotez l'artère.
- Retirez le tissu conjonctif autour de l'artère carotide externe gauche (ECA) de la même manière décrit ci-dessus et faites une ligature proximale à la thyroïde supérieure gaucheD artère (STA) ( Figure 1 ). Veillez à ne pas endommager les fibres nerveuses qui se déroulent dans le champ chirurgical.
- Lorsque ces ligatures ont été faites, renvoyer les glandes salivaires à la position initiale et hydrater le champ chirurgical en plaçant 2-3 gouttes de solution saline stérile. Fermez la peau en utilisant des sutures vicryl revêtues de 6-0.
- Après la chirurgie, placez la souris dans la cage préchauffée (voir 1.2.1). La souris devrait se réveiller dans les 5 minutes et commencer à se promener. Une fois confirmé que la souris se comporte normalement, amener la cage dans la salle de logement des animaux.
- Observez la souris tous les jours pendant les 3 premiers jours de récupération. La souris peut être maintenue aussi longtemps que l'expérience l'exige dans les différentes conditions requises par le protocole expérimental. Les préparations en face peuvent être préparées à tout moment après la chirurgie.
2. In Face Immunostaining
- Éuthaniser une souris avec du CO 2 par surdosage par inhalation.
- Tapez la souris dans une position en position couchée (côté ventre latéral) sur une plaque de dissection.
- Exposer la cavité abdominale en effectuant une incision en ligne médiane à l'aide de ciseaux à l'iris.
- Exposez la cavité thoracique en coupant les côtes latéralement sur le sternum.
- Faire un sillon dans la veine cave ou couper une des artères fémorales pour drainer le sang.
- Insérez une aiguille 26 G attachée à une configuration de perfusion gravitaire (pression d'eau de 120 cm) dans le sommet du ventricule gauche et perfusez le système circulatoire avec une solution saline contenant de l'héparine (40 U / mL). Continuer la perfusion jusqu'à ce que la solution saline qui s'écoule de la coupe devienne claire.
- Mettre le système de perfusion de solution saline dans la solution de fixation contenant 4% de paraformaldéhyde dans du PBS (solution salée tamponnée au phosphate) et continuer à perfuser pendant 5 minutes de plus.
- Récoltez l'aorte et les artères carotides gauche et droite en utilisant des ciseaux et des pinces à extrémités franches et placez-les dans un tube conique de 50 ml contenant le fixateur sur de la glace.
- Transférer le vaisseau dans une boîte de Pétri contenant du PBS sous microscope de dissection, et retirer soigneusement les tissus graisseux et conjonctifs attachés à l'aorte et aux artères carotides. Séparer et diviser les artères de l'aorte et de la carotide longitudinalement pour exposer l'endothélium ( Figure 2 ).
- Transférer chaque récipient séparément dans un puits d'une plaque à 12 puits contenant 0,5 ml d'une solution de perméabilisation (0,1% de Triton X-100 dans du PBS) par puits. Perméabiliser les vaisseaux sanguins pendant 10 minutes avec un basculement à température ambiante (RT).
- Se laver brièvement avec PBS.
- Pour bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques, incuber les vaisseaux sanguins dans 10% de sérum normal à partir des espèces animales dans lesquelles les anticorps secondaires ont été fabriqués, dans TTBS (Tris-buffered saline (TBS) avec 2,5% Tween 20) pendant 30 minutes avec Basculer à la RT.
- Incuber les vaisseaux avec les anticorps primaires dilués de manière appropriée dans TTBS avec 10% de sérum normal (comme décrit ci-dessus) pendant une nuit avec un basculement à 4 ° C. Le niveauDe dilution doit être déterminée pour chaque anticorps.
- Effectuez la coloration de contrôle suivante.
- Incuber les vaisseaux avec TTBS au lieu d'un anticorps primaire suivi d'une incubation avec un anticorps secondaire.
- Incuber les vaisseaux avec TTBS contenant du sérum non immunisé (ou pré-immédiat) ou Ig du même animal (espèce) dans lequel des anticorps primaires ont été réalisés, suivis d'une incubation avec un anticorps secondaire.
- Omettre l'incubation avec un anticorps secondaire. Ces échantillons de contrôle doivent être manipulés de la même manière et en même temps que des colorations avec des anticorps spécifiques sont effectuées.
- Laver les vaisseaux sanguins 3 fois avec TTBS pendant 10 min chacun avec un basculement à la RT.
- Incuber avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence dilués de manière appropriée dans TTBS avec 10% de sérum normal (comme décrit ci-dessus) pendant 1 h avec un basculement à la RT. La coloration nucléaire avec DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) peut être effectuée simultanémentT cette étape en ajoutant 1 / 5.000 en volume d'une solution mère DAPI qui contient 5 mg / mL de DAPI dans H 2 O.
- Laver 3 fois avec TTBS pendant 10 min chacun avec un basculement à la température ambiante.
- Rincer brièvement dans PBS.
- Placez une goutte du réactif anti-décoloration sur un verre de couverture (22 mm x 50 mm) et placez un vaisseau sanguin sur le verre de couverture avec l'endothélium vers le bas.
- Placez un verre coulissant (22 mm x 75 mm) sur le vaisseau sanguin tout en évitant le piégeage des bulles.
- Placez la glissière sur un essoufflement propre au laboratoire ( p. Ex. Kimwipe) et recouvrez la glissière avec deux lingots de laboratoire. Collez doucement 3,5 kg de poids ( p. Ex., Utilisez une bouteille d'eau sur un livre épais) sur la glissière pendant 5 minutes maximum pour aplatir l'échantillon de vaisseaux sanguins en face.
- Retirez le poids et essuyez l'excès de solution autour de la lamelle.
- Appliquer un vernis à ongles aux 4 coins de la lamelle, placer les diapositives dans une boîte à glissière, coulisser vers le haut et garder dans l'obscurité à la RT(Ou 4 ° C) pendant la nuit. Ce processus aplatit davantage le tissu et facilite la microscopie à des grossissements élevés.
- Sceller le couvre-lit complètement à l'aide de vernis à ongles.
- Effectuez une microscopie dès que le vernis à ongles est sec.
- Si nécessaire, rangez les diapositives à -20 ° C.
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Résultats
Une image d'immunofluorescence typique en face de l'endothélium est illustrée à la figure 3 . Cette image montre une seule section optique d'une aorte de souris prise près de l'ouverture d'une artère intercostale (la grande zone osseuse en forme d'oeuf). L'aorte a été doublement colorée avec une protéine anti-VE-cadhérine (verte) et anti-VCAM-1 (molécule d'adhésion de cellules vasculaires 1) (rouge). Chaque cellule endothéliale est décrite...
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Discussion
Lors de la manipulation des vaisseaux sanguins de la souris, il est important de se rappeler que l'endothélium est fragile et que toute force mécanique excessive endommage les cellules endothéliales. Par exemple, les cellules endothéliales se cassent ou se détachent de la paroi du vaisseau si le vaisseau est perfusé avec trop de force, ce qui peut se produire facilement lorsque la vascularisation est perfusée à l'aide d'une seringue à main.
Pour obtenir une pression de perfusion ...
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Remerciements
Les activités de recherche des auteurs sont soutenues par des subventions de l'Institut national de la santé au Dr Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution injectable de chlorure de sodium à 0,9 % USP Sachet de 500 mL | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| Plaques à 12 puits | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 suture en vicryl | enduit Ethicon | J833G | |
| AF488 chèvre anti-rat IgG ; | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 chèvre anti-lapin IgG ; | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Lapin polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 pouces x 24 pouces | Cardinal Health | 4024 | |
| Enrouleurs émoussés, 2,5 mm de large | Outils de sciences fines | 18200-10 | |
| Caprofène (Rimadyl) ; | zoetis | NADA#141-199 | |
| Gommage à la chlorhexidine, 2 % | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Éponges de gaze de curiosité 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Coussin chauffant électrique, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Ciseaux | à irisFine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro verre de couverture 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Lames de microscope | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| sérum de chèvre normal | Equitech-Bio | GS05 | |
| Solution de paraformaldéhyde à 4 % dans PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Boîtes de Pétri 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Montage Antifade avec DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan Cortton Écouvillons | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini Aplicateurs à pointe de coton | VWR | 82004-050 | |
| Porte-aiguille à manche rond | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Suture en soie 6/0 | Fine Science Outils | 18020-60 | |
| Ciseaux à ressort | ROBOZ | RS-5601 | |
| Ciseaux à strabisme | Outils pour les sciences fines | 14075-09 | |
| Pince à super prise | Outils pour les sciences fines | 00649-11 | |
| Pansement transparent | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Références
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
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Réimpressions et autorisations
