Article de méthode

Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

DOI :

10.3791/55655

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18 mai 2017

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1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

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Dans cette méthode, nous présentons des procédures biochimiques pour l'isolement rapide et efficace des protéines de filament intermédiaire (IF) provenant de multiples tissus de souris. Les IF isolés peuvent être utilisés pour étudier les changements dans les modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse et d'autres analyses biochimiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les filaments intermédiaires (IF), ainsi que les filaments d'actine et les microtubules, forment le cytosquelette - un élément structurel critique de chaque cellule. Les mécanismes de fonctionnement normal fournissent aux cellules une résilience mécanique et résistante au stress, tandis qu'un cytosquelette SF dysfonctionnel compromet la santé cellulaire et a été associé à de nombreuses maladies humaines. Les modifications post-traductionnelles (PTM) régulent de manière critique la dynamique de l'IF en réponse aux changements physiologiques et aux conditions de stress. Par conséquent, la capacité de surveiller les changements dans la signature PTM des IF peut contribuer à une meilleure compréhension fonctionnelle et, en fin de compte, le conditionnement du système IF en tant que résonateur de stress pendant les lésions cellulaires. Cependant, le grand nombre de protéines IF, codées par plus de 70 gènes individuels et exprimés de manière dépendant des tissus, est un défi majeur pour trier l'importance relative des PTM différents. À cette fin, des méthodes permettant la surveillance des PTM sur les protéines IFÀ l'échelle de l'organisme, plutôt que pour les membres isolés de la famille, peut accélérer les progrès de la recherche dans ce domaine. Ici, nous présentons des méthodes biochimiques pour l'isolement de la fraction totale, détergente-soluble et détergente des protéines IF de 9 différents tissus de souris (cerveau, coeur, poumon, foie, intestin grêle, intestin grêle, pancréas, rein et rate). Nous démontrons en outre un protocole optimisé pour l'isolement rapide des protéines IF en utilisant la matrice de lysage et l'homogénéisation automatisée de différents tissus de souris. Le protocole automatisé est utile pour le profilage des IF dans des expériences avec un volume élevé d'échantillons (comme dans les modèles de maladies impliquant plusieurs animaux et des groupes expérimentaux). Les échantillons résultants peuvent être utilisés pour diverses analyses en aval, y compris le profil PTM à base de spectrométrie de masse. En utilisant ces méthodes, nous fournissons de nouvelles données pour montrer que les protéines IF dans différents tissus de souris (cerveau et foie) subissent des changements parallèles par rapport à leur expressionLes niveaux de tension et les PTM pendant le vieillissement.

Introduction

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Les IF sont une famille de protéines qui, chez l'homme, sont codées par 73 gènes et classées en six types majeurs: les types I-IV sont cytoplasmiques ( par exemple, les kératines épithéliales et capillaires (K), les desmin de myocytes, les neurofilaments, la protéine acide fibrillaire glieuse (GFAP) et d'autres); Type V sont les laminés nucléaires; Et le type VI sont des IF dans l'objectif 1 . En ce qui concerne leur organisation moléculaire, les protéines IF possèdent trois domaines communs: un domaine de "tige" à bobine enroulée hautement conservé et des domaines globulaires de "tête" et "queue". Les tétrastes de protéines IF se forment pour former des précurseurs de filaments courts, qui sont finalement incorporés dans des filaments matures qui forment des structures cytosquelettiques et nucléosquelettes dynamiques impliquées dans la protection mécanique 2 , la détection du stress 3 , 4 , la régulation de la transcription 5 et la croissance et d'autres fonctions cellulaires critiques"> 1 , 6 , 7 .

L'importance fonctionnelle du système IF est soulignée par l'existence de nombreuses maladies humaines causées par des mutations missense dans les gènes IF, y compris les neuropathies, les myopathies, les troubles de la fragilité de la peau, les dysfonctionnements métaboliques et les syndromes de vieillissement prématuré 8 . Certaines mutations du gène IF ne causent pas, mais prédisposent leurs porteurs à la progression de la maladie, comme les kératines épithéliales simples dans la maladie du foie 9 . Ce dernier est dû aux fonctions critiques de protection contre le stress des IF dans les épithéliums. Les IF en général sont parmi les protéines cellulaires les plus abondantes dans des conditions basales, mais sont encore fortement induites lors de divers types de stress 10 . Par exemple, des études récentes évaluant les changements à l'échelle du protéome dans le nématode C. elegans ont démontré que les IF multiples sont très régulées et enclines à l'agrégatPendant le vieillissement organique 11 , 12 . Étant donné que la maintenance d'une structure IF appropriée est essentielle pour la résistance cellulaire à diverses formes de stress 10 , l'agrégation FI peut également contribuer au déclin fonctionnel pendant le vieillissement. Cependant, des études au niveau de l'organisme examinant de multiples protéines IF de mammifères à travers différents tissus soumis au stress sont insuffisantes.

Les IF sont des structures hautement dynamiques qui s'adaptent aux besoins des cellulaires. Les kératines, par exemple, subissent un cyclisme indépendant de la biosynthèse entre un groupe protéique soluble (non filamenteux) et insoluble (filamentaire) 13 . Dans des conditions physiologiques normales environ 5%, le pool K8 / K18 total peut être extrait dans un tampon sans détergent, par rapport à environ 20% qui peut être solubilisé dans le détergent non ionique Nonidet P-40, qui est biochimiquement comparable à Triton- X100 14 , 15 . Au cours de la mitose, il y a une augmentation notable de la solubilité de l'épithéliale de type simple K8 et K18 14 , qui est moins apparente dans les kératines épidermiques mais plus apparente dans la vimentine et d'autres protéines IF de type III 15 , 16 . Les propriétés de solubilité des protéines IF sont étroitement réglementées par la phosphorylation, une modification clé après la traduction (PTM) pour le réarrangement des filaments et la solubilité 17 , 18 , 19 , 20 . La plupart des IF sont soumises à une réglementation étendue par un certain nombre de PTM sur des sites conservés, ce qui entraîne des changements fonctionnels 17 .

Le but de cette méthode est d'introduire des chercheurs qui sont nouveaux dans le champ IF pour l'extraction biochimique et les méthodes analytiques pour l'étude des protéines IF à travers de multiples tissus de souris. SpécifiqueNous nous concentrons sur l'isolement des protéines IF en utilisant une méthode d'extraction à haute teneur en sel et une évaluation des changements dans les PTM par spectrométrie de masse et par des anticorps ciblant PTM. Ces méthodes s'appuient sur les procédures précédemment publiées 21, mais incluent des modifications pour extraire différents types de protéines IF pour révéler un mécanisme commun de régulation dans la famille IF. Par exemple, l'acétylation de K8 à un résidu de lysine spécifique régule l'organisation du filament, tandis que l'hyperacétylation favorise l'insolubilité du K8 et la formation d'agrégats 22 . Des études récentes sur le profil protéomique mondial ont en outre révélé que la plupart des protéines IF spécifiques des tissus sont également des cibles pour l'acétylation et que la plupart des sites d'acétylation IF sont confinés au domaine de la tige très conservé. Cela souligne la nécessité de méthodes adaptées au profilage global du système IF. Nous introduisons également une méthode rapide d'isolement des protéines IF à partir de tissus multiples en utilisant une homogénéisation automatique en optiMatrice de lysisation. Les préparations résultantes sont appropriées pour l'analyse PTM en aval par spectrométrie de masse et d'autres méthodes.

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Protocole

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Le protocole est approuvé et exécuté conformément au Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université de Caroline du Nord.

1. Préparations

  1. Préparer le tampon Triton-X (1% de Triton X-100, 5 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), augmenter le volume dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4). Pour faire 500 ml: agiter 5 ml chacun de Triton X-100 et 500 mM d'EDTA dans 490 ml de PBS, pH 7,4. Conserver la solution tampon Triton-X à 4 ° C.
  2. Préparer un tampon de sel élevé (10 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM de NaCl, 1,5 M de KCl, 5 mM d'EDTA, 0,5% de Triton X-100, augmenter le volume dans du double distillât (dd) H 2 O). Pour préparer 500 ml, on agite 10 ml de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 ml de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 ml d'EDTA 0,5 M et 2,5 ml de Triton X-100, ajustez le volume à 500 ML en utilisant de l'eau distillée double). Stocker la solution tampon de sel élevée à 4 ° C.
  3. Juste avant l'utilisation, compléter une quantité appropriée de Triton-X et High Salt Buffer ( Par exemple 1 mL pour chaque échantillon de tissu de 25 mg) avec un cocktail d'inhibiteur de protéase ou de protéase / phosphatase et jeter tout tampon non utilisé contenant les inhibiteurs.
  4. Préparer 5 mM d'EDTA dans 1x PBS, pH 7,4. Pour faire 500 ml: agiter 5 ml d'EDTA 0,5 M dans 495 ml de 1x PBS, pH 7,4.
  5. Isoler différents organes de souris (cerveau, cœur, poumon, foie, pancréas, côlon, intestin, rein, rate) en utilisant des protocoles approuvés conformes aux directives vétérinaires et aux normes institutionnelles 23 . La procédure de collecte des tissus ne doit pas dépasser 5 minutes pour préserver l'intégrité de l'ARN et de la protéine des tissus riches en protéase ( par exemple, le pancréas doit être traité en premier).
  6. Couper une petite quantité de tissu (~ 5-20 mg) et placer dans une solution de stockage d'ARN, pour une extraction ultérieure de l'ARN, une synthèse d'ADNc et une analyse quantitative en temps réel de la PCR pour l'expression du gène IF. Placez les tubes de solution de stockage d'ARN avec des tissus à 4 ° C pendant la nuit et suivez le protocole du fabricant pour de plus amples informations.Torage et étapes d'isolement.
  7. Couper le reste du tissu en fragments plus petits ( par ex. 0,5 cm) et placer dans des cellules cryogéniques. Geler et stocker des flacons à -80 ° C ou de l'azote liquide pour un stockage à plus long terme.

2. IF Analyse d'expression génique

  1. Extraire l'ARN des tissus conservés dans le réactif de solution de stockage d'ARN. Utiliser toute méthode d'extraction d'ARN appropriée / préférée selon le protocole du fabricant.
  2. Quantifier la concentration d'ARN et utiliser 2 μg d'ARN pour générer de l'ADNc en utilisant un kit de transcription inverse approprié selon le protocole du fabricant.
  3. L'utilisation des amorces spécifiques du gène ADN spécifique de l'ADNc et de la souris IF met en place des réactions qPCR, y compris trois répétitions techniques de chaque échantillon ainsi qu'un contrôle en blanc selon le protocole du fabricant.
  4. Quantifier l'expression du gène IF comme changement de pli en comparant différentes conditions ( p. Ex. Tissu jeune ou ancien).

3. PRéparation des lysats totaux de tissu pour immunoblot

  1. Homogénéiser 25 mg de tissu dans 1 mL de 2x tampon d'échantillon SDS non réducteur. Omettre le colorant bleu de bromophénol à partir du tampon d'échantillon si un dosage de protéine colorimétrique doit être effectué pour quantifier la concentration de protéines.
  2. Ajouter 5% (v / v) de 2-mercaptoethanol (2-ME) pour faire des échantillons réduits. À 200 μL des échantillons non réducteurs, ajouter 10 μL de 2-ME.
  3. Déterminer la concentration de protéines en utilisant un dosage de protéines compatible avec les agents détergents et réducteurs. Si le colorant est déjà inclus dans le tampon d'échantillon, la quantité de protéine peut être estimée après avoir couru un gel via un certain nombre de techniques, y compris la tache à base de Coomassie 24 .
  4. Vortez tous les échantillons et chauffez à 95 ° C pendant 5 min.
  5. Effectuez le Western Blot sous des conditions réductrices et non réductrices. Exposer la membrane brièvement (<1 min) pour révéler les espèces monomères et plus longtemps (> 1 min) pour révéler des complexes de masse moléculaire élevéeNg de protéines IF. Si vous surveillez l'agrégation, examinez tout le gel / membrane (y compris le fond des puits de gel).
  6. Exécutez un gel parallèle et tachez avec une tache de protéine comme contrôle de chargement 24 . Dans les modèles de maladie ou les expériences sur les blessures, la tache de protéines totales doit être utilisée comme contrôle de chargement, par opposition aux immunoblots pour les protéines de «ménage» ( p . Ex. Actine, GAPDH) car celles-ci changent selon différentes conditions de stress.

4. Préparation des extraits solubles dans le sol et des extraits riches en sel des IF spécifiques des tissus

  1. Ajouter 1 ml de tampon Triton X-100 glacé dans un homogénéisateur à tube de verre et placez-le sur de la glace.
  2. Enlevez un petit morceau de tissu (~ 25 mg) à partir d'un stockage d'azote liquide et placez-le directement dans l'homogénéisateur de verre. Utilisez un pilon polytétrafluoroéthylène pour homogénéiser (50 coups) et évitez de faire des bulles. Conservez l'homogénéisateur et le lysat à tout moment.
  3. Transférer le lysat à un micron de 1,5 mLTube d'ocentrifugation sur glace et centrifuge à 20 000 xg pendant 10 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie (4 ° C).
  4. Recueillir la fraction surnageante dans un tube séparé. Il s'agit de la fraction soluble dans Triton X, qui peut être utilisée pour l'immunoprécipitation (ip) et l'analyse du pool de protéines IF soluble dans les détergents. Notez que les étapes 4.1-4.4 peuvent être répétées pour obtenir un extrait IF plus propre du tissu cérébral.
  5. Ajouter 1 mL de High Salt Buffer à la pastille de tissu, transférer à un homogénéisateur propre et lancer 100 traits. Transférer l'homogénat sur le tube de microcentrifugeuse et placer le tube sur un agitateur rotatif dans la chambre froide pendant 1 h.
  6. Centrifuger les homogénats à 20 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
  7. Ajouter 1 ml de tampon PBS / EDTA glacé à la pastille et homogénéiser la pastille (20 coups) dans un homogénéisateur propre comme étape finale de nettoyage *. Transférer dans un nouveau tube et centrifuger à 20 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour obtenir la protéine IF-Extrait riche en sel élevé (HSE).
    * En option, vortex au lieu d'homogénéisation à cette étape.
  8. Jeter le surnageant et dissoudre les pastilles dans 300 μL de tampon d'échantillon SDS non réducteur qui a été préchauffé. Décomposer la pastille initialement par pipettage et vortex, puis chauffer les échantillons pendant 5 min à 95 ° C.
  9. Vortex et pipette au besoin pour assurer la dissolution de la pastille. Il peut y avoir plusieurs minutes pour dissoudre complètement les pastilles.
  10. Conservez tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

5. Lysis automatisée des tissus pour l'extraction de la protéine IF dans les expériences en volume élevé

  1. Pour l'extraction de l'ARN, placer un tampon de lyse (600 μL de tampon par 25 mg de tissu) dans un tube contenant une matrice de lys D (utiliser de petites sphères de céramique) et l'impulsion deux fois pendant 25 s dans le lyser du tissu. Séparer le lysat de la matrice par centrifugation à 20 000 xg et passer à l'étape suivante isolément.
  2. Pour l'extraction des protéines, placez TritSur X-100 (ou tampon d'échantillon SDS si préparer le lysat total) dans un tube de lys avec matrice de lys SS (utiliser un seul cordon en acier inoxydable). Après avoir testé plusieurs matrices, cela a été sélectionné car il produit des extraits de protéines IF qui ont une qualité similaire à celle de la méthode traditionnelle de dounement. Notez que la méthode automatisée n'est pas optimale pour le pancréas et la rate, et le protocole d'homogénéisation standard doit être utilisé pour ces tissus.
  3. Pour procéder à la préparation d'un extrait de sel élevé, retirer le cordon en acier inoxydable du tube à l'aide d'un aimant et centrifuger les tubes à 20 000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C.
  4. Continuez avec l'étape 4.4 (ci-dessus) du protocole manuel.
  5. Conservez tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

6. Immuno-enrichissement des protéines IF modifiées après la traduction

  1. Préparer le tampon PBST (0,02% de Tween-20 dans PBS). Pour préparer 50 mL, ajouter 10 μL de Tween-20 à 50 mL de PBS, pH 7.4.
  2. Préparer l'anticorps PTMSolution (1-10 μg d'anticorps dans 200 μL de PBST). En général, 3 μg d'anticorps / réaction est une bonne condition de départ qui peut être optimisée si nécessaire.
  3. Pour chaque réaction, aliquotez 50 μL de perles magnétiques dans un tube à microcentrifugeuse, placez-le sur l'aimant et aspiraz la solution de stockage de perles.
  4. Conjuger les perles à l'anticorps immunoprécipitant en le suspendant à nouveau dans la solution d'anticorps et en incubant sur le rotateur (extrémité supérieure, pour assurer un mélange de petits volumes) à température ambiante pendant 20 min.
  5. Placez les tubes sur l'aimant et aspirer la solution d'anticorps.
  6. Rincer les billes conjuguées à des anticorps une fois dans 200 μL de PBST et retirer le tampon de lavage.
  7. Ajouter 0,6-1 mL de lysat tissulaire sur les perles, mélanger par pipetage doux et incuber pendant 3 h sur un rotateur dans une chambre froide.
  8. Placer les tubes sur l'aimant, enlever le lysat et laver les billes cinq fois avec 200 μL de PBST. Après la dernière étape de lavage, ramasser les perles dans 100 _6; L de PBS (sans Tween-20) et transférer à un nouveau tube propre. Placez le tube sur l'aimant.
  9. Aspirer le PBS et ajouter 100 μL de tampon d'échantillon non réducteur. Retirez 50 μL et ajoutez 2-ME (5%) pour réaliser des échantillons réducteurs. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.
  10. Séparez la fraction ip des perles sur l'aimant et la collectez dans un nouveau tube.
  11. Stocker les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

7. Préparation des échantillons de protéines IF pour l'analyse de spectrométrie de masse

  1. Organiser une consultation avec un expert en protéomique avant de lancer une étude, car il existe un temps et des coûts importants liés à l'analyse de la spectrométrie de masse.
  2. Prenez des précautions particulières pour éviter toute contamination. Manipuler tous les gels avec des gants propres et incuber dans des récipients propres, laver uniquement avec du ddH 2 O (éviter le savon).
  3. Exécuter 20-50 μL de l'échantillon HSE (des sections 4 et 5) sur un gel SDS-PAGE selon les conditions standard.
  4. Tachez avec une tache de protéine pendant 1 h. Rincer plusieurs fois et dé-tache dans ddH 2 O pendant la nuit. Les bandes de protéines IF doivent être facilement visibles après la décoloration.
  5. Placez le gel entre les protecteurs de feuilles en plastique, numérisez et marquez les bandes qui seront excisées et envoyées pour analyse.
  6. Accisez les bandes de protéines IF en utilisant un nouveau rasoir propre.
  7. Placez les bandes de gel dans des tubes de microcentrifugation propres et transférez-les dans une installation de spectrométrie de masse.

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Résultats

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Une nouvelle méthode rapide pour l'extraction à haute teneur en sel de protéines IF à partir de tissus de souris multiples utilisant une matrice de lysisation.

La méthode traditionnelle 25 , 26 d'isolement de la fraction de protéine de filament intermédiaire du tissu épithélial a été modifiée ici pour inclure 9 or...

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Discussion

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Les méthodes qui permettent la caractérisation biochimique des protéines IF peuvent être utiles pour comprendre de nombreux phénomènes pathophysiologiques dans les systèmes de mammifères, car les protéines IF sont à la fois des marqueurs et des modulateurs du stress cellulaire et tissulaire 29 . Le principe de la méthode actuelle repose sur les procédures initiales développées dans les années 1970 et 1980 pour isoler, séparer et reconstituer les protéines IF des cellules et des tissus, en utilisa...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le NIH octroie au NI R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] et P30 DK034987 [à UNC-Chapel Hill]. Les auteurs remercient Deekshita Ramanarayanan pour l'assistance avec les expériences qPCR et Western Blot.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009billes d’immunoprécipitation
PBSThermoFisher Scientific10010049pour tampons
Mini kit Purelink RNAThermoFisher Scientific12183018extraction d’ARN à partir de tissus
Purelink DNAse setThermoFisher Scientific12185010Asur colonne de digestion de l’ADN
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Daimant à utiliser avec des dynabeads
GelCode Blue Stain RéactifThermoFisher Scientific24592compatible avec la spectrométrie de masse colorant en gel
Pierce ECL Western BlotSubstrat ThermoFisher Scientific32106pour une utilisation dans le western blot
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacitéThermoFisher Scientific4368813pour l’analyse de l’expression génique
Système de PCR Proflex 3 x 32 puitsPCR4484073ThermoFisher Scientific
Membrane de transfert PVDF  ;ThermoFisher Scientific88520pour western blot
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778pour l’analyse qPCR
RNAlaterSolution ThermoFisher ScientificAM7020pour le stockage des tissus avant l’isolement de l’ARN
Novex 4-20 % Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOXGel protéique préfabriqué
Anti-kératine 8 anticorps (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428pour la détection par transfert western de K8
Anti-VimentineThermoFisher ScientificMA511883pour la détection par transfert Western de la vimentine
Tampon de transfert de glycine Tris (25x)ThermoFisher ScientificLC3675pour le transfert humide de gels de protéines
2x SDS Sample BufferThermoFisher ScientificLC2676pour la préparation échantillons de gel protéique
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755pour la course à pied gels protéinés
Perles de lyse - Matrix DMP Biomedicals116913100Perles de lyse et tubes matriciels pour la perturbation tissulaire et l’extraction de l’ARN
Perles de lyse - Matrix SSMP Biomedicals116921100Perles de lyse et tubes matriciels pour la perturbation tissulaire et l’extraction de protéines
Spectrophotomètre NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEMesure des protéines et des acides nucléiques
Homogénéisateur Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119Homogénéisateur tissulaire automatisé
Système de

Références

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