Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

L’objectif global de cette procédure biochimique est d’isoler des fractions enrichies en filaments intermédiaires de plusieurs tissus de souris afin d’étudier les modifications post-traductionnelles des différentes protéines de filaments intermédiaires spécifiques aux tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des filaments intermédiaires, telles que la façon dont la fonction et la régulation de ces importantes protéines cytosquelettiques protectrices du stress sont affectées au cours du vieillissement des mammifères. Le principal avantage de cette technique est que l’intégration d’une étape automatisée de lyse tissulaire permet aux utilisateurs de traiter plusieurs échantillons de tissus de manière rapide et efficace.

Pour commencer, ajoutez un millilitre de tampon Triton X-100 glacé complété par des inhibiteurs de protéase dans un homogénéisateur en tube de verre et placez-le sur de la glace. Retirez un petit morceau de tissu du stockage d’azote liquide et placez-le directement dans l’homogénéisateur en verre. Ensuite, tout en gardant l’homogénéisateur et l’échantillon sur de la glace en tout temps, utilisez environ 50 coups d’une pastille de polytétrafluoroéthylène pour homogénéiser l’échantillon tout en minimisant la formation de bulles.

Transférez le lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur de la glace et centrifugez l’échantillon à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, collectez la fraction surnageante soluble de Triton X dans un tube séparé. Cette fraction peut être utilisée pour l’immunoprécipitation et l’analyse du pool soluble dans les détergents des protéines FI.

Ensuite, ajoutez à la pastille tissulaire un millilitre de tampon à haute teneur en sel complété par des inhibiteurs de protéase. Transférez-le dans un homogénéisateur propre et dénoncez 100 coups. Transférez l’homogénat dans le tube de microcentrifugation et placez le tube sur un agitateur rotatif dans la chambre froide pendant une heure.

Centrifugez les homogénats à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes et jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon PBS EDTA glacé à la pastille et transférez-la dans un homogénéisateur propre comme dernière étape de nettoyage. Après homogénéisation, transférez l’échantillon dans un nouveau tube et centrifugez-le à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour obtenir l’extrait riche en protéines IF à haute teneur en sel, ou HSC.

Jetez le surnageant et dissolvez la pastille dans 300 microlitres de tampon d’échantillon SDS non réducteur préchauffé. Cassez la pastille d’abord par pipetage et vortex. Ensuite, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Vortex et pipette au besoin, pour s’assurer que la pastille est complètement dissoute, ce qui peut prendre plusieurs minutes. Conservez tous les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Pour effectuer l’extraction de l’ARN, ajoutez un tampon de lyse dans un tube contenant la matrice de lysine D, puis ajoutez le tissu de l’échantillon dans le lyseur de tissu et pulsez deux fois pendant 25 secondes chacun.

Séparez le lysat de la matrice par centrifugation à 20 000 fois G.Pour l’extraction de protéines, ajoutez du Triton X-100 ou un tampon d’échantillon SDS si vous préparez du lysat total. Dans un tube de lysine avec matrice de lysine SS. Ensuite, ajoutez le tissu de l’échantillon. Pulsez brièvement l’échantillon pour mélanger.

Pour préparer le HSC, utilisez un aimant pour retirer la perle d’acier inoxydable du tube et centrifugez les tubes à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Séparez les fractions surnageante et granulaire et procédez comme indiqué précédemment dans la vidéo. Préparez le tampon PBST en ajoutant 10 microlitres de T20 à 50 millilitres de PBS pH 7,4.

Préparez ensuite une solution d’anticorps PTM en ajoutant un à 10 microgrammes d’anticorps à 200 microlitres de PBST. Aliquote 50 microlitres de billes magnétiques dans un micro tube à centrifuger. Placez-le sur l’aimant et aspirez la solution de stockage des billes.

Conjuguez les billes à l’anticorps d’immunoprécipitation en les remettant en suspension dans la solution d’anticorps et en incubant l’échantillon sur un rotateur à température ambiante pendant 20 minutes. Placez les tubes sur l’aimant et aspirez la solution d’anticorps. Utilisez ensuite 200 microlitres de PBST pour rincer une fois les billes conjuguées d’anticorps et retirez la solution.

Ajoutez 0,6 à un millilitre de lysat tissulaire aux billes. Mélangez par pipetage doux et incubez la solution sur un rotateur dans une pièce froide pendant trois heures. Placez les tubes sur l’aimant et retirez le lysat, puis utilisez 200 microlitres de PBST pour laver les billes cinq fois.

Après la dernière étape de lavage, récupérez les billes et 100 microlitres de PBS et transférez les billes dans un nouveau tube propre. Placez le tube sur l’aimant, puis aspirez le PBS. Retirez le tube de l’aimant et ajoutez 100 microlitres de tampon d’échantillon non réducteur.

Extrayez 50 microlitres du tube et combinez-le avec 5%2ME pour obtenir des échantillons réducteurs. Chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Avec le tube sur l’aimant, collectez la fraction IP des billes et transférez-la dans un tube frais.

Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Pour éviter la contamination des échantillons de protéines pour l’analyse par spectrométrie de masse, utilisez des gants propres pour manipuler tous les gels et incubez-les dans des récipients propres qui ont été lavés uniquement avec DD H2O. Analysez 20 à 50 microlitres de l’échantillon HSE sur un gel de page SDS selon les conditions standard.

Après avoir coloré le gel conformément au protocole de texte, placez le gel entre les protecteurs de feuille de plastique. Ensuite, scannez et marquez les bandes qui seront excisées. Utilisez un rasoir neuf et propre pour exciser les bandes de protéines IF et placez les bandes dans des tubes de microcentrifugation propres sur de la glace avant de les soumettre à une analyse par spectrométrie de masse.

Cette figure montre un résultat typique de HSE à partir de neuf tissus de souris isolés à l’aide de la méthode rapide. Notez que cette méthode ne fonctionne pas bien sur le pancréas et la rate, et produit des bandes supplémentaires dans un échantillon de gros intestin. Cette analyse de l’expression génique montre que la kératine 8 est régulée à la hausse au cours du vieillissement.

De plus, les Western Blots montrent que la kératine 8 est fortement régulée à la hausse dans le foie des souris âgées. Ici, un HSE hépatique obtenu à l’aide du protocole automatisé démontre le fort enrichissement en kératines 8 et 18 sur le gel. L’analyse par spectrométrie de masse montre que K8 et K18 dans le foie d’une souris âgée ont plusieurs sites de phosphorylation et d’acétylation qui ne sont pas présents dans le foie de la jeune souris.

Semblable aux modifications de la kératine dans le foie, l’analyse du tissu cérébral par QPCR révèle une induction quintuple de l’ARNm GFAP dans le cerveau des souris de 24 mois par rapport aux souris de trois mois. Enfin, l’analyse des protéines des extraits à haute teneur en sel par coloration de Coomassie et les immuno-transferts de fractions totales et enrichies en acétyllysine révèlent que la protéine GFAP est régulée à la hausse et acétylée dans le cerveau de souris âgée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le mélange de protéo basé sur la spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les modifications post-traductionnelles importantes et les partenaires de liaison des protéines de filament intermédiaires dans différentes conditions physiologiques et physiopathologiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les protéines de filament intermédiaire de différents tissus de mammifères.