Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

L'objectif général de cette procédure biochimique est d'isoler des fractions enrichies en filaments intermédiaires à partir de plusieurs tissus de souris afin d'étudier les modifications post-traductionnelles des différentes protéines de filaments intermédiaires spécifiques aux tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des filaments intermédiaires, comme la manière dont la fonction et la régulation de ces protéines cytosquelettiques importantes pour la protection contre le stress sont affectées au cours du vieillissement des mammifères. Le principal avantage de cette technique est qu'elle intègre une étape automatisée de lyse des tissus, permettant aux utilisateurs de traiter plusieurs échantillons de tissus de manière rapide et efficace.

Pour commencer, ajoutez un millilitre de tampon Triton X-100 glacé enrichi d'inhibiteurs de protéases dans un homogénéisateur en verre et placez-le sur de la glace. Prélevez un petit morceau de tissu conservé dans l'azote liquide et placez-le directement dans l'homogénéisateur en verre. Ensuite, tout en maintenant l'homogénéisateur et l'échantillon constamment sur de la glace, effectuez environ 50 allers-retours avec un pilon en tétrafluoroéthylène pour homogénéiser l'échantillon, en minimisant la formation de bulles.

Transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre sur de la glace, puis centrifugez l'échantillon à 20 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, récupérez la fraction surnageante soluble dans le Triton X dans un tube séparé. Cette fraction peut être utilisée pour la précipitation immunologique et l'analyse du pool de protéines IF solubles dans le détergent.

Ensuite, ajouter un millilitre de tampon à haute concentration saline, complété par des inhibiteurs de protéases, au culot tissulaire. Transférer le mélange dans un homogénéisateur propre et effectuer 100 mouvements de piston. Reverser l'homogénat dans le tube de microcentrifugation et placer le tube sur un agitateur rotatif dans la chambre froide pendant une heure.

Centrifuger les homogénats à 20 000 × g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes et jeter le surnageant. Ajouter un millilitre de tampon PBS EDTA glacé au culot et le transférer dans un homogénéisateur propre comme étape finale de purification. Après homogénéisation, transférer l'échantillon dans un nouveau tube et le centrifuger à 20 000 × g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour obtenir l'extrait salin concentré riche en protéines IF, ou HSC.

Jetez le surnageant et dissolvez le culot dans 300 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS non réducteur préchauffé. Dissociez le culot initialement par pipetage et vortexage. Puis chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Vortexez et pipetez selon les besoins, afin de garantir que le culot soit complètement dissous, ce qui peut prendre plusieurs minutes. Conservez tous les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Pour effectuer l'extraction d'ARN, ajoutez le tampon de lyse dans un tube contenant la matrice D de lysine, puis ajoutez le tissu échantillon au lyseur de tissus et appliquez deux impulsions de 25 secondes chacune.

Séparer le lysat de la matrice par centrifugation à 20 000 fois G. Pour l'extraction des protéines, ajouter du Triton X-100 ou un tampon d'échantillonnage SDS si on prépare un lysat total. Dans un tube à lysine contenant la matrice de lysine SS. Puis, ajouter le tissu échantillon. Agiter brièvement l'échantillon pour mélanger.

Pour préparer les CSH, utilisez un aimant pour retirer la bille en acier inoxydable du tube, puis centrifugez les tubes à 20 000 × g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Séparez les fractions de surnageant et de culot et procédez comme indiqué précédemment dans la vidéo. Préparez le tampon PBST en ajoutant 10 microlitres de T20 à 50 millilitres de PBS pH 7,4.

Ensuite, préparez la solution d'anticorps PTM en ajoutant un à dix microgrammes d'anticorps à 200 microlitres de PBST. Aliquotez 50 microlitres de billes magnétiques dans un tube de microcentrifugeuse. Placez-le sur l'aimant et aspirez la solution de conservation des billes.

Conjuguer les billes à l'anticorps d'immunoprécipitation en resuspendant les billes dans la solution d'anticorps et en incubant l'échantillon sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 20 minutes. Placer les tubes sur l'aimant et aspirer la solution d'anticorps. Rincer ensuite les billes conjuguées à l'anticorps une fois avec 200 microlitres de PBST, puis éliminer la solution.

Ajoutez de 0,6 à un millilitre de lyzat tissulaire sur les billes. Mélangez en pipettant doucement et incubez la solution sur un agitateur rotatif dans une chambre froide pendant trois heures. Placez les tubes sur l'aimant et retirez le lyzat, puis lavez les billes cinq fois avec 200 microlitres de PBST.

Après la dernière étape de lavage, récupérez les billes et 100 microlitres de PBS, puis transférez les billes dans un nouveau tube propre. Placez le tube sur l'aimant, puis aspirez le PBS. Retirez le tube de l'aimant et ajoutez 100 microlitres de tampon d'échantillonnage non réducteur.

Prélevez 50 microlitres de l'échantillon dans le tube et mélangez-les avec du 5 %2ME pour obtenir des échantillons réducteurs. Chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. En plaçant le tube sur l'aimant, récupérez la fraction d'IP à partir des billes et transférez-la dans un tube neuf.

Conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Pour éviter toute contamination des échantillons protéiques destinés à l'analyse par spectrométrie de masse, manipuler tous les gels avec des gants propres et les incuber dans des récipients propres ayant uniquement été rincés avec de l'H2O DD. Faire migrer 20 à 50 microlitres de l'échantillon HSE sur un gel SDS-PAGE selon les conditions standard.

Après avoir coloré le gel selon le protocole indiqué dans le texte, placez le gel entre des pochettes plastiques. Ensuite, numérisez-le et marquez les bandes qui seront excisées. Utilisez un rasoir neuf et propre pour exciser les bandes protéiques IF et placez les bandes dans des tubes microcentrifuge propres sur de la glace avant de les soumettre à une analyse par spectrométrie de masse.

Cette figure montre un résultat typique d'ESH provenant de neuf tissus de souris isolés à l'aide de la méthode rapide. Notez que cette méthode ne fonctionne pas bien sur le pancréas et la rate, et donne des bandes supplémentaires dans un échantillon d'intestin grêle. Cette analyse d'expression génique montre que la kératine 8 est surexprimée au cours du vieillissement.

De plus, les immunotransferts montrent que la kératine 8 est fortement surexprimée dans les foies de souris âgées. Ici, une électrophorèse HSE hépatique obtenue à l’aide du protocole automatisé démontre l’enrichissement marqué en kératines 8 et 18 sur le gel. Une analyse par spectrométrie de masse révèle que les K8 et K18 du foie d’une souris âgée présentent de multiples sites de phosphorylation et d’acétylation absents dans le foie de la souris jeune.

De façon similaire aux modifications de la kératine dans le foie, l'analyse du tissu cérébral par QPCR révèle une induction cinq fois plus élevée de l'ARNm de la GFAP dans le cerveau de souris âgées de 24 mois par rapport à celles âgées de trois mois. Enfin, l'analyse protéique des extraits à haute teneur en sel par coloration au Coomassie, ainsi que les immunotransferts des fractions totales et enrichies en lysine acétylée, montrent que la protéine GFAP est surexprimée et acétylée dans le cerveau de la souris âgée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le protéomique basée sur la spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme quelles sont les modifications post-traductionnelles et les partenaires de liaison importants des protéines des filaments intermédiaires durant différentes conditions physiologiques et physiopathologiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler des protéines de filaments intermédiaires à partir de différents tissus de mammifères.