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Genetics

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55689
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

DNA-Protein-Wechselwirkungen sind für mehrere biologische Prozesse essentiell. Bei der Auswertung von zellulären Funktionen ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unentbehrlich für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein mächtiges Werkzeug, um solche Wechselwirkungen in vivo zu analysieren .

Abstract

Mehrere zelluläre Prozesse, einschließlich DNA-Replikation und Reparatur, DNA-Rekombination und Genexpression, erfordern Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA. Daher regeln DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrere physiologische, pathophysiologische und biologische Funktionen wie Zelldifferenzierung, Zellproliferation, Zellzykluskontrolle, Chromosomenstabilität, epigenetische Genregulation und Zelltransformation. In eukaryotischen Zellen interagiert die DNA mit Histon- und Nonhiston-Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Mehrere technische Werkzeuge können verwendet werden, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu analysieren, wie die Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting. Diese Techniken analysieren jedoch die Protein-DNA-Interaktion in vitro , nicht im zellulären Kontext. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine Technik, die Proteine ​​an ihren spezifischen DNA-Bindungsstellen einfängt, wodurch die Identifizierung der DNA-Protein-Wechselwirkung ermöglicht wirdS in ihrem Chromatin-Kontext. Es erfolgt durch Fixierung der DNA-Protein-Wechselwirkung, gefolgt von einer Immunopräzipitation des Proteins von Interesse. Anschließend wurde die genomische Stelle, an der das Protein gebunden war, charakterisiert. Hier beschreiben und diskutieren wir ChIP und zeigen ihren analytischen Wert für die Identifizierung der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) -induzierten Bindung des Transkriptionsfaktors SMAD2 an SMAD Bindungselemente (SBE) innerhalb der Promotorregion des Tyrosin- Proteinkinase-Kit (c-KIT) -Rezeptorligand Stammzellfaktor (SCF).

Introduction

Im Nukleus von Eukaryoten interagiert DNA mit Histonproteinen und nonhistonischen Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Im physiologischen, pathophysiologischen und zellbiologischen Kontext werden zelluläre Funktionen räumlich und zeitweise durch chromatin-koordinierte Genexpression kontrolliert. DNA-Protein-Wechselwirkungen haben eine wesentliche Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen wie DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur sowie Protein-Expression. Daher ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen ein unentbehrliches Werkzeug bei der Bewertung von Genexpression und Zellfunktion.

Es gibt mehrere Techniken zur Beurteilung von DNA-Protein-Wechselwirkungen in vitro , wie der Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting 1 , 2 . Diese Techniken analysieren jedoch nicht die Protein-DNA-Wechselwirkung innerhalb des Chromatin- und Zellkontextes. ChIP iSa-Technik, die Proteine, die an ihre spezifischen DNA-Bindungsstellen gebunden sind, erfasst und dadurch die Identifizierung von DNA-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des Chromatinkontextes erleichtert. Die Technik wurde ursprünglich von Gimour und Lis für die Beurteilung der RNA-Polymerase II-Bindung an spezifische Gene in Escherichia coli und Drosophila melanogaster 3 , 4 entwickelt . Es wird durch Fixierung der DNA-Protein-Komplexe durchgeführt, gefolgt von der Durchführung der Chromatingextraktion und der Scherung der DNA in ~ 200 Basenpaar (bp) Fragmente. Anschließend wird das DNA-gebundene Protein von Interesse durch Immunpräzipitation isoliert. Nach der Umkehrung der DNA-Protein-Vernetzung wird die DNA gereinigt und analysiert. Für die Analyse der Proteinbindungsstellen können mehrere Methoden angewendet werden, die von der Nukleinsäuresequenz der Proteinbindungsstelle innerhalb des Zielgens 5 abhängen. In Fällen, in denen die DNA-Sequenz bekannt ist, ist Standard PolYmerase Kettenreaktionen (PCR) können angewendet werden, wobei spezifische Primerpaare, die die bekannte Bindungsstelle flankieren, angewendet werden. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) kann auch verwendet werden 6 . In Fällen, in denen die Sequenz unbekannt ist, kann ChIP mit DNA-Mikroarrays (ChIP-on-Chip), DNA-Sequenzierung (ChIP-seq) oder Klonierungstechniken 7 , 8 , 9 kombiniert werden.

Der TGF-β-Weg hat starke Tumorunterdrückungsfunktionen und ist ein Schlüsselweg in der Zelldifferenzierung. Es wird durch die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex aktiviert, was zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren führt. Nach ihrer Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4 verschiebt sich der SMAD-Komplex in den Zellkern und bindet an die SBE innerhalb der Promotorregion der Zielgene, wo er Gene kontrolliert, die den Zellzyklus, die Apoptose und die Zelldifferenzierung kontrollierenauf. Die Transkriptionsreaktion auf die TGF-β-Stimulation ist zelltyp- und kontextspezifisch 10 . In letzter Zeit haben wir eine positive Rückkopplungsschleife zwischen TGF-β und dem c-KIT-Pfad 11 beschrieben . In diesem Modell bindet TGF-β1-aktiviertes SMAD2 an den c-KIT-Liganden-Promotor und induziert seine Expression und Sekretion. Anschließend aktiviert der c-KIT-Ligand den c-KIT-Rezeptor auto- und para-crinisch. Die c-KIT-Rezeptor-Aktivierung führt zu STAT3 Tyr 705 -phosphorylierung über JAK1 / 2. Nach der STAT3-Aktivierung und der nuklearen Translokation bindet STAT3 an das TGF-β1-Liganden-Gen und reguliert seine Expression.

Hier zeigen wir die wesentliche Rolle der ChIP-Analyse zur Identifizierung der SMAD2-Bindung an den c-KIT-Rezeptor-Liganden-Promotor und zur Identifizierung des Signaltransducers (und) Activators (von) Transkription 3 (STAT3-Bindung an die TGF- & bgr; 1- Gen).

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Protocol

1. Vorbereitung von Lösungen

  1. Bereiten Sie für jeden Versuch die folgenden Lösungen vor.
    1. Für die Fixierlösung 37% Formaldehyd zuzubereiten und bei RT zu lagern. Verdünnen Sie es in 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,42%.
      ACHTUNG: Formaldehyd wird als reizend, korrosiv, mutagen, teratogen und karzinogen eingestuft. Nicht einnehmen. Gas / Dämpfe / Dampf / Aerosol nicht einatmen. Bei unzureichender Belüftung Atemschutzgerät anlegen. Berührung mit Haut und Augen vermeiden. Von Inkompatibilitäten fernhalten, wie Oxidationsmittel, Reduktionsmittel, Säuren, Laugen und Feuchtigkeit.
    2. Für die Glycin-Stop-Fix-Lösung 0,125 M Glycin in 1x PBS-Lösung zubereiten und bei RT aufbewahren.
    3. Für die Zellschabelösung eine 1x PBS-Lösung in dH 2 O vorbereiten und auf Eis aufbewahren. Direkt vor der Verwendung Proteinase-Inhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) tOa Endkonzentration von 0,5 mM.
      ACHTUNG: PMSF ist als korrosiv und giftig eingestuft; Schutzkleidung tragen und in einem belüfteten Bereich verwenden.
    4. Vor der Verwendung des Zell-Lyse-Puffers (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% NP40) wurde 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO): 104 mM 4- ( 2-Aminoethyl) benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid (AEBSF), 80 μM Aprotinin, 4 mM Bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM Leupeptin und 1,5 mM Pepstatin A) und 0,5 mM PMSF.
    5. Direkt vor der Verwendung des Kerne-Lyse-Puffers (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1% SDS) fügen Sie 1X PIC und 0,5 mM PMSF hinzu.

2. Zellfixierung und Scherung

  1. Wachsen Sie die Zellen auf 70-80% Konfluenz auf 10 cm Gewebekulturplatten. Stimulieren Sie die Zellen nach den experimentellen Zielen.
  2. Das Gewebekulturmedium entfernen, 5 ml Fixierlösung zugeben und inkubierenDie Zellen für 10 min bei RT auf einer Schüttelplattform.
  3. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS.
  4. Entfernen Sie die 1x PBS, fügen Sie 5 ml Glycin-Stop-Fix-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei RT auf einer Schüttelplattform.
  5. Entfernen Sie die Glycin-Stop-Fix-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS.
  6. Entfernen Sie die 1x PBS, fügen Sie 2 ml Zellschaberlösung hinzu und ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Übertragen Sie die geernteten Zellen auf ein konisches Rohr auf Eis.
  7. Die Proben für 10 min bei 600 xg und 4 ° C zentrifugieren.
  8. Den Überstand entfernen, das Pellet in 1 ml 1X-Zell-Lysepuffer resuspendieren und 30 min auf Eis inkubieren. Alternativ das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren.
  9. Sobald das Pellet im Zelllysepuffer resuspendiert ist, übergeben Sie die Zellsuspension auf einen eiskalten Dounce-Homogenisator und treten für 10 Hübe mit einem Typ-B-Pest aufE für zellunterbrechung
  10. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben für 10 min bei 2.400 xg und 4 ° C.
  11. Den Überstand verwerfen, das Pellet in 350 & mgr; l Kornverdauungspuffer resuspendieren und die Proben 5 min bei 37 ° C inkubieren.
  12. Mikrokokken-Nuklease (1 U / μL) zugeben und durch Vortexen mischen. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 5-20 min; Mischen Sie die Proben alle 2 min durch Inversion.
    HINWEIS: Die Zeit- und Enzymkonzentration unterscheidet sich zwischen Zelllinien und kann bei der suboptimalen enzymatischen Scherung eine Optimierung erfordern.
  13. Alternativ erreichen Sie die Chromatin-Scherung durch Ultraschallbehandlung mit handelsüblichen Schallapparaten.
    HINWEIS: Die Sondenbedingungen erfordern eine Optimierung. Ein Optimierungsbeispielprotokoll wird unten unter Verwendung eines Probenvolumens von 300 & mgr; l und einer Probenverarbeitungsleistung von 25% bereitgestellt.
    1. Nach Schritt 2.10 den Überstand verwerfen und den n resuspendierenUnclear Pellet in 1,0 ml handelsüblicher Scherpuffer.
    2. Aliquotieren Sie 300 μl des resuspendierten Kernpellets in drei 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Lege sie auf Eis.
    3. Die 3 Aliquots des fixierten Chromatins mit 25% iger Leistung mit 3 verschiedenen Bedingungen abscheren, um die optimalen Beschallungsbedingungen zu bestimmen:
      5 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls.
      10 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls.
      20 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls.
    4. Fahren Sie mit Schritt 2.15 fort, wie unten beschrieben.
  14. Nach der Inkubation mit der Mikrokokken-Nuklease werden 7 μl eiskaltes 0,5 M EDTA zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
  15. Zentrifugieren der Proben mit der gescherten DNA für 10 min bei 16.200 xg und 4 ° C.
  16. Übertragen Sie den gescherten DNA-haltigen Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Aliquot 50 μL in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen zur Bestätigung der suCcessful Scherung der DNA (Abschnitt 3). Verwenden Sie das verbleibende Volumen sofort für die Immunpräzipitation (Abschnitt 4) oder lagern Sie es bei -80 ° C.

3. Bestätigung der Scherwirkung

  1. Füge 150 μl nukleasefreies dH 2 O und 10 μl 5 M NaCl zu dem 50 μl Aliquot des gescherten Chromatins aus Schritt 2.16 hinzu.
  2. Inkubieren Sie die Proben bei 65 ° C für 4 h, um die Vernetzungen umzukehren.
  3. 2 & mgr; l RNase A (10 & mgr; g / & mgr; l) zugeben und die Proben bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
  4. 10 μl Proteinase K (0,5 μg / μL) zugeben und die Proben bei 42 ° C für 90 min inkubieren.
  5. Zur Reinigung der DNA eine Phenol / Chloroform-Extraktion 12 durchführen .
    1. Fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 200 μl hinzu. 200 μl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zur Probe geben und 20 s vortexen.
    2. Zentrifuge bei RaumtemperaturFür 5 min bei 16.000 x g. Die obere wässrige Phase vorsichtig entfernen und auf ein frisches Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, kein Phenol während des Pipettierens zu tragen.
    3. Fügen Sie 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat (NH 4 OAc), pH 5,2, hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals mit einem Finger flackern. Fügen Sie 2,5 Volumina eiskaltes 100% Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vortexen für 5 s. Inkubieren Sie die Probe O / N bei -20 ° C oder mindestens 1 h bei -80 ° C.
    4. Die Probe wird für 30 min bei 4 ° C und 16000 xg zentrifugiert, um die cDNA zu pelletieren.
    5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. 1 ml RT, 70% Ethanol zugeben und das Röhrchen mehrmals umkehren.
    6. Die Probe für 2 min bei 4 ° C und 16000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
    7. Das Pellet für 5-10 min bei RT trocknen. Das Pellet wird in 30 μl dH 2 O resuspendiert.
  6. Verwenden Sie ein 5 und 10 μl Aliquot der gereinigten DNA für die Gelelektrophorese mit einem 1% TAEAgarosegel
    HINWEIS: Erfolgreiche Chromatin-Scherung führt zu einem 200-1.500 bp DNA-Muster. Wenn die Scherung nicht erfolgreich ist, bestimmen Sie die optimalen Scherbedingungen für die spezifischen Zellen durch Modifizieren der Inkubationszeit des Scherungsschrittes (Schritt 2.12) auf 5, 10 und 15 min.
  7. Verwenden Sie die restliche Probe, um die DNA-Konzentration der Probe zu analysieren. Reverse-berechnen die DNA-Konzentration in der Scher-Chromatin-Probe (Schritt 2.16); Für jede Behandlungsgruppe für die Immunpräzipitation die gleichen DNA-Mengen verwenden (Abschnitt 4).

4. Immunpräzipitation

  1. Kombinieren Sie 10-25 μg des gescherten, vernetzten Chromatins (Schritt 2.16) mit 25 μl ChIP-Grad-Protein G-Magnetperlen, 10 μl Immunpräzipitations-Verdünnungspuffer (Stammlösung: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA und 167 mM NaCl) und 1 & mgr; l PIC.
  2. Nach 4 h Inkubation fügen 1-10 μg Antikörper (der Antikörper-Konzentrat) hinzuWird auf der Grundlage der Affinität des Antikörpers variieren; Es sollte zunächst nach Herstellerempfehlungen verwendet und gegebenenfalls experimentell optimiert werden) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und dH 2 O zu einem Endvolumen von 100 μl zugegeben.
    ANMERKUNG: Anstelle des oben beschriebenen direkten Immunpräzipitationsverfahrens kann das indirekte Immunpräzipitationsverfahren verwendet werden, indem zuerst das Chromatin mit den Antikörpern kombiniert und anschließend Protein G magnetische Perlen zugesetzt werden.
  3. Inkubieren Sie die Proben auf einem End-to-End-Rotator für 4-12 h bei 4 ° C.

5. Elution

  1. Legen Sie die Rohre auf einen Magnetständer. Sobald die magnetischen Perlen auf der Seite des Rohres aggregieren, entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
  2. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 μl Waschpuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 und 150 mM NaCl); Mischen, indem man das Röhrchen mehrmals umkehrt. Legen Sie den Schlauch auf den Magnetständer aEntfernen Sie den Waschpuffer sorgfältig und entsorgen Sie ihn, sobald die magnetischen Perlen auf der Seite des Röhrchens aggregieren.
  3. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 800 μl Waschpuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 und 500 mM NaCl); Mischen, indem man das Röhrchen mehrmals umkehrt. Legen Sie den Schlauch auf den Magnetständer und entfernen Sie den Waschpuffer vorsichtig und entsorgen Sie ihn, sobald sich die magnetischen Perlen auf der Seite des Rohres zusammensetzen.
  4. Die Perlen in 50 & mgr; l Elutionspuffer (1% SDS und 100 mM NaHCO 3 ) resuspendieren und die Proben auf einem End-to-End-Rotator für 15 min bei RT inkubieren.
  5. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetständer, und sobald sich die magnetischen Perlen an der Seite des Röhrchens sammeln, übergeben Sie den Überstand in ein frisches Rohr.
  6. Fügen Sie 6 μl 5 M NaCl hinzu, um die Vernetzung umzukehren, und 2 μl Proteinase K (0,5 μg / μL). Nach dem Mischen der Proben die Proben für 2 h bei 65 ° C inkubieren.
  7. Zur Reinigung der DNA eine Phe durchführenNol / Chloroform-Extraktion 12 (Schritt 3.5) und anschließend das Pellet in 30 μl dH 2 O resuspendieren.
    HINWEIS: Die Proben können direkt auf Proteinbindungsstellen (Abschnitt 5) analysiert oder bei -20 ° C gelagert werden.

6. Binding-Site-Analyse

  1. Führen Sie eine Analyse für spezifische Bindungsstellen innerhalb einer bekannten Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von PCR oder qRT-PCR durch. Für das Primer-Design folgen Sie konventionellen PCR- oder qRT-PCR-Protokollen. Entwerfen Sie die Primer, um ein 150-400 bp Amplikon zu synthetisieren, das die Proteinbindungsstelle von Interesse überbrückt ( Abbildung 1 ).
  2. Stellen Sie die PCR mit vier verschiedenen DNA-Matrizen ein, um die Spezifität zu gewährleisten: i) DNA aus ChIP, die mit dem interessierenden Antikörper immunpräzipitiert wurde, ii) DNA aus ChIP, immunpräzipitiert mit einem unspezifischen IgG-Antikörper, iii) Input-DNA und iv) H 2 O als a Negativkontrolle für die PCR, um die Kontamination auszuschließen. Im Falle der Bahnstimulation, Wählen Sie eine fünfte Schablone mit einem anderen Satz von Primern, die für eine bekannte Bindungsstelle des immunpräzipitierten Proteins spezifisch sind.
    HINWEIS: Im Falle der c-KIT-Liganden-Promotor-Analyse verwenden Sie herkömmliche PCR, um die TGF-β-induzierte SMAD-Bindung an der SBE innerhalb der c-KIT-Liganden-Promotorregion zu demonstrieren. Als Positivkontrolle führen wir PCR auf Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) als bekanntes Ziel der TGF-β-induzierten SMAD-Bindung durch.

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Representative Results

Die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex führt zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren, gefolgt von deren Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Der SMAD-Komplex verschiebt sich zum Kern. TGF-β kann die Gentranskription entweder direkt über SMAD-Bindung an SBEs innerhalb regulatorischer Regionen der Zielgene oder indirekt durch die SMAD-regulierte Expression von Transkriptionsaktivatoren oder Repressoren regulieren, die anschließend die Expression des Gens von Interesse regulieren. Um zu testen, ob der c-KIT-Ligand SCF durch die direkte TGF-β1-induzierte Bindung von SMAD2 an seinen Promotor transkriptional reguliert wird, analysierten wir die SCF-Promotor-haltige 2,4-kb-5'-flankierende Region des SCF-Gens für die SMAD2 Bindungsmotiv, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Wir haben 7 putative SBEs ups identifiziertTream des SCF-Startcodons ( Abbildung 1A ). Um die TGF-β1-induzierte Bindung von SMAD2 an den SCF-Promotor zu bestätigen, wurde der hier beschriebene ChIP-Assay durchgeführt. Die TGF-β1-Behandlung führte zu einer SMAD2-Bindung an den SCF-Promotor in menschlichen Leberkrebslinien, HepG2 und Hep3B, Zellen ( 1B ). In Abwesenheit von TGF-β1-Stimulation wurde keine SMAD-Bindung festgestellt. Als Positivkontrolle für die TGF-β1-induzierte SMAD-Aktivierung wurde ChIP für PAI-1 durchgeführt. Der PAI-1-Promotor ist ein bekanntes Ziel von TGF-β / SMAD 13 . Um die Spezifität der SMAD2-Immunpräzipitation zu bestätigen, wurden unspezifische IgG-Antikörper verwendet; Es wurde keine SMAD2-Bindung an die SBE nach Immunpräzipitation mit IgG festgestellt.

Für eine weitere Demonstration der ChIP-Technologie analysierten wir die 5'-flankierende Region des TGF- & bgr; -Liganden-Gens für die STAT3-Konsensbindungsmotive 5 '-TT (N4) AA-3 'und 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Wir identifizierten zwei mutmaßliche STAT3-Bindungsstellen stromaufwärts des TGFB-Startcodons an den Positionen -4384 / -4373 (STB-1) und -5365 / -5357 (STB-2) ( Abbildung 2A ). Um die TGF-β1-induzierte Bindung von STAT3 an das TGF-β-Liganden-Gen zu bestätigen, wurden ChIP-Assays unter Verwendung von TGF-β1-behandelten HepG2- und Hep3B-Zellen durchgeführt. TGF-β1-Behandlung führte zu einer STAT3-Bindung an die zweite putative STAT3-Bindungsstelle (STB-2) des TGFB-Gens, nicht aber die erste (STB-1) ( Abbildung 2B ). In diesem Beispiel dient die positive STAT3-Bindung an STB-2 als interne Positivkontrolle. Ähnlich wie bei dem obigen ChIP-Experiment wurde die STAT3-Bindung an das STB-2 nach der Immunpräzipitation unter Verwendung von IgG nicht beobachtet.

Abbildung 1
Abbildung 1 Ong>: TGF-β-induzierte SMAD2-Bindung an den SCF-Promotor. ( A ) Schematische Darstellung des SCF- Promotors mit putativen SBEs als Boxen (white boxes = AGAC) mit ihrer relativen Position zum Startcodon. Die ChIP-Primer-Position wird unten gezeigt, wobei die relativen Positionen zum SCF- Startcodon und der PCR-Produktgröße liegen. ( B ) ChIP für SMAD2-Bindung an den SCF- Promotor. Chromatin-Protein-Komplexe von TGF-β1-behandelten und unbehandelten HepG2- und Hep3B-Zellen wurden mit anti-SMAD2-Antikörper immunpräzipitiert. Die PCR wurde unter Verwendung von SCF-spezifischen Primern durchgeführt. Auf der linken Seite werden PCR-Ergebnisse mit Input-DNA gezeigt. In der Mitte werden PCR-Ergebnisse nach Immunpräzipitation mit unspezifischem IgG für die Bestätigung der SMAD2-Immunpräzipitationsspezifität gezeigt. Im unteren Panel gezeigt, wurde ChIP für SMAD2 Bindung an PAI-1 als Positivkontrolle verwendet.Ge.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 : TGF-β-induzierte STAT3-Bindung an das TGF-β-Gen. ( A ) Schema des TGF-β-Gens, wobei putative STAT3-Bindungsstellen als Graukästen mit ihrer relativen Position zum Startcodon dargestellt sind. ChIP-Primer-Stellen werden mit ihren relativen Positionen zu dem TGF-β-Start-Codon und den nachstehend angegebenen PCR-Produktgrößen gezeigt. ( B ) ChIP für die TGF-β1-induzierte STAT3-Bindung an das TGF-β-Gen. Chromatin-Protein-Komplexe von TGF-β1-behandelten und unbehandelten HepG2- und Hep3B-Zellen wurden mit Anti-STAT3-Antikörper immunpräzipitiert. Die PCR wurde unter Verwendung von TGF-β-spezifischen Primern durchgeführt. Auf der linken Seite werden die PCR-Ergebnisse mit Input-DNA gezeigt. In der Mitte die PCRErgebnisse nach der Immunpräzipitation mit unspezifischem IgG zur Bestätigung der STAT3-Immunpräzipitationsspezifität. Das obere Panel zeigt die PCR-Ergebnisse unter Verwendung von Primern, die für die STAT3-Bindungsstelle 1 (STB-1) spezifisch sind, und das untere Panel zeigt die Ergebnisse für die STAT3-Bindung an die STAT3-Bindungsstelle 2 (STB-2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In diesem Bericht zeigen wir die TGF-β1-induzierte Bindung von SMAD2 an eine SBE innerhalb des c-KIT-Liganden-Promotors und TGF-β1-induzierte Bindung von STAT3 an seine Erkennungssequenz innerhalb des TGF-β1-Liganden-Gens. Wir zeigen die Cytokin-induzierte Bindung beider Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation.

Chromatin-Immunpräzipitation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die direkte Bindung eines Proteins von Interesse für DNA zu demonstrieren, um die Reize zu charakterisieren, die die Proteinbindung an DNA induzieren und die DNA-Sequenz charakterisieren, an die das Protein bindet. Die letztgenannte Information kann bei der Identifizierung von Genen helfen, die durch ein spezifisches Protein von Interesse reguliert werden, und wird durch die Verwendung von ChIP-on-Chip-, ChIP-seq- oder Klonierungsstrategien 7 , 8 , 9 erreicht . Einer der Hauptvorteile von ChIP gegenüber anderen Methoden zur Demonstration der DNA-Proteinbindung, Wie EMSA oder DNase I Fußabdruck, ist, dass in der ChIP-Technologie die Bindung in vivo eingefangen wird, während mit den anderen in vitro durchgeführt wird . Daher bietet ChIP Einblick in die DNA-Proteinbindung innerhalb des zellulären Kontextes, während die anderen Techniken ein isoliertes System darstellen.

Allerdings ist die ChIP-Analyse komplex, beinhaltet mehrere Schritte, die die Ergebnisse beeinflussen können und erfordert Optimierung und Erfahrung. Einer der ersten Schritte, die für erfolgreiches ChIP entscheidend sind, ist der Crosslink-Schritt (Schritt 2.2). Die UV-Vernetzung ist irreversibel und daher für ChIP ungeeignet. Die Formaldehydvernetzung ist bevorzugt, aber die Formaldehydkonzentration und die Vernetzungszeit können sowohl die Effizienz der Chromatinscherung als auch die Antigenpräzipitation beeinflussen. Im allgemeinen sind niedrigere Formaldehydkonzentrationen (1% w / v) und kürzere Vernetzungszeiten (5-10 min) bevorzugt, da sie die Scherwirkung verbessern. Allerdings ist Formaldehyd nicht effizientBei Protein-Protein-Vernetzung und ist daher für Proteine ​​suboptimal, die nicht direkt an DNA 16 binden. Für solche Fälle kann ChIP in einem zweistufigen Ansatz durchgeführt werden, bei dem die Protein-Protein-Vernetzung zuerst mit Vernetzern wie Disuccinimidylglutarat durchgeführt wird, gefolgt von formaldehydvermittelter DNA-Protein-Vernetzung 17 .

Der nächste kritische Schritt ist die Chromatinscherung. In unserer Studie verwendeten wir enzymatische Scherung mit Mikrokokken-Nuklease. Die enzymatische Scherung ist besonders nützlich für nicht vernetzte native ChIP (N-ChIP), wenn die Ultraschallbehandlung die DNA-Proteinbindung stören würde. N-ChIP wird überwiegend für die Analyse von Histonen und Histonmodifikatoren verwendet 18 . Während die Mikrokokken-Nuklease als eine relativ unspezifische Endo-Exonuklease betrachtet wird, wurde gezeigt, dass sie eine sequenzspezifische Spaltung 19 hervorruft. Dies kann zu einer sequenzabhängigen Vorspannung in der resultierenden fra führenMit Überrepräsentation bestimmter Genloci 20 . Sonikation erzeugt zufällig große DNA-Fragmente ohne Sequenzvorspannung und wird im allgemeinen für vernetztes ChIP (X-ChIP) bevorzugt. Allerdings müssen die Beschallungsbedingungen empirisch für jedes Zell- oder Gewebetyp- und Sonicatormodell bestimmt werden, und die resultierenden DNA-Fragmente sind im Allgemeinen größer als bei der enzymatischen Scherung 16 . Auch eine Überbeschallung oder Emulgierung der Probe kann zum Verlust von Antikörper-Epitopen aufgrund von Protein-Denaturierung und Abbau führen.

Der Immunpräzipitationsschritt ist ein weiterer kritischer Schritt, der die Ergebnisse von ChIP stark beeinflussen kann. Agarose-Perlen binden DNA nicht spezifisch, und eine Variation in der Anzahl der hinzugefügten Perlen kann das spezifische Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Agarose-Perle "Aufschlämmung" gut suspendiert zu halten, wenn sie zu den DNA-Proteinproben hinzugefügt wird. In Bezug auf den Antikörper, der für die i verwendet wirdMmunopräzipitation, im Allgemeinen sollten ChIP-Klasse-Antikörper verwendet werden, und in Fällen, in denen diese nicht verfügbar sind, sollten mindestens Immunpräzipitations-Grad-Antikörper bevorzugt werden. Da spezifische Epitope während der Vernetzung maskiert werden können, sind polyklonale Antikörper vorteilhaft, da sie mehrere Epitope erkennen. Die Menge des zugegebenen Antikörpers sollte über dem Faktor liegen, der ausgefällt wird und daher für jeden Faktor / Antikörper empirisch bestimmt werden sollte. Auch wenn die Kinetik zum Erreichen des Gleichgewichts der Antikörperbindung für jeden Antikörper unterschiedlich ist, müssen die optimalen Inkubationsbedingungen für jeden Antikörper bestimmt werden.

Mehrere Bedienelemente können und sollten in das Versuchsaufbau aufgenommen werden. In Fällen, in denen die Induktion einer spezifischen DNA-Protein-Bindungsreaktion ausgewertet wird, ist es wichtig, eine Input-DNA-Kontrolle einzuschließen, um gleiche Matrix-DNA-Mengen in der Endanalyse ( dh PCR oder qRT-PCR) zu demonstrieren. Eine Antikörperkontrolle ist erforderlichBestätigen die Spezifität der Immunopräzipitation des Proteins von Interesse. Normalerweise sind Isotyp-abgestimmte Immunglobuline als Negativkontrollen gut geeignet, aber auch Agaroseperlen können verwendet werden. Gelegentlich werden positive Kontrollen verwendet, um einen funktionellen experimentellen Fluss des ChIP zu bestätigen, und Anti-Histon-Antikörper werden häufig für diesen Zweck verwendet. Bei Stimulationsexperimenten ist eine bevorzugte positive Kontrolle die Immunopräzipitation des interessierenden Proteins mit anschließender Sequenzanalyse für eine bekannte DNA-Region, an die die Proteine ​​bei der Stimulation binden. In unseren repräsentativen Ergebnissen wurde die SBE innerhalb des PAI-1-Promotors als bekanntes Ziel für die TGF-β1-induzierte SMAD-Bindung verwendet. In Experimenten ohne stimulierte Proteinbindung kann eine DNA-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie kein Ziel für das interessierende Protein ist, für die anschließende DNA-Analyse verwendet werden. In Bezug auf die DNA-Analyse ist es wichtig, eine Reaktion ohne Templat-DNA einzuschließen, um eine Kontamination auszuschließen.

ChIP ist eine hervorragende Technik, um die Bindung eines Proteins, das für ein Gen von Interesse ist, direkt zu demonstrieren. Allerdings ist es keine funktionelle Studie. In Fällen, in denen ein Protein von Interesse für eine regulatorische Rolle gedacht ist, ist es zwingend erforderlich, auch funktionelle Assays, wie Reporter-Gen-basierte Assays ( z . B. Luciferase) durchzuführen. In diesen Protokollen wird das Gen von Interesse in einer regulatorischen Position eines Reportergens kloniert. Die Induktion des Gen von Interesse führt zur Expression des Reportergens, wenn es eine regulatorische Funktion hat. Zur weiteren Bestätigung der regulatorischen Rolle des spezifischen Proteins von Interesse können entweder Knock-down- oder Knock-In-Zellen erzeugt werden, in denen das DNA-bindende Protein genetisch verstummt wird. Als zusätzliche Kontrolle kann die Proteinbindungsstelle im regulatorischen Gen mutiert werden, um die Bindung des interessierenden Proteins zu verhindern. In beiden der beiden letzteren experimentellen Entwürfe wird die Zellstimulation nicht zur Expression des Markers g führenEne

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Fonds, BB) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

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References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).

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Genetik Ausgabe 124 Chromatin-Immunpräzipitation Genregulation Promotor Transkriptionsfaktor c-KIT-Ligand TGF-β SMAD
Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation
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Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

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