Summary
Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido.
Abstract
Os transientes intracelulares de cálcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares iniciam uma multiplicidade de processos biológicos em organismos vivos. No centro da libertação de cálcio intracelular estão as principais organelas de armazenamento de cálcio intracelular, o retículo endoplasmático (RE) eo retículo sarcoplasmático (SR) mais especializado nas células musculares. A liberação dinâmica de cálcio a partir destas organelas é mediada pelo receptor de rianodina (RyR) e pelo receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) com reenchimento ocorrendo através da bomba sarco / retina de cálcio reticular ATPase (SERCA). Um sensor de cálcio geneticamente codificado (GECI) chamado CatchER foi criado para monitorar a rápida liberação de cálcio do ER / SR. Aqui, os protocolos detalhados para a transfecção e expressão do GECI CatchER + melhorado em células HEK293 e C2C12 direccionadas para ER / SR e a sua aplicação na monitorização de transiente de cálcio mediado por bomba IP3R, RyR e SERCAS em células HEK293 utilizando microscopia de fluorescência é delineada. O agonista ou inibidor de receptor de escolha está disperso na solução de câmara e as alterações de intensidade são registadas em tempo real. Com este método, observa-se uma diminuição do cálcio ER com a activação de RyR com 4-cloro-m-cresol (4 cmc), a activação indirecta de IP3R com adenosina trifosfato (ATP) ea inibição da bomba SERCA com ciclopiazónico Ácido (CPA). Também discutimos protocolos para determinar o in situ K d e quantificação basal [Ca 2 + ] em C2C12 células. Em resumo, estes protocolos, utilizados em conjunto com CatchER + , podem desencadear a libertação de cálcio mediada pelo receptor a partir da ER com aplicação futura no estudo de ER / SR relacionadas com cálcio patologias.
Introduction
Os atributos espaço-temporais dos transientes de cálcio intracelular (Ca 2+ ) ativam várias funções biológicas 1 . Estes eventos de sinalização de Ca2 + são desencadeados extracelularmente através de diferentes estímulos e controlados intracelularmente pela maior organela de armazenamento de Ca2 + e por numerosas bombas de Ca2 + , canais e proteínas de ligação de Ca2 + . Os transientes de Ca 2+ podem ser significativamente alterados como resultado de defeitos com modulação do sinal, levando a diferentes doenças 2 . Devido à velocidade e complexidade do sistema de sinalização Ca 2+ , com o retículo endo- (ER) e sarcoplasmático (SR) no centro, sondas de Ca 2+ geneticamente codificadas que foram otimizadas para expressão de mamíferos com cinética rápida são necessárias Para observar global e local Ca 2 + mudanças em diferentes células 3 .
O ER eo SR, Sua contrapartida em células musculares, são os principais organelos de armazenamento intracelular de Ca 2+ e atuam como sumidouros de Ca 2+ que ajudam a amplificar o sinal de Ca 2+ 4 . O ER / SR é parte integrante da sinalização Ca 2+ com papéis duais como transmissor e receptor de sinais 5 . O receptor de rianodina (RyR) e o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) são receptores de libertação de Ca2 + localizados nas membranas da ER / SR reguladas por Ca2 + 6 . Outros agentes estimulam directa ou indirectamente a função destes receptores. O 4-cloro-m-cresol (4 cmc) é um potente agonista do RyR, tendo uma sensibilidade 10 vezes maior do que a cafeína para induzir a libertação de SR Ca 2+ onde ambos são regularmente utilizados para estudar a libertação de Ca 2+ mediada por RyR Saudáveis e doentes 7 . ATP aumenta Ca 2 + mediado por IP 3Locação através do IP 3 R 8 . O ATP liga-se ao receptor purinérgico P2YR, um receptor acoplado à proteína G (GPCR), desencadeando a produção de IP 3 que se liga ao IP 3 R para libertar Ca 2+ do ER 9 , 10 . A bomba de ATPase de cálcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) é uma bomba ATPase de tipo P, também localizada na membrana ER / SR que reduz o Ca 2+ citosólico e reabastece o ER / SR ao bombear ativamente o íon no lúmen ER / SR 11 . Inibidores específicos da bomba SERCA incluem tapsigargina, de Thapsia garganica e ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus e Penicillium . O CPA tem uma baixa afinidade para a bomba e bloqueia reversivelmente o ponto de acesso Ca 2 + 12 . A tapsigargina, por outro lado, liga-se irreversivelmente à bomba livre de Ca2 + no resíduo F256 na hélice M3 com nanomolAr afinidade 11 . Analisar e quantificar as alterações envolvidas nos eventos estimulados com Ca2 + tem sido e continua a ser um desafio. Uma vez que o ER / SR é o maior subcelular Ca 2 + contendo compartimento com uma função central na propagação do Ca 2 + sinal, muito trabalho tem sido focada na compreensão ER / SR Ca 2 + sinalização 5 .
A criação de corantes sintéticos de Ca 2 + ajudou a avançar o campo ea prática de Ca 2 + imagem. Embora corantes, como o Mag-Fura-2, tenham sido amplamente utilizados para medir o Ca 2+ compartimentado em diferentes células, 13,14,15 têm limitações tais como carga de corante desigual, fotodegradação ea incapacidade de ser direcionado para organelas específicas . A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) eo avanço da proteína fluorescente-Baseado Ca 2 + propulsou o campo de Ca 2 + imagem para a frente 16 . Alguns dos GECIs existentes são pares de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) envolvendo proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), calmodulina e o péptido de ligação a M13 17 , 18 . Os GECI baseados em troponina C também estão disponíveis como pares FRET de CFP e Citrino e como sondas únicas de fluoróforo 19 , 20 , 21 . Outros, tais como GCaMP2 e R-GECO são sensores de fluoróforo único envolvendo calmodulina 22 , 23 . Para ultrapassar as limitações da afinação estreita de Kd e da ligação cooperativa associada a múltiplos locais de ligação de Ca2 + encontrados nos seus domínios de ligação a Ca2 + 24 , uma nova classe de cálcio senSors foi criado por projetar um local de ligação Ca 2 + na superfície do barril beta em um local sensível ao cromóforo de proteína verde fluorescente reforçada (EGFP) 25 , 26 . Este altamente touted sensor, chamado CatchER, tem um K d de ~ 0.18 mM, ak em perto do limite de difusão, e ak off de 700 s -1 . CatchER tem sido utilizado para monitorizar a libertação de cálcio ER / SR mediada por receptor em diferentes linhas de células de mamífero tais como HeLa, HEK293 e C2C12 25 . Devido à sua cinética rápida, o CatchER foi utilizado em fibras musculares flexor digitorum brevis (FDB) de jovens e velhos ratos Friend Friend B NIH Jackson (FVB) para revelar que mais Ca 2 + permanece no SR após 2 s de despolarização no FDB De camundongos velhos em comparação com a de camundongos jovens 27 . Para superar a sua baixa fluorescência a 37 ° C, o que dificulta as suas aplicações na imagiologia de cálcio de mamíferosCélulas, desenvolvemos uma versão melhorada do CatchER chamado CatchER + . CatchER + exibe fluorescência melhorada a 37 ° C para melhor aplicação em células de mamífero. Foram incorporadas mutações adicionais no CatchER para melhorar a termoestabilidade e fluorescência a 37 ° C 28 , 29 , para criar CatchER + . CatchER + exibe um aumento de seis vezes em sua relação sinal / ruído (SNR) sobre CatchER 30 .
Aqui são apresentados os protocolos para a cultura e transfecção de células HEK293 e C2C12 com CatchER + e a sua aplicação para monitorizar transientes de cálcio mediados por receptores ER / SR. Apresentam-se resultados representativos para CatchER + expresso em células HEK293 tratadas com 4 cmc, CPA e ATP. Nós também fornecemos um protocolo para determinar o K d in situ de CatchER + em células de mioblasto C2C12 e quaNação de Ca2 + ] basal.
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Protocol
1. Preparação do Slide
- Coloque as lâminas de microscópio de vidro de 22 mm x 40 mm em placas de cultura celular de 6 cm, 1 lâmina por prato.
- Exponha cada lado de cada lâmina, bem como o prato de 6 cm à luz ultravioleta (UV) por 15-20 min para esterilizar em uma capa estéril.
- Cubra os pratos com lâminas dentro com parafilme e armazene a 4 ° C até pronto para usar.
2. Preparação de meios, tampões, soluções e reagentes
- Preparar 1 L de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) em água desionizada e adicionar HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM e EGTA 1 mM. Ajustar para pH 7,2-7,3 com NaOH. Filtrar o tampão com um filtro de 0,22 μm num frasco autoclavado.
- Preparar 900 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glicose (DMEM) h em água desionizada. Adicionar NaHCO3 44 mM e ajustar o pH a 7,2-7,3 com HCl. Filtrar o meio com um filtro de 0,22 μm num frasco autoclavado. Adicionar 100 mL de bovi fetal(FBS) ao meio para se obter uma concentração de FBS de 10%. Armazenar a 4 ° C.
- Preparar 1 L de tampão intracelular (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 mM) em água desionizada, e ajustar o pH a 7,25. O [Ca2 + ] final será ~ 100 nM. Antes da utilização, adicionar ATP 0,5 mM. Armazenar em temperatura ambiente.
- Preparar 1 L de tampão Ringer (NaCl 121 mM, K2HPO4 2,4 mM, KH2PO4 0,4 mM, HEPES 10 mM e MgCl2 1,2 mM) em água desionizada e ajustar o pH a 7,2. Armazenar em temperatura ambiente. Para usar, alíquota de 50 mL para um tubo de 50 mL e adicionar Ca 2+ 1,8 mM e glicose 10 mM.
- Preparar 1 L de solução de enxágüe KCl (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 0,2 mM) em água desionizada e ajustar o pH a 7,25.
- Dissolver 5 mg de ionomicina em 1 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Alíquota 30 μL em microtubos e armazenar a -206; C.
- Preparar o estoque de ácido ciclopiazônico (CPA) por dissolução de CPA em DMSO. Certifique-se de que a percentagem final de DMSO é ≤ 1% para o CPA adicionado às células para evitar a apoptose. Preparar 4-cloro-m-cresol (4 cmc) 20 mM por dissolução em H2O filtrada e deixar dissolver durante a noite por agitação a 37 ° C. Preparar o estoque de ATP dissolvendo em H 2 O filtrado até 100 mM.
- Para determinar o K d in situ , preparar 15 mL de cada um de EGTA 1 mM, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM e 100 mM de Ca2 + em tampão de KCl utilizando uma solução de 100 MM de EGTA e uma pasta de CaCl2 1 M dissolvida em água desionizada.
3. Cultura celular
- Cultura de mioblastos C2C12 e células HEK293 de acordo com protocolos ATCC para cada utilização de placas de cultura celular de 10 cm numa cobertura de UV estéril.
NOTA: As células C2C12 não devem ser deixadas crescer mais do que ~ 70% de confluência uma vez que os mioblastos começarão a diferenciarTe em myotubes. As células HEK293 e C2C12 crescem prontamente e não devem ser deixadas crescer após 100% de confluência para manter a integridade celular. Além disso, as células não devem ser passadas mais de 10 vezes antes de usá-los para uma experiência para preservar a saúde celular.
4. Transfecção de células HEK293
- Semear as células HEK293 em lâminas de microscópio de vidro 22 mm x 40 mm esterilizadas em placas de 6 cm de modo que elas são ~ 70% confluentes no dia da transfecção.
- No dia seguinte, siga o protocolo do fabricante para o reagente de transfecção para transfectar células utilizando 2 ug de ADNc de CatchER + e uma proporção de ADN: transfecção de 1: 3 (peso / volume) nos meios de soro reduzidos ( eg Opti-MEM).
- Esvazie a mídia DMEM do prato e adicione 3 mL de meio soro reduzido. Adicionar ADN: mistura de reagente de transfecção à placa e incubar durante 4-6 h a 37 ° C.
- Após incubação, lavar as células com 5-6 mL de HBSS. Descarte o HBSS fRom o prato e substituir por 3 mL de DMEM fresco e incuba-los a 37 ° C durante 48 h para permitir a expressão do GECI.
- Transfecção de células mioblásticas C2C12
- Para as células de mioblasto C2C12, trypsinize células através da adição de tripsina suficiente para cobrir o fundo do prato (1-2 mL). Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 2-6 min para permitir que a tripsina para afrouxar as células do fundo do prato.
- Uma vez completada a incubação, remover a tripsina e aspirar as células em 8 mL de DMEM. Pipetar bem as células com o DMEM para dispersar uniformemente e re-suspender as células te e semeá-las em lamínulas estéreis em placas de cultura de células de 6 cm contendo 3 mL de DMEM de modo que a confluência final seja de 60%.
- Transfectar as células no mesmo dia descrito no passo 4.2-4.3. Incubar durante 24 h a 37 ° C.
- Repita o passo 4.4.
5. Preparação do microscópio de diapositivas e fluorescência
- Ative mIcroscope e fonte de luz, abra o programa Simple PCI. Permitir que o microscópio para aquecer por 15-20 minutos ou até que o dispositivo de carga acoplada (CCD) câmera esfria a -65 ° C. Prepare a câmara e deslize com as células enquanto espera.
- Cubra o fundo da câmara de imagem de banho de diamante aberto de baixo perfil com uma fina camada de vedante, usando um cotonete.
- Retire a lâmina contendo as células transfectadas da incubadora e enxágüe suavemente três vezes com 1 mL de tampão de Ringer com glucose 10 mM e Ca 2+ 1,8 mM pré-aquecido a 37 ° C.
- Deixe 1 mL de tampão Ringer no prato, para evitar que as células de secagem, e use fórceps para tirar o slide fora do prato. Permitir que a solução em excesso absorva em um tecido de laboratório, tocando a borda da lâmina para um tecido de laboratório. Em seguida, coloque no lado da câmara que contém a graxa com as células voltadas para cima em direção a graxa e segura a câmara sobre o palco de montagem usando uma chave de fenda.
- Adicionar 1ML de tamp� de Ringer � c�ara para impedir que as c�ulas sequem ao montar a c�ara no andar e completar o resto da configura�o do microsc�io. Uma vez que a mangueira de sucção de vácuo está ligada à câmara, o volume final da câmara é ~ 450 μL.
- Mude o objetivo do microscópio para o objetivo de imersão de óleo 40X.
- Use papel de lentes e solução de limpeza de lentes para limpar e secar o objetivo. Não esfregue o objetivo. Dab suavemente até que a superfície está limpa.
- Adicione uma gota do óleo de imersão ao objetivo.
- Coloque o suporte no microscópio e adicione a ponta do vácuo à câmara. Uma vez que a mangueira de sucção de vácuo está ligada à câmara e ligada, o volume final da câmara é de ~ 450 μL. Este volume final está nivelado com os lados da câmara. É imperativo que a solução da câmara seja nivelada, durante o experimento, para evitar que a solução derrame para baixo no objetivo devido ao enchimento excessivo.
- Usando o modo de campo brilhante, ajuste o ganho para 175 eo tempo de exposição para 0,03 s para focalizar as células.
- Uma vez que as células estão focadas, mude para o modo de fluorescência usando excitação de 488 nm. Alterar o tempo de exposição para 0.07 s. Localize um campo de visão que tenha células suficientes que sejam saudáveis com fluorescência adequada à imagem.
- Uma vez que um campo de visão foi escolhido, tirar fotos em fluorescência e campo brilhante modo.
- Círculo de uma região de interesse (ROI) nas células ou círculo a célula inteira para gravar a intensidade da área escolhida.
6. Transtornos Ca 2+ induzidos por imagem e Calibração In Situ K d
- Inicie a medição de intensidade com a taxa de quadros ajustada em uma cada 5 s.
- Permita que a intensidade da linha de base se estabilize durante 20 a 30 fotogramas (100-150 s). Se necessário, diminua o frAmes / s durante esta etapa para impedir o fotoblanqueamento.
- Calcular a quantidade de 4 cmc necessária a partir de uma reserva de 20 mM com base no volume da câmara final de ~ 450 μL para se obter uma concentração final de 200 μM. Fazer diluições do estoque, se necessário.
- Tomar cuidadosamente 60 μL de tampão Ringer da câmara e colocar num tubo de microcentrífuga. Diluir a quantidade calculada de 4 cmc com esta solução e adicionar novamente à câmara para evocar a resposta pretendida a partir das células que estão a ser formadas imagens.
- Adicionar a quantidade calculada de 4 cmc ao tubo de microcentrífuga e misturar por pipetagem.
- Adicione suavemente a solução sobre o campo de visão enquanto simultaneamente adiciona o marcador de evento na medição de intensidade.
- Deixar tempo para que o fármaco se ligue ao receptor e subsequente diminuição do sinal, depois lavar com 3-6 mL de tampão de Ringer com Ca2 + 1,8 mM e glucose 10 mM enquanto adiciona simultaneamente o marcador de evento. Uma vez que o volume da câmara é 450 &# 181; L e está ligado a um vácuo, a adição de 3-6 mL de tampão assegura que a primeira solução contendo o fármaco tenha sido removida por lavagem e substituída com a solução adicionada recentemente.
- Repetir 6,1-6,7 para ATP 100 μM e CPA 15 μM, utilizando uma nova lâmina de células transfectadas para cada ensaio.
- Quando a medição estiver concluída, termine a coleta de dados na janela de medição de intensidade no programa Simple PCI.
- Tome fotos fluorescência e brightfield das células.
- Abra o arquivo de dados para a experiência. Aqui, recriar as células ou regiões de interesse para recalcular os valores de intensidade, se necessário.
- Para determinar o K d in situ em células de mioblasto C2C12, siga o protocolo como delineado na secção 4.2 e secção 5 e colocar 1 mL de tampão Ca 2+ Ringer 0 mM na câmara.
- Permeabilizar as células com 0,002-0,005% de saponina em tampão intracelular durante 15-30 s para esvaziar as células de qualquerCatchER + que pode estar no citosol. Lavar as células com 3-6 mL de 1 mL de EGTA em tampão KCl com ionomicina 10 μM. Permitir que a intensidade de diminuir até um platô é atingido.
- Enxaguar com 3-6 mL de tampão KCl com ionomicina 10 μM e deixar a intensidade estabilizar, depois adicionar cada solução de Ca2 + detalhada no passo 2.7. Permitir que a intensidade de atingir um platô entre cada adição.
- Para calibrar o sensor para a quantificação basal [Ca2 + ], siga o passo 6.12. Utilizar o EGTA eo tampão Ca2 + 100 mM do passo 2.7 para obter a intensidade de fluorescência mínima e máxima.
7. Processamento de dados
- Faça o download do arquivo de planilha dos dados de medição de intensidade.
- Normalize os dados para cada célula para a intensidade da linha de base (F / F 0 ). Trace os dados normalizados em função do tempo em qualquer programa gráfico.
- Para calcular a% de alteração, subtraia o pico normalizado valUe de 1 e multiplicar por 100. Calcular a média eo desvio padrão se várias células foram visualizadas.
- Para calcular a relação sinal / ruído, SNR, abrir o arquivo de imagem salva da experiência em um software de processamento de imagem, como ImageJ, e depois medir o sinal, células transfectadas e ruído de fundo. Calcule o SNR usando a equação SNR = sinal / ruído.
- Para calcular o K j in situ a partir dos dados de imagem de fluorescência recolhidos, mede-se os dados de intensidade, compreendendo os platôs, após adição de cada concentração de Ca2 + e EGTA (0 mM Ca2 + ). Calcular a saturação fracionária (intensidade relativa) usando θ = (F - F min ) / (Fmax - F min ), onde θ é a intensidade relativa, F é a fluorescência em qualquer ponto, F min é a intensidade de fluorescência mínima e F max é a intensidade de fluorescência máxima, para ver a mudança na intensidade de tEle sonda com a adição de Ca 2 + em comparação com a intensidade mínima. Trace os dados de intensidade relativa contra o [Ca2 + ] em qualquer programa gráfico e de ajuste de curvas. Utilize a equação de ligação 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) traduzida para qualquer programa gráfico e de ajuste de curva para calcular o K d . M T é a concentração total de metal.
- Para quantificar o cálcio basal a partir da calibração delineada em 6.13, a média dos dados de intensidade, compreendendo os platôs, após a adição de EGTA 1 mM (F min ) e 100 mM Ca 2+ (F max ). Utilizar a equação de calibração [Ca2 + ] = Kd ([F - Fmin) / (Fmax - F)] para calcular o cálcio basal.
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Representative Results
Esta secção irá ilustrar os resultados que foram alcançados utilizando os métodos descritos anteriormente utilizando o optimizado ER / SR-alvo GECI CatchER + para monitorar mudanças em ER / SR Ca 2 + através de diferentes vias mediadas pelo receptor.
A Figura 1 ilustra o esvaziamento de ER através do RyR estimulado com 200 μM de 4 cmc. 4-cmc é um agonista do RyR. A adição do fármaco induz uma diminuição no cálcio ER medida pela diminuição da intensidade de fluorescência CatchER + . Conforme marcado, o protocolo delineado aqui permite a visualização e medição de receptores mediados Ca 2 + transientes usando CatchER +, que fornece informações sobre as alterações em ER Ca 2 + .
Conforme ilustrado na Figura 2 , a adição de 1CPA 5 μM, para bloquear reversivelmente a bomba SERCA, produz uma grande diminuição na intensidade de fluorescência que forma um platô. Uma vez que a função da bomba SERCA é inibida, os canais de libertação de ER Ca2 + estão ainda a libertar activamente Ca2 + no citosol fazendo com que a intensidade de fluorescência diminua. As c�ulas recuperam-se ap� lavagem de CPA com tamp� de Ringer contendo Ca 2+ 1,8 mM e glicose 10 mM. Estes resultados confirmam a capacidade de CatchER + para monitorizar os transientes de Ca2 + específicos para a bomba SERCA.
A Figura 3 mostra dados representativos para a activa�o indirecta do IP 3 R com ATP 200 � em c�ulas HEK293 transfectadas com CatchER + . O ATP liga-se ao receptor P2Y, um receptor acoplado à proteína G, que gera IP 3 que activa a libertação de Ca2 + através do IP 3 R. Embora a alteraçãoÉ pequena, a adição de 200 μM de ATP produz uma diminuição visível na intensidade do sinal. A lavagem das células com tampão de Ringer contendo Ca 2+ 1,8 mM e glucose a 10 mM permite que o RE reabasteça eo sinal para voltar à linha de base. Estes resultados realçam a capacidade de CatchER + monitorizar a libertação de cálcio mediada por IP 3 R através de estimulação indirecta.
Na Figura 4 , CatchER + foi transfectado em células de mioblasto C2C12 para determinar o K j in situ . Os dados foram recolhidos como descrito no protocolo. As células de mioblasto C2C12 foram permeabilizadas com saponina a 0,005% durante 15-30 s e depois lavadas com EGTA 1 mM em tampão KCl contendo 10 uM de ionomicina. As várias concentrações de Ca2 + foram preparadas em tampão KCl contendo 10 uM de ionomicina e foram adicionadas de um modo passo a passo. Os dados foram normalizados e ajustados utilizando a ligação 1: 1Equação. A média Kd foi de 3,1 ± 1,4 mM para 7 células. A afinidade fraca de CatchER + permite que ele detecte Ca 2 + em organelos de Ca 2+ alto como o ER ou SR. Para determinar o Ca2 + basal na SR, as células C2C12 foram permeabilizadas com 0,005% de saponina durante 15-30 s, lavadas com tampão KCl e depois lavadas com EGTA 1 mM em tampão KCl contendo 10 uM de ionomicina para obter F min . Depois de se ter lavado o EGTA com tampão KCl, adicionou-se um máximo, Fmax, 100 mM de Ca2 + com 10 uM de ionomicina. O Ca2 + basal foi calculado como sendo 0,4 ± 0,2 mM.
Figura 1: Estimulação de RyR utilizando 4-cmc em células HEK293. ( A ) Descrição da activação de RyR com 4 cmc. ( B ) Gravação de intensidade de células HEK293Transfectadas com CatchER + , localizadas na ER, tratadas com 200 μM 4-cmc. A estimulação do RyR com 4 cmc provoca uma diminuição na intensidade de fluorescência normalizada que se correlaciona directamente com uma diminuição de [Ca2 + ] ER . N refere-se ao número de células fotografadas. A diminuição média do sinal foi de 12,0 ± 2,2%. A presença de Ca 2+ 1,8 mM no tampão de Ringer facilitou o reenchimento do RE refletido na recuperação de intensidade até à linha de base. As imagens inseridas mostram as células antes e depois do tratamento com 4 cmc. A SNR foi calculada em 4,3 ± 0,8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diminuição de [Ca2 + ] ER utilizando o método reversível SERCA pUmp inibidor CPA em células HEK293. ( A ) A inibição da bomba SERCA por CPA. ( B ) Imagens ao vivo de células HEK293 transfectadas com CatchER + , localizadas na ER, tratadas com CPA 15 μM. Porque Ca 2 + ainda pode fluir através do IP 3 R e RyR, bloqueando a bomba SERCA com CPA provoca uma diminuição na intensidade de fluorescência normalizada que diretamente correlaciona a uma diminuição de [Ca 2 + ] ER . N refere-se ao número de células fotografadas. As imagens inseridas são células HEK293 transfectadas com CatchER + antes e depois do tratamento. A diminuição média do sinal foi de 21,0 ± 0,3%. A presença de Ca 2+ 1,8 mM no tampão de Ringer facilitou o reenchimento do RE refletido na recuperação de intensidade até à linha de base. A SNR foi calculada como sendo de 5,5 ± 0,8. Clique aqui para ver uma versão maioresta figura.
Figura 3: ATP diminui [Ca2 + ] ER em células HEK293. ( A ) Esquema da ativação indireta de IP3R com ATP através do receptor purinérgico P2YR. P2YR é um GPCR que gera IP 3 após ligação a ATP. O IP 3 activa o IP 3 R, estimulando a libertação de cálcio da ER. ( B ) Imagens em tempo real de células HEK293 transfectadas com CatchER + , localizadas na ER, tratadas com ATP 200 μM. A estimulação indirecta do IP 3 R através do receptor P2Y com ATP provoca uma diminuição na intensidade de fluorescência normalizada que se correlaciona directamente com uma diminuição de [Ca2 + ] ER . N refere-se ao número de células fotografadas. A diminuição média do sinal foi de 6,0 ± 3,0%. SNR foi cFoi de 6,7 ± 2,7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Kd in situ de CatchER + em células de mioblasto C2C12. Traço representativo para a intensidade normalizada recolhida a partir de células de mioblasto C2C12 permeabilizadas transfectadas com CatchER + . As células foram permeabilizadas com 0,005% de saponina em tampão intracelular durante 15-30 s. As soluções de EGTA e Ca2 + foram preparadas em tampão KCl, n refere-se ao número de células fotografadas. ( A ) As imagens de fluorescência de inserção são representativas das células antes e depois do tratamento. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 e 100 mM de Ca2 + foram adicionados a células de mioblasto C2C12 permeabilizadas na presença de 10 uMIonomicina para obter uma Kd de 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) As imagens de fluorescência inseridas são representativas de células a valores mínimos e máximos, após adição de 1 mM de EGTA e 100 mM de Ca2 + com 10 uM de ionomicina cada, respectivamente. O Ca2 + basal foi calculado como sendo 0,4 ± 0,2 mM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imagiologia com células vivas de sondas fluorescentes, tal como CatchER + , é uma técnica eficaz para analisar processos de sinalização intrínsecos de ER / SR Ca2 + em cada célula em resposta a agonistas ou antagonistas de receptores. Esta técnica também é útil para imagens usando múltiplos comprimentos de onda simultaneamente, como necessário para Fura-2 ou para a imagem CatchER + e Rhod-2 em conjunto para monitorar ER e citosólicas alterações de cálcio, respectivamente. Existem várias etapas críticas neste protocolo; Transfecção celular pode ter um grande efeito sobre a viabilidade da imagem. Baixas taxas de transfecção podem resultar em expressão insuficiente do GECI para monitorar as respostas ao cálcio. Por outro lado, a sobreexpressão de CatchER + não terá um efeito tampão sobre ER / ER Ca 2+ , um problema associado com corantes sintéticos de cálcio. Os efeitos tampão das sondas de Ca2 + são influenciados pelo [Ca2 + ] na organela, o Kd da pRótula ea concentração da sonda necessária para a medição. O citosólico [Ca2 + ] está tipicamente na gama nanomolar baixa, no entanto, a concentração de sonda necessária está numa gama comparável. Neste caso, a quantidade de concentração de corante e a sua capacidade para tamponar cálcio citosólico foi, e é, uma grande preocupação para a formação de imagens celulares. Em contraste, ER / SR [Ca2 + ] está na faixa de 100s de micromolar a milimolar 31 como foi determinado para diferentes linhas de células de mamífero 25 . Uma vez que a expressão de 0,1-1 μM de CatchER + é suficiente para permitir a detecção de cálcio ER, o efeito de tamponamento de CatchER é negligenciável. Deste modo, CatchER + pode monitorizar o fluxo de Ca2 + em ambientes elevados de [Ca2 + ] sem qualquer efeito tampão na luminal ER / SR Ca2 + 32 .
Vários fatores podem afetar a eficiência de transfecção do GECI, como o tempo deE o reagente de transfecção, a temperatura de incubação e a confluência celular. A confluência celular, quando se semeia as células no slide, pode afetar significativamente a qualidade da imagem. A baixa confluência pode resultar em um número baixo de células (n) e menor precisão estatística, enquanto altos níveis de confluência levam a camadas sobrepostas de células produzindo grandes variáveis na imagem. O tempo e a temperatura para a transfecção devem ser optimizados com base no tipo de célula. Adicionalmente, a adição de DMEM com meios de soro reduzidos é óptima para tempos de transfecção mais longos para evitar a apoptose. A fluorescência GECI CatchER original em células de mamífero, quando cultivada e transfectada, era apenas de 30 ° C. A fluorescência de CatchER foi optimizada com sucesso e melhorada para expressão a 37 ° C resultando na nova variante melhorada CatchER + . Pode ser realizada uma transferência de Western utilizando um anticorpo contra EGFP para confirmar a expressão da sonda de Ca2 + .
Além disso, o meE a consistência da distribuição do reagente são críticas. Os reagentes podem ser adicionados à câmara por perfusão, difusão de pequeno volume ou por bombas mecânicas, o que pode provocar respostas diferentes. É imperativo que a câmara de solução esteja devidamente selada aplicando uma camada de gordura vedante no fundo da câmara que será colocada sobre a corrediça. Os comprimentos de onda corretos devem ser selecionados para a sonda. Os comprimentos de onda de excitação e emissão para CatchER + são 395/488 nm e 510 nm, respectivamente. Para imagens de células, apenas 488 nm é utilizado para excitação para evitar o efeito prejudicial da luz UV sobre as células. Por conseguinte, a utilização de quaisquer filtros ópticos que excitam a 488 nm e recolham a emissão a 510 nm seria aceitável para utilização com a imagem com CatchER + . Para evitar o foto-branqueamento, os esforços podem ser focados para otimizar a intensidade da luz e a exposição à luz, como quadros / s 33 .
Enquanto este protocolo é ideal para analisar o effDas alterações ER / SR usando a sonda fluorescente CatchER + Ca 2+ ER / SR, há limitações esperadas em qualquer experimento. Uma vez que a imagiologia viva de célula única analisa apenas um pequeno quadro de células, o número de células (n) pode variar de 1 a 100 células, em média, mas pode ser menor para linhas de células maiores. Isto leva a números de células mais baixos e resultados estatisticamente variados sem ensaios múltiplos. Um n> 6 é necessário para a precisão estatística. Para obter um n maior, muitos pratos devem ser fotografados ou outras técnicas devem ser utilizadas, simultaneamente. Além disso, CatchER + é uma única sonda de comprimento de onda ER / SR Ca 2+ , isto leva a questões de outras sondas de comprimento de onda único e corantes com não ser capaz de quantificar o sinal, não saber se o sinal é verdadeiro em oposição à interrupção das células Artefato, e tendo maior ruído, em comparação com sistemas ratiometric 34 .
Este trabalho mostra que essas sondas de Ca 2+ otimizadasSer aplicados em diferentes tipos de células ou tipos de tecidos para monitorizar a libertação de Ca / 2 mediada por receptor ER / SR. CatchER + é uma sonda de comprimento de onda único ER / SR Ca2 + . Portanto, é importante que os parâmetros e configurações experimentais sejam consistentes para a medição quantitativa. Uma calibração detalhada da concentração de cálcio e K d do sensor de cálcio nas linhas celulares são medidas adicionais importantes para a análise quantitativa.
Esses sensores de cálcio desenvolvidos também podem ser direcionados a locais específicos dentro da ER / SR para monitorar os diferentes transientes Ca 2+ que existem em comparação com as alterações globais de Ca 2+ em várias condições biológicas e patológicas. Estes achados irão continuar a empurrar os campos de Ca 2 + imagiologia e sonda design para a frente para fornecer ferramentas futuras para diagnosticar Ca 2 + -related doenças. Os protocolos relatados e sensor desenvolvido também podem ser adaptados para droga dCoberturas contra doenças associadas à sinalização do cálcio.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, e um NIH Suplementar Grant para FR, BB bolsa para CM, CDT bolsa para RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , Georgia State University. (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. Calcium signaling protocols. , Humana Press. (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).
