Summary
A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).
Abstract
Desenvolvimento de asa em Drosophila melanogaster é um modelo ideal para o estudo de morfogênese a nível do tecido. Estes apêndices desenvolvem a partir de um grupo de células chamado discos imaginária de asa formados durante o desenvolvimento embrionário. Na fase larval os discos imaginária crescem, aumentando seu número de células e formando estruturas epiteliais monolayered. Dentro da pasta pupal, os discos imaginária brote para fora e dobram em bilayers ao longo de uma linha que se torna a futura margem da asa. Durante este processo, as veias primodia longitudinal se originam células veia nas potenciais superfícies dorsais e ventrais da asa. Durante a fase de pupa as listras de veia células da superfície de comunicam para gerar tubos apertados; ao mesmo tempo, as Cruz-veias começam a sua formação.
Com a ajuda de marcadores moleculares apropriadas, é possível identificar os principais elementos que compõem a ala durante seu desenvolvimento. Por esta razão, a capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas nesta estrutura é fundamental para estudar a sua abundância e localização relacionadas com o processo de desenvolvimento da asa.
O procedimento descrito aqui centra-se na manipulação de asas pupal, fornecendo instruções detalhadas sobre como dissecar a ala durante a fase de pupa. A dissecção de tecidos pupal é mais difícil de executar do que suas contrapartes em larvas de terceiro instar. É por isso que esta abordagem foi desenvolvida, para obter amostras de rápida e eficiente de alta qualidade. Detalhes de como delgados e montagem destas amostras de asa, para permitir a visualização de proteínas ou componentes celulares, são fornecidas no protocolo. Com pouco conhecimento, é possível coletar 8-10 asas pupal de alta qualidade em um curto espaço de tempo.
Introduction
Asas de drosófila são desenvolvidas a partir dos discos de imaginária de asa. O primordial destes discos de asa são colocadas de lado durante o desenvolvimento embrionário como pequenos grupos de 20-30 células imaginária que invaginate do epitélio embrionário. Quando a larva está crescendo para a terceira fase de instar, mitose ocorre nas células imaginária em horários específicos característicos, aumentando seus números (cerca de 50000 células) e formando a ala disco1,2,3, 4. Como as células proliferam, elas forme um epitélio tubular, resultando em uma espiral Self dobrável compacta. Durante a pupa, o epitélio de disco telescópios para fora a forma que as duas camadas de asa e as veias longitudinais começam como lacunas entre eles, que ocorre duas vezes durante a asa do desenvolvimento5,6.
O arranjo das veias sempre tem um padrão idêntico; a capacidade de facilmente identificar cada alteração no âmbito da formação de veias faz mutações extremamente visíveis (por exemplo, faltando ou extra veias, mudanças nas posições de veia, etc.). Curiosamente, as variações do fenótipo são geralmente as provas de mutações em componentes conhecidos ou novela de sinalização de caminhos que são relevantes para o desenvolvimento da asa. Um dos caminhos que desempenha um papel na determinação da posição e mantendo a veia e territórios intervein é o Hedgehog (Hh) via6,7,8.
Dada a importância da ala pupal como um sistema modelo, será importante obter amostras de boa qualidade para trabalhar com. No passado, os cientistas que publicaram protocolos para dissecar Drosophila asas não deram um guia adequado para obter amostras viáveis. Sem a orientação de um pesquisador se claramente não pode visualizar o processo. Essas abordagens alternativas de dissecação a pupa é dividida em dois, separando a asa do tecido circundante e repetidamente lavada para remover os detritos. Este tipo de abordagem pretende deixar a folha livre de contaminantes, mas devido a experiência anterior, o processo é mais lento e há uma maior chance de comprometer a estrutura do frágeis asas9.
O procedimento descrito aqui foi desenvolvido pela demanda para encontrar um método rápido e eficiente para obter amostras de asa pupal apropriadas detectar proteínas específicas ou transcrições usando protocolos de immunodetection ou polimerase ensaios de reação em cadeia (PCR). Para ilustrar isso, a expressão e a localização de Patched (Ptc ou o receptor canônico da via Hh) é detectado em amostras de asa pupal, fornecendo um protocolo que inclui detalhes relevantes para executar com êxito o completo procedimento.
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Protocol
Dia 1
1. coleta e cultivo de pupas.
- Remover 0 h após a formação do casulo (APF) ou pré-pupa usando um pincel molhado de frascos culturas e colocá-los em frascos novos quase completar o período de desenvolvimento (ver 2.1 e 2.2).
Nota: Uma população saudável de moscas deve ser mantida usando protocolos padrão de cultivo. Depois de três ou quatro dias em que os ovos são postos, os adultos podem ser removidos de frascos para permitir um desenvolvimento ideal dos indivíduos. Eles são mantidos a uma temperatura constante, até as terceiro ínstar larvas iniciar pupa. A transição larval/pupa é marcada pela formação da prepupa, considerado o h 0 APF. O prepupa é uma larva branca imóvel que tem um oblongo, redondo forma com salientes espiráculos anteriores.
Dia 2
2. transferência, dissecção e fixação.
- Transferir as pupas (2 h antes do tempo de desenvolvimento completo) com um pincel, a lâmina de microscópio com fita dupla-face adere a ele. Posicione as pupas para formar que uma linha com os lados dorsais acima e cefálicas acaba enfrentando a mesma direção.
- Retornar o microscópio para temperatura constante e permitir que as pupas completar o tempo de desenvolvimento adequado (ou seja, 24-30 h APF).
Nota: A lâmina de microscópio com a fita dupla-face será uma plataforma de dissecação transitória para remover o caso pupal (veja abaixo). O lapso de tempo do slide de microscópio (fora do frasco) ajuda a secar o caso pupal, tornando-o facilmente quebrável com fórceps. - Remova o opérculo do caso pupal usando fórceps.
- Resolver o caso com fórceps (como mostrado no vídeo) fazendo uma linha ao longo do lado da pupa à extremidade caudal do mesmo. Com a iluminação apropriada é possível detectar a forma interna da pupa evidenciando um espaço logo acima da articulação da ala pupal. Este espaço serve como um guia para realizar a abertura sem danificar a pupa.
- Remova partes do caso, buscá-los pela fronteira aberta e carregando-os para o lado oposto, onde a fita dupla-face irá detê-los. No final da dissecação as pupas será quase "peladas", que apenas um pequeno pedaço do caso estará cobrindo a ponta posterior.
Nota: O propósito de deixar uma pequena quantidade de caso na extremidade caudal superior é garantir uma versão suave do caso a lâmina com a fita dupla-face. O raciocínio por trás desta ação é porque se você remover muito do caso você grandemente o risco de danificar a pupa. Por outro lado se você remover muito pouco, a pupa não facilmente virá livre do caso. - Empurre para baixo (com fórceps) o restante do processo. Este movimento irá disparar a extremidade anterior da pupa, permitindo que a cabeça e o tórax de permanecer em uma posição preferencial de aderir e ser transferido na etapa subsequente.
- Pegue um novo slide com fita dupla-face e invertê-lo na linha de pupas ou crisálidas. Recomendamos realizar esta abordagem, observando os movimentos com o auxílio do microscópio estereoscópico para evitar quebra das pupas.
- Pressione ligeiramente para fazer as pupas, ficar com a fita e deslizar suavemente o slide a fim de remover as pupas do resto dos casos. Inverter o microscópio: as pupas vão ser preso no lado dorsal ao nível da sua cabeça / área do tórax.
- Cobrir todas as pupas nuas com paraformaldeído 4% e esperar 10 min. Em nossa experiência, este lapso de tempo com o fixador ajuda a mudar a consistência da cutícula, tornando-se firme, menos pegajoso e fácil de manusear.
Nota: Para realizar a extração do ácido ribonucleico (RNA), substituto paraformaldeído para tampão fosfato salino (PBS) feito com RNase livre água e remover as asas pupal, fazer um corte (com o auxílio de tesouras) perto do ponto de articulação de cada membro. Usando fórceps, transferi a pupa asa para um tubo de microcentrifugadora com 1 mL de reagente de tiocianato e fenol de guanidínio. Depois de coletar um total de 50-80 asas, armazene o tubo microcentrifuga a-80 ° C até realizar a extração de RNA10,11. - Faça uma pequena incisão na região da dobradiça da ala ou perto dele. Permitem que o fixador alcançar o epitélio da asa. Usando uma pipeta (p200) flush fixador sobre a asa. Quando rubor substituir o contaminado se fixam com o novo. Após o enxaguamento, manter a asa em fixador por 5 min.
Nota: Embora esta manobra ajuda a limpar a maioria do tecido contaminante, alguns hemócitos e gotículas de gordura podem permanecer presas entre as camadas epiteliais dorsais e ventrais da asa (ver figura 1A). - Arrancar com a pinça de fronteiras a cutícula (como mostrado no vídeo) expandindo o orifício e permitindo a liberação do epitélio asa do sac a cutícula. Uma vez que o tecido da asa é liberado, deixá-lo na solução de paraformaldeído para completar 30 min de fixação.
- Transferir as asas fixas para um 4-jorrava prato plástico preenchido com PBST (Triton X-100 0,05%). Loja durante a noite a 4 ° C.
Dia 3
3. incubação do anticorpo primário.
- Permeabilize o tecido incubar as asas pupal em PBST (Triton X-100 0,2%) por 15 min, usando uma plataforma oscilante para facilitar um movimento médio líquido suave.
Nota: Até as amostras de montagem, as etapas devem ser executadas utilizando uma plataforma de balanço. - Bloquear as amostras usando PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) por 1h.
- Use a mesma reserva para diluir o anticorpo primário (rato anti-Ptc, 1: 100) e incube as asas pupal durante a noite a 4 ° C.
Dia 4
4. incubação do anticorpo secundário.
- Lavagem de amostras 4 x 10 min cada com PBST (Triton X-100 0.05%)
- Incube com anticorpo secundário (por exemplo, anti-rato conjugado com fluorocromo) diluído a concentração apropriada em PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) à temperatura ambiente no escuro, durante 2 h.
Nota: Se for apropriado, use 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/ou faloidina para counterstain o tecido. Adicione estas sondas com o anticorpo secundário, tendo em conta o comprimento de onda de emissão dos fluorochromes para evitar a sobreposição de sinais. - Lavagem de amostras 4 x 10 min cada com PBST (Triton X-100 0.05%)
5. montagem
- Prepare um slide de amostra colocando 4 pontos de esmalte transparente sobre o microscópio como se fossem os vértices de um quadrado.
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Representative Results
O protocolo oferece um método simples para a obtenção de amostras de asa pupal que retêm a morfologia familiar da asa. Partir dessas preparações, é possível obter pilhas de imagens que podem ser projetadas como 2-D ou 3-d, para investigar a distribuição e/ou o enriquecimento das proteínas durante a diferenciação da ala. Um protocolo semelhante (veja a nota em 2.9) pode ser usado para coletar a amostra de grandes asas pupal (envolvendo asas pupal de 50-80) necessária para sintetizar ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA), o modelo usado em reações de PCR.
Figura 1 : Gene de hedgehog caminho em Drosófila asas pupal
(A) remendado, o receptor canônico do percurso do ouriço, foi visualizado a 24-30 h APF usando mouse anti - Ptc. núcleos foram counterstained com DAPI Considerando que os filamentos de actina são visualizados usando uma faloidina verde-fluorescente. Distribuição de actina ajuda a localizar as veias da asa e sua relação com a expressão remendado . Ao mesmo tempo, a mancha faloidina revela a presença de alguns hemócitos e gotículas de gordura (círculos grandes) como contaminar o tecido. ampliação de 20 x, anterior acabou. Escala da barra, 100 µm (B) Amplicons de actina (faixa 1, 280 bp) e ptc (pista 2, 236 bp) foram obtidos usando o synthetized do cDNA de RNA mensageiro (mRNA) asa amostra gerada por um protocolo similar de dissecação. MW, peso molecular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de dissecação descrito neste vídeo pode ser usado para preparar amostras de alta qualidade da drosófila asas pupal de diferentes estágios de desenvolvimento para muitos tipos de técnicas (por exemplo, imunofluorescência, síntese de cDNA para ensaios PCR, in vitro desenvolvimento de asa). Em termos deste método o cientista envolvidos usaram 24-30 h APF. No entanto, não deve haver nenhum obstáculo dentro as etapas essenciais na dissecação da pupa mais jovem ou mais velho. Mudanças podem ter que ser feitas para acomodar crisálidas de palco menor.
O protocolo pode ser realizado para dissecar uma pupa ou pupas vários ao mesmo tempo. Isso ajuda a acelerar o processo, tornando mais fácil para chegar a um grande número de asas dissecados. Neste caso, há a opção de remover uma linha de pupas de 4-5 ao mesmo tempo. Você pode remover as pupas juntos ou se não for possível, continuar a remover individualmente para o mesmo slide (consulte a secção III do vídeo: "Dissecação de pupas múltiplas"). Para remover a pupa nua da caixa aberta, é importante que a ponta posterior é pequena o suficiente. É possível remover o caso inteiramente; embora mais rápido seria a transferência, a remoção de todo o caso é um desafio e há um maior risco de danificar a pupa.
Experiência dita que uma manobra importante a considerar é deixar (a última 2 h para completar o tempo de desenvolvimento previsto) a pupa anexado para o slide de microscópio dentro da incubadora, mas fora do frasco. Este lapso de tempo ajuda a secar o caso tornando mais fácil de quebrar. Outro passo crítico durante a dissecção para imuno-histoquímica, é descascar fora a cutícula que cobre o epitélio de asa, desse modo, concedendo acesso do anticorpo para a superfície da asa inteira. Esta etapa deve ser feita após a fixação por vários minutos (pelo menos 5 min depois de fazer a incisão no ponto de articulação) porque o fixador estabiliza os tecidos e altera a consistência de cutícula, tornando mais fácil de descascar.
Durante a execução de todas as etapas de imuno-histoquímica, certifique-se de que as asas estão em constante movimento (plataforma de balanço). O movimento ajuda a melhorar o intercâmbio e a penetração das soluções durante lavagens e incubação do. No entanto, é importante para realizá-las com cuidado, evitando a ocorrência de distorções indesejadas na morfologia dessa estrutura frágil (ou seja, é suficiente que as oscilações da plataforma mova ligeiramente o líquido médio contendo as amostras).
Esse procedimento fornece uma abordagem complementar e alternativa para os métodos já publicados para dissecação asa pupal.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o apoio financeiro dado a este projecto, a Mariana Di Doménico pela sua assistência técnica com microscopia confocal; CSIC para José Leonardo Báez para correções seu manuscrito; para Luciano Correa por sua dedicação para a criação do vídeo; a Natalia Rosano por emprestar sua voz para o vídeo e o centro de estoque de drosófila de Bloomington para fornecer os estoques utilizados neste estudo. O Apa1 anticorpo monoclonal anti-Ptc desenvolvido por Isabel Guerrero foi obtido do banco do desenvolvimento de hibridoma estudos (DSHB) sob os auspícios dos FORMULADORES e mantido pelo departamento de ciências biológicas, da Universidade de Iowa, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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