Summary
Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para a dispersão de nanomateriais em meios aquosos com caracterização em tempo real para identificar as condições ideais sonication, intensidade e duração para melhor estabilidade e uniformidade de nanopartículas dispersões sem afetar a integridade da amostra.
Abstract
O processo de sonication é comumente usado para eliminação de aglomeração e dispersantes nanomateriais na mídia com base aquosa, necessárias para melhorar a homogeneidade e estabilidade da suspensão. Neste estudo, é realizada uma abordagem por etapas sistemática para identificar condições sonication ideal para atingir uma dispersão estável. Esta abordagem foi adoptada e mostrada para ser apropriado para vários nanomateriais (nanotubos de carbono, óxido de zinco e óxido de cério) dispersados em água desionizada (DI). No entanto, com qualquer mudança no tipo de nanomateriais ou meio de dispersão, tem de haver otimização do protocolo básico por ajustar vários fatores como tempo de sonication, poder e sonicador tipo, bem como aumento da temperatura durante o processo. A abordagem registra o processo de dispersão em detalhe. Isso é necessário para identificar os pontos de tempo, bem como outras condições acima mencionadas durante o processo de sonication em que pode haver alterações indesejáveis, tais como danos à superfície da partícula afetando propriedades superficiais. Nosso objetivo é oferecer uma abordagem harmonizada que pode controlar a qualidade da dispersão final, produzida. Tal uma orientação é fundamental para garantir repetibilidade de qualidade de dispersão na Comunidade de nanociência, particularmente no campo da nanotoxicology.
Introduction
Sonication é o processo de geração de cavitações, que envolve a criação, crescimento e colapso de bolhas (muitas vezes chamadas de pontos quentes) formadas em líquido devido a irradiação de ultra-som de alta intensidade1. Em um ambiente de laboratório, o método sonication é executado utilizando um sonicador. Há sonicators diferentes, todos tendo a função geral de aglomeração de partículas, dispersam-se em um meio líquido como partículas individuais (ou primárias). Aplicando sonication, pode melhorar a homogeneidade da amostra, potencialmente atingir uma tanto mais estreita distribuição granulométrica. Um aspecto importante a considerar no processo de dispersão é a estabilidade da dispersão final. Aqui, a estabilidade da suspensão é definida como onde as partículas não se estabelecem ou sedimento para baixo em seu estado disperso e o diâmetro médio de hidrodinâmico medições não variar mais de 10% entre as cinco medições repetidas durante esse tempo (em torno de 10 min)2,3. Existem várias maneiras de medir a estabilidade da dispersão. Isso inclui a estimativa do potencial zeta (ZP) através da medição da mobilidade eletroforética das partículas. Outra é para medir a absorção característica de nanopartículas na faixa espectral UV4.
No campo de nanotoxicology, a capacidade de ter controle sobre a qualidade de dispersão é muito importante, como a etapa de dispersão determinará chaves propriedades físico-químicas, tais como a distribuição granulométrica/tamanho, forma, agregação/aglomeração, superfície cobra, etc. este por sua vez acabará por afectar a interação das partículas com meios de ensaio e os resultados de vários experimentos in vitro e in vivo , a fim de deduzir os perigos potenciais dos nanomateriais.
Sonication comumente é realizado usando um tipo de sonda (direto) ou em um banho ultra-sônico, ou sonda ultra-sônica com um tweeter de frasco (sonication indireto). Todos os tipos de sonication estão disponíveis em uma escala de intensidade e configurações de poder, às vezes adaptadas com um tipo diferente de sonotrodo para processos específicos ou requisitos, de saída e são adequados para volumes de líquido que varia de 2 a 250 mL. Embora ultrasonication sonda é conhecido para melhor desempenho do que sonication banho por causa da alta intensidade localizada5, sonication banho é muitas vezes preferido sobre sonda-tipo para a preparação de suspensões de teste toxicológico por causa do possível risco de contaminação pela ponta, erosão da sonda de titânio dica após uso prolongado e sonda discrepâncias de profundidade de imersão. Da mesma forma, uma sonda ultra-sônica, equipada com um tweeter de frasco é vantajosa sobre a sonda direta devido os riscos de contaminação acima mencionados, bem como a facilidade de operação do equipamento. Vários frascos são lisados ao mesmo tempo e na mesma intensidade. Isto não só economiza tempo, mas garante que todas as amostras são tratadas de forma igual, o que torna os resultados entre as amostras mais fiáveis e comparáveis. A pesquisa de segurança dos nanomateriais, é sempre evitar contaminação. No entanto, o sonicador de sonda não couber este requisito e não foi testado. Sonda sonicators são conhecidos por causar alguns efeitos colaterais inevitáveis como a contaminação da amostra devido à erosão de ponta, bem como reduziram a produção de energia, levando a alterações das condições de dispersão, portanto, comprometer dados reprodutibilidade6, 7 , 8. Além disso, as amostras são geralmente executadas em recipientes descobertos, levando a perda de líquidos devido a evaporação, bem como deposição de poeira. Para evitar essas alterações não intencionais, estudos recentes recomendam alternativas sonicators indirectas com base na sua entrega eficaz de energia, bem como de garantia de pureza de suspensão6.
Sonication non-otimizado pode ter um efeito negativo sobre os resultados. Potencialmente, pode alterar as propriedades físicas e químicas principais os nanomateriais como tamanho, distribuição de tamanho, morfologia e carga de superfície2,9. Literatura anterior relatou tais falhas para controlar o processo de sonication e o impacto sobre parâmetros de partículas como nano-TiO25,10,11, nano-ZnO6e nano-cobre12 . Além disso, estudos anteriores demonstraram que o processo de sonication não só altera as características das partículas, mas também rege o resultado de testes toxicológicos12,13.
Para ter controle sobre o processo de dispersão, é importante monitorar e compreender como diferentes fatores tais como tipo do sonicador, poder de instrumento e duração, volumes, etc., pode afectar a qualidade de dispersão. Portanto, há uma necessidade de ter um procedimento sistemático para analisar as principais características físico-químicas das partículas em dispersão no tempo de diferentes pontos do processo sonication. Embora tais considerações foram tidos em conta por alguns pesquisadores, o trabalho nesta área é limitado. Bihari et al estudaram a estabilidade da dispersão de dispersões diferentes nanomaterial feito usando energias diferentes ultra-som com vários estabilizadores de dispersão14. Uma recente revisão por Hartmannn et al destacou que embora o trabalho tem sido feito para compreender os diferentes fatores que afetam o nanomaterial dispersão qualidade por exemplo, tipo do sonicador usado, tempo de sonication, etc, ainda não há procedimento bem definido e universalmente aceite sonication que atualmente suporta nanotoxicological testes e investigações7,15.
Várias técnicas de caracterização analítica são usadas para monitorar a qualidade de dispersão. Estes incluem o uso de: espalhamento dinâmico de luz (DLS), disco de centrifugação, espalhamento de luz Electrophoretic (ELS), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-vis) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), que medem a distribuição de tamanho/tamanho de partícula, potencial zeta, estabilidade de dispersão e características de morfologia, respectivamente. DLS é frequentemente usado para determinar o diâmetro hidrodinâmico (Z-média) das partículas e índice de polidispersividade (PdI) da dispersão do nanomaterial. No caso de distribuição multimodal por DLS, Z-média obtida pode não concordar com a intensidade de distribuição de tamanho de intensidade-tornada mais pesada. Como tal, a média da distribuição do tamanho de intensidade-tornada mais pesada pode ser citada. PdI reflete a amplitude da distribuição do tamanho com uma escala que varia de 0 - 1, com 0, sendo uma amostra monodispersas e 1 sendo um altamente polydisperse amostra16. Disco de centrifugação é uma técnica de separação usada para determinar a distribuição de tamanho de partícula usando centrífuga sedimentação em meio líquido. Os sedimentos de partículas dentro de um opticamente clara e girando o disco e a quantidade de luz espalhada pelas partículas quando atingirem a borda do disco é gravado e convertido em distribuição granulométrica usando a lei de Stokes. Para resolver a distribuição de partículas multimodais, técnicas como a centrífuga de disco são mais adequadas como eles têm um elemento de mecanismo de separação integrado dentro do instrumento. Zeta potencial (ζ -potencial) das partículas é definido como o potencial elétrico no cisalhamento ou avião deslizando, que é um limite teórico dentro da camada dobro elétrica que separa o líquido (a granel), mostrando o comportamento viscoso normal do Camada de popa, uma camada que é predominantemente composta por íons de contador e considerada para mover-se com a partícula. O potencial zeta está diretamente relacionado com a carga superficial das partículas e, portanto, a interação eletrostática (ou seja, repulsão/atração) entre as partículas. Este parâmetro, portanto, é considerado um indicador primário da estabilidade da dispersão nanomaterial. Por convenção, o potencial zeta valor abaixo -25 mV e, acima de 25 mV são considerados estáveis17,18. A concentração e o tipo de íons, bem como o pH da solução, fortemente afetam o potencial zeta19. ELS é usado para medir a mobilidade eletroforética das partículas em dispersão e essa mobilidade é convertida em zeta potencial através da equação de Henry e os modelos de Smoluchowski ou Hückel. Espectroscopia UV-vis é uma técnica usada para quantificar a luz que é absorvida e espalhada por uma amostra em um determinado comprimento de onda. Muitas vezes é usado para monitorar a estabilidade da dispersão medindo-se a absorção característica de nanomateriais na região UV. Finalmente, TEM muitas vezes é usado para visualizar e analisar o tamanho, distribuição de tamanho, aglomeração e forma das nanopartículas14,5,15,20.
Apresentamos um estudo comparativo de seis diferentes nanomateriais dispersões, feitas com banho de ultra-sons e uma sonda ultra-sônica, equipado com um tweeter de frasco. A concentração de partículas, temperatura, tipo sonicador e configurações usadas no estudo são especificadas no protocolo, para que as configurações experimentais para sondas similares e banhos de ultra-som podem ser inferidas. Os nanomateriais seguintes são utilizados: prata (Ag), óxido de cério (CeO2), óxido de zinco (ZnO, NM110-hydrophylic e NM111-hidrofóbico) e nanomateriais à base de carbono, como nanotubos de carbono (A32 e A106, consulte Tabela de materiais).
Avaliação da qualidade de dispersão em pontos diferentes do tempo ao longo do processo de sonication é feita utilizando várias técnicas de caracterização, nomeadamente DLS para distribuição de tamanho/tamanho de partícula, centrifugação de disco para distribuição de tamanho, ELS para zeta potencial, Espectroscopia de UV-vis para a estabilidade e TEM da forma das partículas e da homogeneidade. Um número de diferentes nanomateriais variando de metais óxidos de carbono é avaliado. Para comparação, suspensão aquosa comercial de nanopartículas de prata (Ag NPs) estabilizado com citrato tampando é usada em paralelo, para deduzir a estabilidade a longo prazo esperada de suspensão disponível comercialmente relevante. Obviamente, este modelo Ag NPs não está diretamente relacionado a qualquer um dos processos de dispersão, mas atua exclusivamente para indicar a necessidade de re-proceda à sonicação ou re-estabilizar as suspensões após algum tempo de armazenamento, como alterações como re-aglomeração são vinculadas a ocorrer durante a armazenamento. A suspensão é mantida na geladeira por dois meses. Durante este período, a dispersão é caracterizada para identificar potencial aglomeração das partículas. Os resultados iniciais mostram uma suspensão instável (como discutido na seção de resultados ). Posteriormente, esta dispersão é mais submetido a tratamentos diferentes sonication, semelhantes os outros nanomateriais utilizados no estudo. O objetivo do estudo é confirmar que nós pode de aglomerado a suspensão através do mesmo protocolo sonication. Assim, o modelo de Ag NPs pode ser associado como a referência para estudos de longo prazo que representa re-dispersão de partículas de forma otimizada.
Os protocolos de dispersão apresentados aqui compartilham semelhanças com aqueles publicados na literatura anterior e incorpora algumas das poucas recomendações feitas anteriormente pelos últimos trabalhadores7,21,22,23 ,24,25. Neste estudo, uma abordagem sistemática e passo a passo é usada para monitorar a qualidade de dispersão em todo o protocolo de dispersão. Esta abordagem compromete-se em tempo real caracterização de dispersões o nanomaterial, a fim de identificar condições optimal dispersão experimental (Figura 1).
Figura 1. Fluxograma descrevendo o esquema e a sequência de passo a passo do protocolo dispersão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Nota: Todos os produtos químicos são usados como recebidos sem mais purificação. Use água ultrapura durante todo o estudo com uma resistividade de 18 MΩ·cm. Todas as dispersões preparadas geralmente são armazenadas em 5 ° C, no escuro para estudos de estabilidade futura ou qualquer caracterização adicional, mas isto pode variar dependendo da composição do material e outras propriedades associadas como dissolução. Por exemplo, Ag NPs são geralmente estável por algum tempo, se armazenado entre 2-5 ° C, longe da luz solar; no entanto, alterações dinâmicas estão prestes a acontecer dentro as suspensões e dispersões serão re-aglomerado, no entanto e são conhecidas por sedimento para baixo, com o tempo. Analise estes materiais usando DLS, UV-vis e TEM para verificação de qualidade antes de4,5,13,14de análise biológica. Uma concentração de 0,02 mg/mL é usada para análise abaixo. A concentração de amostra é adequada para análise usando DLS, UV-vis, centrífuga de disco, cálculos de potencial zeta e análise TEM.
1. calibração da energia fornecida por Sonicators
Nota: A potência acústica eficaz entregada à suspensão lisada é um parâmetro importante a fim de obter as dispersões podem ser reproduzidas. Isto é diferente da entrada eléctrica ou potência de saída do gerador indicado pelo fabricante, pois este é o real poder de entrega à suspensão durante sonication26. Entre muitos métodos para o cálculo da potência efetiva entrega, o método mais comumente utilizado é a calorimetria26. Isso é conhecido por ser um modo simples e eficaz para a medição direta da potência efectiva entregada a uma suspensão de7. Neste método, o aumento de temperatura do líquido a um sonicador determinada configuração é gravado ao longo do tempo e a potência efetiva entregada é calculada usando a seguinte equação:
onde P é a potência acústica entregue (W), T é a temperatura (K), corresponde a hora (s) t, CP é o calor específico do líquido (4,18 J/g · K para a água), e M é a massa do líquido (g).
-
Calibração de potência entregue pela sonda ultra-sônica, equipada com um tweeter de frasco
Nota: O método é adaptado de Taurozzi et al . 7 e as etapas a seguir são recomendadas.- Coloque um tubo de ensaio plástico vazio sobre a micro-balança e tare a balança.
- Encha o frasco com 1,5 mL de água Desionizada (resistividade 18 MΩ·cm) e gravar a massa do líquido com a balança.
- Coloque o frasco em um dos orifícios na parte de alta intensidade do tweeter frasco seis frasco e mergulhe uma sonda de temperatura, conectada a um medidor de temperatura digital utilizando uma pinça. Certifique-se que a sonda não tocar as paredes do frasco e é de aproximadamente 2 cm abaixo da superfície líquida.
- Defina a configuração de tweeter do frasco em 24 kHz e 10 W (ajuste em 50% da amplitude) e operam no modo contínuo.
Nota: Outros ajustes de amplitude testados aqui são 70%, 90% e 100%. - Gravar o aumento na temperatura da água para o inicial 5 min em um intervalo de 30 s e certifique-se de que o frasco ou o instituído não mudar de posição.
- Criar uma temperatura versus gráfico de tempo em um software de planilha eletrônica e obter o melhor ajuste linear para a curva utilizando a regressão de mínimos quadrados.
- Obter a inclinação do gráfico (que é o aumento de temperatura ao longo do tempo) e calcular a potência entregue usando a equação 1. Repetir o experimento três vezes e obter o valor médio.
- Repita o procedimento de passos 1.1.1 - 1.1.4 para configurações de amplitude de 70%, 90% e 100%. O valor de potência obtido usando este procedimento é relatado durante o procedimento de dispersão.
-
Calibração de potência entregue por um banho de ultra-sons
- Coloque um tubo de ensaio plástico vazio sobre a micro-balança e tare a balança.
- Encha o frasco com 1,5 mL de água Desionizada (resistividade 18 MΩ·cm) e gravar a massa do líquido com a balança.
- Coloque o frasco no meio do banho ultra-sônico que metade mergulhada na água e fixá-lo com uma pinça. Mergulhe uma sonda de temperatura, conectada a um medidor de temperatura digital utilizando uma pinça. Certifique-se que a sonda não tocar as paredes do frasco e é de aproximadamente 2 cm abaixo da superfície líquida.
- Configurar o banho ultra-sônico a 40 KHz e 80 W e operam no modo contínuo.
- Gravar o aumento na temperatura da água para o inicial 5 min em um intervalo de 30 s e certifique-se de que o frasco ou o instituído não mudar de posição.
- Criar uma temperatura versus gráfico de tempo no excel e obter o melhor ajuste linear para a curva utilizando a regressão de mínimos quadrados.
- Obter a inclinação do gráfico em um software de planilha (que é o aumento de temperatura ao longo do tempo) e calcular a potência entregue usando a equação 1. Repetir o experimento três vezes e obter o valor médio. O valor de potência obtido usando este procedimento é relatado durante o procedimento de dispersão.
2. procedimento dispersão em meio aquoso, usando uma sonda ultra-sônica, equipada com um Tweeter de frasco
- Pese 2 mg de cada um do nanopowder necessário usando uma espátula limpa em três frascos de vidro limpo. Rotulá-los como frascos de 1, 2 e 3.
- Pipetar 1 ml de água DI e adicionar ao longo das paredes de cada frasco. Fazer uma pasta grossa com a ajuda de uma vareta de vidro limpo, fino e, em seguida, adicione o restante da água tornar-se uma concentração final de 0,2 mg/mL. No caso de uma amostra hidrofóbica, realizar a pré-umectante usando 1 mL de etanol a 0,5% vol/vol e adicionar a água DI compõem a concentração final exigida.
- Selar cada frasco com a tampa e apertar bem no movimento circular horizontal de forma nanopowder, aderindo às paredes do frasco.
- Coloque os três frascos a sonda ultra-sônica, equipado com um tweeter de frasco e aplicar o primeiro tratamento sonication por 2 min em 1.1 W em modo pulsado (1 s de s/1, que significa 1 s na e 1 s fora). Isto dará um aumento de temperatura de cerca de 4 ° C na dispersão.
- Pegue frasco 1 e pipeta, uma quantidade adequada de alíquota do topo do frasco, dilui-lo com água a uma concentração de 0,02 mg/mL. Caracterizar a dispersão diluída para distribuição de tamanho de partícula, tamanho, forma, aglomeração e potencial zeta, utilizando uma gama de técnicas complementares como DLS, TEM, UV-vis e ELS (discutidos na seção 4). Gravar e documentar as medições com precisão.
- Uma pausa de 10 min da etapa 2.4 para permitir o arrefecimento da amostra e para evitar qualquer aumento de temperatura abrupta no sistema. Aplica um segundo tratamento sonication frascos 2 e 3 para 4 min, com as mesmas configurações de amplitude e modo pulsado. Retire o frasco 2, repita a etapa 2.5 e documentar as leituras após 6 min de sonication.
- Uma pausa de 10 min, aplicar um tratamento sonication terceiro frasco 3 para outro 4 min e siga passo 2.5. Gravar e documentar as medições em 10 min de sonication (discutido na seção 4).
Nota: Óculos, luvas e jalecos de laboratório devem ser usados quando manipulação de suspensões de nanopartículas. O sonicador deve ser colocada no recinto acústico durante mais experiências, e aquecedores de orelha de alta proteção devem ser usadas ao trabalhar mais próximos à fonte de ultra-som.
3. procedimento dispersão em meio aquoso, usando um banho ultra-sônico
- Pesar 2 mg de cada um do nanopowder necessário usando uma espátula limpa em quatro frascos de vidro limpo e classificá-los como frascos de 4, 5, 6 e 7.
- Pipetar para fora algumas gotas de água DI e adicionar ao longo das paredes de cada frasco e fazer uma pasta grossa com a ajuda da vareta de vidro limpo fina. Em seguida, adicione o resto da água tornar-se uma concentração final de 0,2 mg/mL em cada frasco.
Nota: No caso de uma amostra hidrofóbica, o pre-umectante é realizado usando 1 mL de etanol a 0,5% vol/vol e em seguida DI água é adicionada para compensar a concentração final exigida. - Selar cada frasco com a tampa e apertar bem no movimento circular horizontal para remover qualquer nanopowder aderindo às paredes do frasco.
- Coloque os quatro frascos no meio do banho ultra-sônico com os frascos que meio mergulhados em água e aplicar o primeiro tratamento sonication 80 W durante 15 minutos à temperatura ambiente. Isso daria um aumento de temperatura de cerca de 3 ° C na dispersão.
- Retirar o frasco 4 do banho ultra-sônico e pipetar uma quantidade adequada de alíquota do topo do frasco, dilui-lo com água a uma concentração de 0,02 mg/mL e caracterizar a amostra para a distribuição de tamanho de partícula, tamanho, forma, aglomeração e zeta potencial, utilizando uma gama de técnicas complementares como DLS, temperatura, UV-vis e ELS (discutidos na seção 4). Gravar e documentar as medições.
- Mudar a água em banho de ultra-sons e aplicar um segundo tratamento sonication para frascos de 5, 6 e 7 para outro 15 min com as mesmas configurações (80 W). Remova o frasco 5, siga o passo 3.5 para caracterização e documentar as leituras em 30 min de sonication.
- Mudar a água em banho de ultra-sons (para evitar qualquer novo aumento de temperatura) e aplicar um terceiro tratamento sonication da outra 30 min para frascos de 6 e 7 com as mesmas configurações com uma pequena pausa de mudança de água novamente em 15 min. remover frasco 6 e siga o passo 3.5. Gravar e documentar as medições em 1h de sonication.
- Mudar a água novamente no banho ultra-sônico cada 15 min e aplique um tratamento sonication quarto frasco 7 por mais uma hora, mantendo-a constante de configurações. Retire o frasco 7 e siga passo 3.5 para a caracterização completa e registrar as medições em 2 h de sonication.
4. caracterização das amostras dispersas em diferentes pontos do tempo
- Caracterização de tamanho usando DLS 27
- Abra o software DLS. Criar um arquivo de medição tamanho que pode ser individualizado para um nanomaterial específico (incluindo um para um padrão) usando o valor de índice de refração do manual Malvern. Além disso, quaisquer outros dados, conforme exigido pelo software, tais como valores de viscosidade e a absorção de entrada e também tipo de dispersante.
- Entrar nas condições de experimento para a amostra, tais como tempo da equilibração 2 min, temperatura de 20 ° C, cubeta do tipo como cubeta descartável de baixo volume e experimentar a execução em modo automático. Pressione arquivo | Salvar (salvar com o nome desejado).
- Pressione "arquivo | Abra a nova medição"e executar um teste de verificação de DLS usando padrão grânulos de látex com um tamanho nominal de 100 nm para qualificar o desempenho do instrumento
- Use um cubeta descartável do volume baixo. Injecte 1 mL da amostra com seringa ou pipetas para evitar quaisquer bolhas de ar.
Nota: Limpe as cubetas com etanol e DI água antes do uso. - Inserir a cubeta na máquina. Clique no botão "Iniciar" no painel arquivo de medição. Note que isto irá equilibrar a amostra por 2 min e meça a 20 ° C.
Nota: Se as amostras foram previamente armazenadas na geladeira, permita-lhes atingir a temperatura ambiente antes de usar. - Coletar pelo menos cinco medidas em modo automático e tirar a média das medições para relatar o tamanho selecionando todas as medições e clicando em "média" do painel superior. Exporte os dados para o excel para posterior análise.
- Relate o diâmetro hidrodinâmico como a Z-média, com a largura do PdI que representa o desvio padrão da média-Z no caso de uma distribuição de monomodal28. No caso de uma discrepância significativa entre a Z-média e a média da distribuição do tamanho de intensidade-tornada mais pesada, que é indicativa de polidispersividade ou aglomeração, a média do resultado de distribuição do tamanho de intensidade ponderada é citada com um comentário sobre o status de amostra.
- Repita a etapa 4.1.3 para novas medições.
Nota: DLS não é uma técnica adequada para a análise de amostras não-ideal. Por isso, queremos dizer amostras que são partículas não-esférica de polidispersividade alta, extensa aglomeração, sedimentação, etc. , que as medições repetidas podem resultar em leituras imprecisas devido à sedimentação/sedimentação de partículas. Em tais casos, recomenda-se outras técnicas complementares tais como centrifugação do disco, que pode ser usada para avaliar a dispersão de forma qualitativa.
- Use um cubeta descartável do volume baixo. Injecte 1 mL da amostra com seringa ou pipetas para evitar quaisquer bolhas de ar.
- Distribuição de tamanho por centrifugação de disco
- Abra o software do CPS. Selecione "Definição de procedimento", colocar no nome de SOP de amostra na parte superior e preencher os parâmetros de amostra como diâmetro mínimo e máximo, a densidade de partículas, índice de refração, absorção e fator não-esfericidade29.
- Por exemplo, de nanopartículas de ZnO, digite micron 0,1 e 1,0 mícron em abas o diâmetro mínimo e máximo, respectivamente, digite 5,61 g/mL da densidade de partículas, 2.1 na seção de índice de refração, 0,001 na absorção das partículas e 1 na non-esfericidade seção.
- Preencha a calibração detalhes padrão baseados no padrão do PVC de pico diâmetro 0.377 µm com uma densidade de partículas de 1,385 g/mL. Também preencha os parâmetros fluidos (sacarose, densidade do fluido de 1,04 g/mL e índice de refração de fluido de 1,35) e nome e salvar o procedimento.
- Escolheu o procedimento selecionado (SOP salvou na etapa 4.2.1) e injetar o primeiro nível gradiente, 1,6 mL de sacarose (24%) no orifício através do disco e pressione 'Iniciar'.
Nota: O papel da sacarose aqui é estabelecer um gradiente de densidade no disco enquanto girando a uma velocidade constante. Isso calculado automaticamente a velocidade de disco, dependendo do intervalo de tamanho. - Espere até que o software atinge o calculados automaticamente RPM (rotações por minuto). Estabilizar a sedimentação injetando um gradiente de sacarose (baixa densidade 8% e 24% high-density, ver tabela 1), 1,6 mL total de volume de cada vez começando com maior densidade e terminando com a solução de densidade mais baixa.
Nota: Aqui marcamos a solução de sacarose 8% como baixa e a solução de sacarose 24% mais alta. Eles são misturados em volumes seguintes (volume total 1,6 mL cada vez) e injetados o disco um por um até um gradiente é formado.- Em seguida, Injete 1,0 mL de fluido de cap dodecane que ajuda a manter o gradiente dentro do disco para um mínimo de 6 h. permitir o centrifugador do disco para equilibrar por 1h.
- Selecione "Analisador de operar" e introduzir o ID de amostra e pressione Iniciar. 0,2 mL de padrão de injetar com uma seringa de 1 mL no disco e pressione a barra de espaço ao mesmo tempo. Então injete 0,2 mL da amostra e pressione a barra de espaço ao mesmo tempo. Espere para a medição de terminar e, em seguida, clique em próxima amostra.
- Use o software de sistema de controle de centrífuga disco de adquirir e processar os dados. Para isso, clique em "recuperar a distribuição" e clique sobre o nome de amostra; Isso abre o gráfico de distribuição de tamanho da amostra. Exporte os dados para um gerente de folha de cálculo.
- Abra o software do CPS. Selecione "Definição de procedimento", colocar no nome de SOP de amostra na parte superior e preencher os parâmetros de amostra como diâmetro mínimo e máximo, a densidade de partículas, índice de refração, absorção e fator não-esfericidade29.
- Estudo de estabilidade de dispersão usando espectroscopia UV-vis
Nota: A espectroscopia UV-vis é frequentemente usada para compreender a estabilidade de suspensão e agregação, observando atentamente as mudanças no pico de intensidade, a distorção espectral, forma espectral também mudança de comprimento de onda no espectro de absorção4. As etapas detalhadas são como segue.- Abra o software de espectrofotômetro UV-vis e clique em "varredura de espectro"30.
- Use uma cubeta de quartzo padrão (célula semi microrectangular quartzo 100mm, 190-2.700 nm). Injecte 2-3 mL de amostra com uma pipeta.
- Antes de usar, lave as cubetas com 50% de ácido nítrico por 10 min e depois lavar três vezes com água purificada. Em seguida enxágue com acetona, remover o excesso e secar ao ar.
- Pré-ajuste do intervalo de definição do instrumento a 700 nm de comprimento de onda de 200 nm na guia clicando "Instrumento" na parte superior do painel de software e clicando em 'definir o comprimento de onda' comprimento de onda.
- Clique em "linha de base". Fundo subtrair cada espectro usando um correspondente 'em branco' ou seja, uma cubeta repleto somente dispersão médio, que neste caso é a água.
Nota: No caso de amostras hidrofóbicas, uma proporção similar de etanol: água é usada como meio de dispersão. - Coletar pelo menos três espectros individuais em cada amostra clicando em "instrumento | Propriedade"e digite '3' no número de espectros. Tome valores médios para análise. Salvar os dados e exportar os dados para posterior análise.
- Medições de potencial zeta usando ELS
- Abra o software DLS. Crie um zeta potencial medição arquivo que pode ser individualizado para um nanomaterial específico usando o valor de índice de refração do manual Malvern. Outras informações que podem ser plugadas o software , por exemplo, absorção, viscosidade e tipo de dispersante como encontrado no guia de configuração de amostra clique de entrada "arquivo | Save"e salve com o nome desejado.
- Clique em "arquivo | Abra a nova medição"e verificar o desempenho do instrumento usando uma referência padrão DTS 1235 (padrão de potencial zeta). Este é um látex de poliestireno padrão em tampão aquosa em pH 9 e tem um potencial zeta de-42 ± 4.2 mV.
- Prepare a amostra em uma seringa pelo menos 1 mL de capacidade. Uso uma descartável dobrado célula capilar equipado com um eletrodo de cada lado para as medições de potencial zeta. Injete cuidadosamente a amostra dentro da célula capilar através de uma das portas da célula capilar verificando que não há nenhuma bolha.
- Uma vez que a amostra começa a emergir do outro lado, insira as rolhas e remover qualquer líquido que pode ter derramado sobre os eletrodos. Limpe as cubetas completamente com etanol e água.
- Inserir a célula capilar dobrada dentro da máquina. Equilibrar-se por 2 min e adquirir as medições a 200 ° C, a menos que especificado. Se amostras de dispersão foram previamente armazenadas na geladeira, permitir que as amostras de dispersão atingir a temperatura ambiente antes de usar.
- Coletar pelo menos cinco medidas em modo automático e informar o valor de potencial zeta em média. Exportar os dados, analisar17,18 (tipicamente, valor potencial zeta abaixo -25 mV e, acima de 25 mV é considerado estável) e interpretar online ou offline.
- Caracterização morfológica utilizando TEM
- Usamos películas de carbono holey grades (malha 300) para a preparação da amostra. Coloque uma gota da amostra dispersão (aproximadamente 0,1 mL, 0,02 mg/mL) em uma grade limpa.
- Permitir que amostra ao ar seco em condições ambiente mantendo as grades cobertas para evitar a contaminação pelo ar.
- Lave as grades com água ultra-pura para remover quaisquer efeitos de secagem e sem prejuízo de imagem TEM.
Nota: A adição da gota da grelha dispersão aumenta a concentração de partículas na superfície de grade, conduzindo assim a forças atrativas entre partículas. Secagem desigual pode causar artefatos. Um pequeno enxágue com água ultra-pura elimina esse risco e é útil para uma secagem uniforme de grades31. - Adquirir as imagens em um formato dm3 e depois examiná-los off-line usando o software TEM.
Nota: Imagens podem ser usadas para deduzir informações complementares em torno de tamanho de partícula, estrutura e forma. Arquivos são convertidos para tiff, em que a quantificação em Propriedades tais como a forma e o tamanho pode ser realizada.
Representative Results
Os dados calorimétricos, mostrando o aumento da temperatura ao longo do tempo durante os dois tipos de sonication são mostrados na Figura 2. A potência acústica eficaz entregada para a dispersão em uma sonda ultrassônica, equipada com um tweeter de frasco (fonte de energia 200 W) é calculada para ser 0.55 ± 0,05 W em amplitude de 50%, ± 0,75 0,04 W em amplitude de 70%, 1,09 ± 0,05 W em amplitude de 90% e 1,15 ± 0,05 W em 50% amplit UDE, Considerando que para o banho de ultra-sons (fonte de alimentação 80 W), é calculado para ser 0.093 ± 0,04 W no ajuste de 100%. A constatação é semelhante ao trabalho publicado anteriormente, o que demonstra que a potência de saída exibida pelos sonicators é muito menor do que entregue as suspensões sob tratamento32,33,34.
Figura 2. Calorimétricos dados mostrando aumento de temperatura ao longo do tempo durante sonication usando (A) uma sonda ultra-sônica equipado com um tweeter de frasco e (B) um banho ultra-sônico. A potência acústica eficaz entregada para a dispersão em uma sonda ultrassônica, equipada com um tweeter de frasco (fonte de energia 200 W) é calculada para ser 0.55 ± 0,05 W em amplitude de 50%, ± 0,75 0,04 W em amplitude de 70%, 1,09 ± 0,05 W em amplitude de 90% e 1,15 ± 0,05 W em 50% amplit UDE, Considerando que para o banho de ultra-sons (fonte de alimentação 80 W), é calculado para ser 0.093 ± 0,04 W no ajuste de 100%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Achados associados com as várias dispersões de nanomateriais produzidas por diferentes protocolos são resumidos na tabela 2. Os resultados mostram a variabilidade da qualidade de dispersão (medida pelo DLS, ELS e temperatura) associada com dispersões diferentes nanomateriais produzidas usando sonication diferentes condições. Como esperado, variabilidade de dados é governada por diversos fatores como tipo de nanomateriais, sonication período de tempo, e se uma sonda ou um banho ultra-sônico tem sido utilizado no protocolo. O espectro de UV-vis obtido para cada nanomaterial é mostrado na Figura 3 e Figura 4 e os resultados DLS são mostrados na Figura 5 e Figura 6.
A finalidade da tabela 2 é não só para mostrar o grau de variabilidade de dados, mas também para permitir a identificação de um protocolo de dispersão otimizada para um determinado nanomaterial dispersão. Se tais dispersões foi usadas como parte de um método de teste nanotoxicological e, em seguida, o ideal é ter uma dispersão estável (de preferência uma magnitude de no mínimo ± 30 mV), um pequeno PdI indicando distribuição granulométrica mais estreita (de preferência com PdI de 0,2 ou menos) e um pequena média DLS granulometria, para indicar a separação dos grandes aglomerados. Aqui, Z-média é definida como a intensidade baseado tamanho médio das nanopartículas e PdI é uma medida da largura da global distribuição (descrita na introdução) de tamanho.
| NM | Código de exemplo | Tempo de sonication | Tamanho por DLS (nm) | Índice de polidispersividade (PdI) | Zeta potencial (mV) |
| Óxido de cério | CeO2_powder | 0 | 396±130 | 0.763±0.100 | 17.2±0.4 |
| CeO2_B_15min | 15 min | 128±4 | 0.231±0.015 | 39.2±1.0 | |
| CeO2_B_30min | 30 min | 117±5 | 0.210±0.008 | 38.1±0.5 | |
| CeO2_B_1h | 1 h | 95±3 | 0.209±0.012 | 46.5±0.5 | |
| CeO2_B_2h | 2 h | 92±2 | 0.203±0.007 | 46.5±1.4 | |
| CeO2_P_2min | 2 min | 126±7 | 0.218±0.005 | 28.8±0.7 | |
| CeO2_P_6min | 6 min | 131±2 | 0.209±0.014 | 40.5±0.7 | |
| CeO2_P_10min | 10 min | 122±1 | 0.184±0.014 | 44.4±1.3 | |
| Óxido de zinco (hidrofílico) | ZnO_NM110 pó | 0 | 1410±120 | 0.786±0.150 | 17.1±0.5 |
| ZnO_NM110_B | 15 min | 239±2 | 0.130±0.024 | 25.4±1.0 | |
| _15min | |||||
| ZnO_NM110_B | 30 min | 251±2 | 0.166±0.020 | 21.6±0.3 | |
| _30min | |||||
| ZnO_NM110_B | 1 h | 310±8 | 0.162±0.025 | 21.0±0.2 | |
| _1hr | |||||
| ZnO_NM110_B | 2 h | 274±3 | 0.243±0.014 | 25.2±0.7 | |
| _2hr | |||||
| ZnO_NM110_P | 2 min | 377±20 | 0.267±0.025 | 21.7±0.4 | |
| _2min | |||||
| ZnO_NM110_P | 6 min | 885±70 | 0.276±0.023 | 8.6±0.6 | |
| _6min | |||||
| ZnO_NM110_P | 10 min | 1074±88 | 0.673±0.058 | 11.2±1.4 | |
| _10min | |||||
| Óxido de zinco (hidrofóbico) | ZnO_NM111_ | 0 | 758±86 | 0.823±0.006 | -14.6±0.7 |
| em pó | |||||
| ZnO_NM111_ | 15 min | 384±95 | 0.399±0.074 | -17.5±1.0 | |
| B_15min | |||||
| ZnO_NM111_ | 30 min | 282±35 | 0.361±0.009 | -22.4±0.5 | |
| B_30min | |||||
| ZnO_NM111_ | 1 h | 296±18 | 0.379±0.031 | -22.8±0.5 | |
| B_1hr | |||||
| ZnO_NM111_ | 2 h | 280±54 | 0.366±0.031 | -23.7±1.0 | |
| B_2hr | |||||
| ZnO_NM111_ | 2 min | 227±9 | 0.402±0.032 | 19.8±0.8 | |
| P_2min | |||||
| ZnO_NM111_ | 6 min | 340±58 | 0.477±0.026 | -21.1±0.2 | |
| P_6min | |||||
| ZnO_NM111_ | 10 min | 370±72 | 0.626±0.065 | -21.8±0.8 | |
| P_10min | |||||
| CNT | A32_powder | 2 min | 306±5 | 0.279±0.029 | -23.7±0.5 |
| A32_B_15min | 15 min | 250±3 | 0.200±0.007 | -18.0±0.4 | |
| A32_B_30min | 30 min | 255±2 | 0.282±0.036 | -20.2±1.1 | |
| A32_B_1hr | 1 h | 230±3 | 0.226±0.021 | -21.7±0.5 | |
| A32_B_2hr | 2 h | 267±3 | 0.337±0.019 | -20.6±0.6 | |
| A32_P_2min | 2 min | 255±4 | 0.217±0.011 | -22.5±0.4 | |
| A32_P_6min | 6 min | 245±9 | 0.328±0.029 | -23.6±0.8 | |
| A32_P_10min | 10 min | 254±4 | 0.313±0.029 | -23.6±0.5 | |
| CNT | A106_powder | 2 min | 580±18 | 0.305±0.070 | -35.9±1.0 |
| A106_B_15min | 15 min | 573±18 | 0.404±0.016 | -29.5±1.0 | |
| A106_B_30min | 30 min | 479±11 | 0.363±0.013 | -28.8±1.4 | |
| A106_B_1hr | 1 h | 566±22 | 0.461±0.054 | -25.0±0.7 | |
| A106_B_2hr | 2 h | 477±10 | 0.311±0.027 | -26.8±0.5 | |
| A106_P_2min | 2 min | 300±58 | 0.473±0.053 | -29.8±1.0 | |
| A106_P_6min | 6 min | 390±10 | 0.359±0.022 | -40.7±0.5 | |
| A106_P_10min | 10 min | 300±85 | 0.511±0.134 | -24.5±0.7 | |
| Prata | Ag_cit | 0 | 72±50 | 0.462±0.258 | -38.7±1.3 |
| Ag_B_15min | 15 min | 25±1 | 0.489±0.008 | -39.8±2.2 | |
| Ag_B_30min | 30 min | 25±1 | 0.532±0.036 | -30.7±2.8 | |
| Ag_B_1hr | 1 h | 25±1 | 0.542±0.028 | -39.2±1.7 | |
| Ag_B_2hr | 2 h | 28±5 | 0.387±0.015 | -35.8±1.8 | |
| Ag_P_2min | 2 min | 29±1 | 0.300±0.025 | -42.0±2.9 | |
| Ag_P_6min | 6 min | 26±2 | 0.263±0.017 | -40.4±1.5 | |
| Ag_P_10min | 10 min | 25±2 | 0.251±0.011 | -47.3±1.4 |
Tabela 2. Resumo dos resultados da dispersão NM na água. 'P' os códigos de amostra indica dispersão realizados utilizando uma sonda ultra-sônica, equipada com um tweeter de frasco e 'B' no código de exemplo indicado dispersão realizados usando um banho ultra-sônico. Todas as medidas foram feitas em 0,02 mg/mL. Sonication no tempo 0 significa um não-lisados suspensão ou seja, apenas firme, agitação e mistura sem qualquer outro auxílio. CNTs que são completamente insolúvel e não-dispersível em água DI na agitação física foram lisados por uma inicial 2 min em sonicador o banho e também relatados.
Figura 3. Espectros de UV-vis de (um) CeO2, (B) ZnO NM110 e (C) ZnO NM111 dispersão em água. Espectroscopia UV-vis é usada para entender a estabilidade de suspensão e agregação, observando atentamente as mudanças no pico de intensidade, a distorção espectral, espectral também forma a mudança de comprimento de onda em espectros de absorção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Espectros de UV-vis de dispersão (A) CNTs A106, A32 CNTs (B) e (C) Ag_citrate em água. Espectroscopia UV-vis é usada para entender a estabilidade de suspensão e agregação, observando atentamente as mudanças no pico de intensidade, a distorção espectral, espectral também forma a mudança de comprimento de onda em espectros de absorção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Distribuição de tamanho pela intensidade obtida com DLS para (A) NM111 (C) ZnO dispersão em água, (B) ZnO NM110 e CeO2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Distribuição de tamanho pela intensidade obtida com DLS para (A) CNTs A106, A32 CNTs (B) e (C) Ag_citrate de dispersão em água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No caso de suspensão de nanomaterial CeO2 , o uso de sonication resultou em uma diminuição global no tamanho de partícula e valores PDI. Sem qualquer sonication, resultados mostram uma distribuição multimodal de intensidade, com uma média de Z (396 ± 130 nm) e um valor muito alto de PdI de 0.763 ± 0,100 (tabela 2). Além disso, a dispersão mostra um valor de potencial zeta de 17,2 ± 0,4 mV. Deve notar-se que um PdI de ≥0.5 é indicativo de uma suspensão altamente polydisperse. Portanto, a amostra foi submetida a centrifugação de disco e os dados de distribuição de tamanho obtidos também confirmaram uma amostra não-uniforme e homogênea (Figura 7a). Análise de morfologia e tamanho de amostra pela TEM mais confirmou que as partículas na dispersão são de fato altamente polydisperse (Figura 8). Após dispersar o pó usando um banho ultra-sônico por 15 min, os resultados mostraram melhoria da qualidade geral de dispersão. Em particular, a estabilidade (como foi observado por seu correspondente valor de potencial zeta) e monodispersity gerais tinham melhorado. Aumentar o tempo de sonication para 2h resultou em muito melhor estabilidade e distribuição granulométrica mais estreita (tabela 2). É claro que há gradual melhoria na qualidade de dispersão se tempo de banho sonication é usado, como pode ser visto pela redução gradual do diâmetro hidrodinâmico e PdI. Resultados semelhantes foram obtidos se o procedimento de dispersão foram realizado usando uma sonda de ultra-som em vez disso. Em geral, um estado mais estável e homogêneo de aglomeração foi conseguido usando a sonda, como confirmado pela DLS e TEM dados. Curiosamente, banho ultra-sônico provado para ser uma opção melhor do que o uso de uma sonda, como uma granulometria média muito menor e muito maior zeta potencial valor pode ser conseguido usando um banho ao invés de uma sonda. Observa-se que, em ambos os procedimentos sonication, as micrografias TEM confirmaram a presença de diferentes partículas primárias para incluir: esferas, cubos e polyhedrons.
Figura 7. Tamanho distribuição obtida com centrifugação de disco para (A) CeO2_powder e (B) ZnO NM110_powder dispersão em água a 0 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Imagens de temperatura do CeO2 demonstrando o impacto da sonication na amostra homogeniety e estabilidade. Barra de escala é 100 nm para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No caso de ZnO, dois tipos de ZnO são usados nas dispersões ou seja, ZnO nanomateriais de diferentes perfis de superfície, (NM110) hidrofílico e hidrofóbico (NM111). Os resultados indicam conclusões semelhantes entre os dois tipos de ZnO. Ambos mostram que com nenhum sonication, a qualidade de dispersão indicou um tamanho médio de partículas grandes e alta polidispersividade. NM110 tem uma Z-média de 1.410 ± 120 nm e PdI de 0.786 ± 0.150 nm; NM111 tem uma Z-média de 758 ± 86 nm e PdI de 0.823 ± 0,006. Dados de distribuição de tamanho obtidos para NM110 de centrifugação de disco também confirmam a amostra polidispersividade e homogeneidade (Figura 7b). O tamanho e polidispersividade do NM110 lisados parecem diminuir com tratamento de 15 min em banho ultra-sônico e atingir um patamar ideal de redução no tempo de 30 min sonication. Um tempo mais sonication mostra um aumento geral nos dados de tamanho de partícula, potencialmente devido a partícula re-aglomerar depois de ser aglomeradas inicialmente. Por outro lado, NM110 mostra uma dispersão homogénea e estável após 2 min de tratamento ultra-sônico sonda. No entanto, mais ciclos de 6 min e 10 min também mostram um aumento no tamanho de partícula e PdI valores, indicando a aglomeração das partículas. Temperatura (Figura 9 e Figura 10) e UV-vis (Figura 3b–c) resultados ainda mais confirmaram o estado de tal qualidade de dispersão. Curiosamente, observam-se resultados muito semelhantes, no caso de NM111, quando tratados com uma sonda ultrassônica. Novamente, a abordagem sistemática indica que a melhor dispersão foi alcançada em 2 min, como possível re-aglomeração pode estar associado a casos de 6 min e 10 min correspondentes. Quando um banho ultra-sônico foi usado em vez disso, o tamanho de partícula de dispersão alcançado um platô após 30 min de sonication; observa-se depois que não mais aumentar ou diminuir de tamanho ou polidispersividade valores. Além disso, micrografias de temperatura obtidas para o NM111 hidrofóbico indicam a presença de vários artefatos e outros efeitos de secagem sobre a grade de temperatura (Figura 10). Isto mostra que pre-umectante com álcool ou outros solventes orgânicos pode ser úteis para a preparação de dispersões aquosas mas houve desafios sobre imobilizando nanomaterial hidrofóbico amostras nas grades carbono. Em geral, se um protocolo de dispersão ideal é identificado e esta rege-se pelo valor menor correspondente PDI, então isso corresponde a ZnO_NM110_B1 h e min ZnO_Nm111_B30 para o NM110 hidrofílico e hidrofóbico NM 111 casos, respectivamente.
Figura 9. Imagens TEM do ZnO NM110 demonstrando o impacto da sonication na amostra homogeniety e estabilidade. Barra de escala é 100 nm para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Imagens TEM do ZnO NM111 demonstrando o impacto da sonication na amostra homogeniety e estabilidade. Barra de escala é 0.1 µm para min ZnO_NM111_B_15, h ZnO_NM111_B_1 e ZnO_NM111_P_2 min e 0,2 µm para o resto das amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No caso dos nanotubos de carbono (CNTs), os resultados mostram que tais nanomateriais não são facilmente dispersíveis em água, em particular que o protocolo de dispersão envolve o uso de física vigorosa ou agitação tremendo. Isto é verdadeiro para ambos os nanotubos de carbono de paredes multi (MWCNTs) utilizados neste estudo. Micrografias de temperatura no caso para dispersões tanto A106 e A32, realizada em 2 min e 15 min do ciclo sonication são mostradas na Figura 11 e Figura 12, respectivamente. Base o crescente tempo sonication, os resultados indicam quebra da CNTs, muitas vezes resultando em modificações de comprimento. Tais modificações de comprimento foram evidentes no caso tanto a sonda e sonication ultra-sônico. Os resultados mostram que a A106 e A32 CNTs podem ser suficientemente dispersos após um tratamento de 2 min se uma sonda de ultra-som é usada. Aqui a dispersão suficiente significa o limite de tempo crítico sonication onde todos os pacotes de nanotubo (CNT) de carbono estão abertos e tubos individuais são separados35. Ao aumentar o tempo de sonication para min 6 ou 10 min, os resultados indicam uma modificação da distribuição de comprimento e muito polidispersividade superior. Finalmente, a intensidade distribuído de dados de tamanho de DLS (Figura 6a–.b) e os espectros de absorção através de UV-vis (figura 4a–b) também confirmam que as dispersões CNT são sensíveis ao tempo sonication e se uma sonda ou um banho tem sido utilizado. Tanto A106 e A32 CNTs mostram um pico de absorbância entre 253 e 310 nm, o que é típico de MWCNTs36. Pico de intensidade é conhecido por ser um bom indicador da dispersão atingível máxima em dispersão de MWCNTs sonication-conduzido. O espectro UV de A106 e A32 indica 2 min e 15 min de sonication ciclo para ser ideal para a suspensão. Após prolongada sonication, o pico amplia-se com menor intensidade de pico, bem como destruição de amostra indicada pela mudança no espectro de absorbância e a distorção espectral (formação de ombros de pico).
Figura 11. Imagens TEM da A106 CNTs demonstrando o impacto da sonication na amostra homogeniety e estabilidade. Barra de escala é 200 nm para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12. Imagens de temperatura da A32 a CNTs demonstrando o impacto da sonication na amostra homogeniety e estabilidade. Barra de escala é 200 nm para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, para ter algum grau de comparações, os dados são comparados a uma suspensão comercialmente disponível de citrato estabilizado Ag NPs (diâmetro nominal de 10 nm, 0,02 mg/mL). Caracterização de dados mostram que a dispersão é altamente aglomerada e altamente polydisperse. DLS dados mostram uma distribuição multimodal com um diâmetro hidrodinâmico de 72 ± 50 nm e um PdI alta de 0,46 ± 0,26 (Figura 6C). Análise morfológica por temperatura (Figura 13) e o pico de ressonância de Plasmon de superfície (SPR) largura (absorção em 418 nm na região visível) por UV-vis (Figura 4C) mais confirmar uma amostra altamente polydisperse. Curiosamente, o tratamento de banho de ultra-sons melhora a estabilidade da dispersão e PdI, mas somente se um sonication suficientemente longo período de tempo é usado; um tempo de sonication h 2 é necessário para resultar em tamanho de partícula DLS de 28 ± 5 nm e PdI 0,387 ± 0,015 (tabela 1). No entanto, se uma sonda de ultra-som é usada em vez disso, a amostra homogeneidade e estabilidade notavelmente melhoram em apenas 2 min tempo de sonication, resultando assim em tamanho de partícula DLS de 29 ± 1 nm, PdI de 0.300 ± 0.025 e ZP-42 ± 3 mV. Esta melhoria na qualidade de dispersão é também evidente até um ambiente de tempo de 10 min sonication, no qual um tamanho de partícula DLS de 25 ± 2 nm ± PdI 0.251 0.011 e ZP-47.3 ± 1.4 mV é observado. Aqui, a 10 min de sonication usando tweeter de frasco, o PdI diminui e aumenta a ZP. As micrografias TEM correspondentes em tais pontos respectivos tempo também confirmam homogeneidade da amostra melhorada após os protocolos sonication adequadas são aplicados. Há uma rápida melhoria na homogeneidade da amostra e dispersity de partículas nas imagens TEM. A amostra 2 min mostra alguma aglomeração em comparação com as partículas individuais lisados por 10 min usando o tweeter do frasco.
Figura 13. Imagens TEM do NPs Ag comercial, demonstrando o impacto da sonication na amostra homogeniety e estabilidade. Barra de escala é 200 nm para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alta (mL) | Baixa (mL) |
| 1.4 | 0.2 |
| 1.2 | 0.4 |
| 1 | 0.6 |
| 0.8 | 0.8 |
| 0.6 | 1 |
| 0.4 | 1.2 |
| 0.2 | 1.4 |
| 0 | 1.6 |
Tabela 1. Gradiente de densidade de sacarose para o volume total de 1,6 mL de mistura. Aqui, nós marcamos a solução de sacarose de 8% como solução de sacarose de baixo e 24% mais alto. Eles são misturados nos seguintes volumes (volume total 1,6 mL cada vez) e injetados o cone dis um por um até um gradiente é formado.
Discussion
O objetivo do estudo é desenvolver uma estratégia que permita a identificação das condições optimal sonication tornar dispersões de um número selecionado de nanomateriais em água. Aqui é feita uma tentativa de documentar cuidadosamente os passos do protocolo e parâmetros durante sonication para preencher as lacunas identificadas anteriormente em comentários, bem como para seguir as recomendações feitas nos últimos15. As condições de dispersão ideal são identificadas caracterizando as dispersões após cada ciclo de sonication e verificando a uniformidade e estabilidade da amostra. O impacto dos procedimentos sonication e status de estabilidade é avaliado baseia as características alterações na chaves propriedades físico-químicas dos nanomateriais, conforme determinado por várias técnicas analíticas: DLS, ELS, UV-vis e TEM. O protocolo atual é uma metodologia adaptada para dispersão de nanomateriais de literatura da passado e outras pesquisas projetos21,22,37,38,39 com alguns modificações e aperfeiçoamentos, abordando as principais lacunas, passos e sua aplicabilidade aos nanomateriais mais amplas da superfície semelhante perfil7. No entanto, cuidadosos ajustes são necessários em relação ao seu tempo sonication, força e tipo para sua aplicação em outras nanomateriais. Também, mais trabalho é necessário para estabelecer uma correlação entre o procedimento sonication e atividade biológica dos nanomateriais. Seis diferentes tipos de dispersões de nanomateriais são avaliados e comparados, principalmente por sua estabilidade, usando banho de ultra-sons e uma sonda ultrassônica, equipado com um tweeter de frasco em pontos de tempo definido. Para manter a pureza de suspensão e quaisquer alterações não intencionais causadas devido a contaminação, a sonda sonication é evitada aqui. No tweeter de frasco, os frascos podem manter fechados. Isto elimina qualquer contaminação cruzada das amostras.
Calibração de sonicators é um factor-chave desde que uma gama de sonicators estão disponíveis com poderes, amplitude e frequências diferentes. Para determinar a energia acústica eficaz entregada à suspensão, calibração de sonicators é realizada utilizando calorimetria. A potência acústica entregues para configuração de amplitude de 70% para o tweeter de frasco, assim como para a configuração de banho ultra-sônico de 100% é calculado para ser < 1 W (0,75 ± 0,04 W e 0.093 ± 0,04 W, respectivamente). No entanto, as saídas de poder indicaram pelos fabricantes para tweeter de frasco e sonicador de banho são 200 W e 80 W, respectivamente. Isso indica que, apesar da fonte de alta potência, maior parte da energia é perdida durante a geração de bolhas cavitacional e apenas uma pequena fração é efectivamente entregue para a dispersão sob tratamento26. Estudos recentes salientaram a importância do controle de medição cavitacional em comparação com a potência de entrada do sonicador para um melhor controle de dispersão durante sonication8. A metodologia parece promissor para dispersão controlada de nanomateriais altamente delicados como CNTs e é recomendada para estudos futuros.
Cada técnica utilizada no estudo baseia-se em princípios diferentes, com limitações a todos. DLS não é uma técnica ideal para suspensões não-esférica, bem como altamente polydisperse sistemas. Em tais condições, DCS é recomendado devido à alta resolução, exatidão e precisão40. DCS pode separar completamente a picos de distribuição de tamanho muito estreita que diferem por apenas 3%. TEM fornece imagens visuais diretas das nanopartículas e é uma ótima ferramenta para a determinação de agregação, dispersão, tamanho e forma das partículas, mas a técnica requer amostra de secagem que pode conduzir a artefatos41. Isto pode ser eliminado lavando as grades com água ultrapura, conforme discutido na etapa 4.5.3.
Entre outros, a metodologia destaca alguns passos críticos tais como o tipo de frascos usados no protocolo, profundidade de imersão e posição dos frascos em banho de ultra-sons, bem como o tweeter do frasco. Controle de temperatura do sistema durante a agitação é um parâmetro importante. Mudanças de água frequentes no banho de ultra-sons e modo pulsado executar no caso de tweeter de frasco são recomendadas para evitar qualquer acumulação de calor durante sonication, evitando assim qualquer alteração de amostra. A etapa de pré-umectante para amostras hidrofóbicas, tais como o óxido de zinco ajuda na dispersão de partículas, mas isto pode induzir algumas alterações indesejadas. O sonication tempo e energia devem ser altos o suficiente para o aglomerado de partículas mas não muito que ele quebra as partículas. Os resultados indicam que o aglomerado de ruptura é dependente do tipo de partícula.
Nossas descobertas destacam a importância de ter um protocolo detalhado de dispersão, como resultados mostram que as principais propriedades físico-químicas potencialmente podem ser alteradas durante o processo de sonication, como governada por fatores como o tipo do sonicador, duração sonication tempo e potência de saída. Os resultados mostraram que a integridade da amostra potencialmente fica comprometida a agitação de intensidade mais elevada. Resultados mostram que a CNTs são muito sensíveis à agitação, então rupturas são altamente prováveis de ocorrer quando sonication duração e força são alteradas. Perto de configurações ideais para dispersão de CNTs são entre 2-15 min no banho de ultra-sons e apenas 2 min usando a sonda ultrassônica. No entanto, o ultrasonication ainda pode ter causado um nanotubo encurtamentos, que não podem ser quantificados com precisão aqui. DLS não pode ser uma técnica ideal para a caracterização da CNTs, mas ainda pode fornecer diâmetro hidrodinâmico para nanotubos e esses dados poderiam ser informativos das diferenças nas distribuições de comprimento de CNTs entre várias amostras de16, 42,43. Últimos estudos demonstram que o protocolo de dispersão de CNTs pode ser bastante reforçado pela adição de surfactantes como as moléculas de surfactante são absorvidas em monocamada o nanotubo, fornecendo assim uma barreira à quebra devido sonication35, 44. no entanto, isto não pode ser comparado diretamente ao presente protocolo como surfactantes não estão envolvidos neste caso. É importante notar que garantindo a distribuição de tamanho de comprimento no caso de CNTs é muito importante, como a relação de aspecto muitas vezes está correlacionada com certa resposta toxicológica. Em contraste, o CeO2 deu resultados diferentes em comparação com as CNTs, na qual sonication prolongada vezes usando banho de ultra-sons ou sonda, levar à formação de partículas primárias. A diferença de resultados entre a CNT e CeO2 casos destaca a importância de alfaiate dispersão protocolos, por exemplo, otimizar o tempo de sonication e potência de saída, de acordo com o material começar ou seja, tipo de pós nanomaterial. Cada tipo de amostra de pó nanomaterial é diferente, como haverá diferentes graus de aglomeração dentro o pó em si. Em certos casos, o processo de aglomeração com sucesso resultou na aglomeração de até nível de partículas primárias, como é evidente pelo aparecimento de outras partículas em forma nas imagens TEM, que não era visível antes da etapa de sonication. A prolongada sonication resultou na contínua quebra de aglomerados de óxido de cério em ângulos diferentes, conduzindo assim a partículas multi-facetada.
No caso comercialmente comprou amostra aquosa de dispersões Ag NPs, nossas descobertas também enfatizam a necessidade de avaliação de uniformidade e estabilidade de longo prazo. Há uma necessidade de assegurar que as dispersões foram suficientemente caracterizadas antes de usar, especialmente em casos de armazenamento a longo prazo. No entanto, nanomateriais têm uma vida útil muito curta. Eles idade com o tempo e podem se comportar diferentemente depois de armazenamento a longo prazo em comparação com uma dispersão preparado na hora.
Os resultados aqui destacam a necessidade de uma estratégia harmonizada identificar um protocolo otimizado para diferentes nanomateriais. A estratégia proposta apresentada é para realizar diferentes variações no método sonication e certifique-se de que as dispersões em pontos diferentes do tempo são suficientemente caracterizadas usando métodos analíticos complementares. A importância da utilização de uma abordagem multi-métoda para caracterizar e monitorar a qualidade de dispersão através do tempo e em diferentes condições experimentais tem sido destacada pelos últimos trabalhadores45. Apesar de vários métodos para sonication foram apresentados para abastecer a dispersão do nanomaterial específico no estudo, potencialmente eles podem ser usados como base para dispersar outros nanomateriais de óxido de metal e metal (de propriedades de superfície semelhantes) em água. No entanto, ter qualquer mudança em qualquer nanomaterial tipo ou líquido médio requer a necessidade de otimizar o protocolo básico, que pode ser feito pelo ajuste cuidadoso de vários fatores , por exemplo, tempo sonication, força e tipo sonicador. O protocolo é escolhido e identificado como ideal, lá é sempre uma necessidade de ter um relatório pormenorizado sobre o esquema e a sequência de passo a passo do processo de dispersão sonication. Isto é importante para melhorar a interpretabilidade e comparabilidade. Uma das aplicações do presente protocolo é facilitar a comparabilidade dos dados entre outros laboratórios, levando a uma abordagem harmonizada e padronizada para futuros estudos. Os parâmetros de controle e metodologia atuais podem ser utilizados para outras mídias dispersão além de água e comparações podem ser desenhadas em uma base caso a caso.
Disclosures
Os autores não têm nenhum interesse financeiro concorrente. IK EVJ conjuntamente concebido o estudo com o design do IK, realizados os experimentos, analisaram dados e preparado o manuscrito. LJE IR realizadas e a imagem TEM. SA, MLM e MC fornecido as CNTs, e resto dos co-autores discutiu e comentou sobre o manuscrito, em todas as fases e RT contribuído para a edição do manuscrito.
Acknowledgments
A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento do NE/J010783/1. O projeto NanoValid tem recebido financiamento do programa de sétimo da União Europeia para a investigação, desenvolvimento tecnológico e demonstração sob concessão acordo n. º 263147.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium oxide nanopowder | Sigma-Aldrich | 544841 | <25 nm particle size (BET) |
| Zinc oxide | European Commission's Joint Research Centre (JRC) | NM110 | hydrophylic |
| Zinc oxide | European Commission's Joint Research Centre (JRC) | NM111 | hydrophobic |
| Multi walled carbon nanotubes | NanoMile project (Large Collaborative Project under the European Commission's 7th Framework Programme) | A32 (MWCNT1) | 3.0±1.8 µm long, O/C ratio of 4.5% |
| Multi walledcarbon nanotubes | NanoMile project | A106 (MWCNT2) | 3.3±2.4 µm long, O/C ratio of 7% |
| Silver dispersion | Sigma-Aldrich | 730785 | 10 nm particle size (TEM), 0.02 mg/mL |
| Zetasizer nano | Malvern Instruments | Particle size and zeta-potential measurements | |
| Disc Centrifuge | CPS instruments Inc. | Model DC 24000 | Particle size distribution by centrifugal sedimentation |
| Transmission electron microscope | JEOL USA | Jeol 1200EX TEM | Bright field images, particle size, shape, agglomeration |
| Ultrasonic probe fitted with a vial tweeter | Hielscher | UIS250V | Sonicator |
| Ultrasonic bath | Branson | Model 1510 | Sonicator |
| Eppendorf vials | Eppendorf | 2236411-1 | 1.5ml capacity |
| UV-vis spectrophotometer | Jenson flight deck | Model 6800 | SPR peaks, suspension stability |
| Disposable folded capillary cell | Malvern Instruments | DTS 1070 | for the measurement of elecr |
| Zeta- potential standard | Malvern Instruments | DTS 1235 | |
| Quartz cuvette | Jasco | 1103-0042 | Rectangular quartz cell 10 x 100 Spectrosil Quartz with lid 190 -2700 nm |
References
- Yin, L., Wang, Y., Pang, G., Koltypin, Y., Gedanken, A. Sonochemical Synthesis of Cerium Oxide Nanoparticles-Effect of Additives and Quantum Size Effect. J Colloid Interface Sci. 246 (1), 78-84 (2002).
- Mandzy, N., Grulke, E., Druffel, T. Breakage of TiO2 agglomerates in electrostatically stabilized aqueous dispersions. Powder Technol. 160, (2005).
- Nickel, C., et al. Dynamic light-scattering measurement comparability of nanomaterial suspensions. J Nanopart Res. 16 (2), 12 (2014).
- Ray, T. R., Lettiere, B., de Rutte, J., Pennathur, S. Quantitative Characterization of the Colloidal Stability of Metallic Nanoparticles Using UV-vis Absorbance Spectroscopy. Langmuir. 31 (12), 3577-3586 (2015).
- Jiang, J., Oberdöster, G., Biswas, P. Characterization of size, surface charge, and agglomeration state of nanoparticle dispersions for toxicological studies. J Nanopart Res. 11, (2009).
- Wu, W., et al. Dispersion Method for Safety Research on Manufactured Nanomaterials. Industrial Health. 52 (1), 54-65 (2014).
- Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - issues and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
- Sesis, A., et al. Influence of Acoustic Cavitation on the Controlled Ultrasonic Dispersion of Carbon Nanotubes. J Phys Chem B. 117 (48), 15141-15150 (2013).
- Farré, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barceló, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Anal Bioanal Chem. 393 (1), 81-95 (2009).
- Mandzy, N., Grulke, E., Druffel, T. Breakage of TiO2 agglomerates in electrostatically stabilized aqueous dispersions. Powder Technol. 160 (2), 121-126 (2005).
- Meißner, T., Oelschlägel, K., Potthoff, A. Dispersion of nanomaterials used in toxicological studies: a comparison of sonication approaches demonstrated on TiO2 P25. J Nanopart Res. 16 (2), 1-13 (2014).
- Cronholm, P., et al. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique. Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).
- Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle Fibre Toxicol. 5 (1), 1-14 (2008).
- Hartmann, N. B., et al. Techniques and Protocols for Dispersing Nanoparticle Powders in Aqueous Media-Is there a Rationale for Harmonization? J Toxicol Environ Health, B. 18 (6), 299-326 (2015).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to in vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicol Sci. 101, (2008).
- Hunter, R. J. Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications. , Academic Press. (1981).
- Lyklema, J. Fundamentals of Interface and Colloid Science. , (1991).
- Sikora, A., et al. A systematic comparison of different techniques to determine the zeta potential of silica nanoparticles in biological medium. Analytical Methods. 7 (23), 9835-9843 (2015).
- Lamberty, A., et al. Interlaboratory comparison for the measurement of particle size and zeta potential of silica nanoparticles in an aqueous suspension DISCUSSION. J Nanopart Res. 13 (12), 7317-7329 (2011).
- Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Weisner, M. R. NIST Special Publication. Vol. 1200-1. , U.S. Department of Commerce/National Institute of Standards and Technology. Washington D.C. (2012).
- Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Weisner, M. R. NIST Special Publication. Vol. 1200-2. , U.S. Department of Commerce/National Institute of Standards and Technology. Washington D.C. (2012).
- Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Weisner, M. R. NIST Special Publication. Vol. 1200-3. , U.S. Department of Commerce/National Institute of Standards and Technology. Washington D.C. (2012).
- Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. A standardised approach for the dispersion of titanium dioxide nanoparticles in biological media. Nanotoxicol. 7 (4), 389-401 (2013).
- NanoValid. www.nanovalid.eu. , Available from: http://www.nanovalid.eu (2017).
- Yamaguchi, K. -i, Matsumoto, T., Kuwata, K. Proper calibration of ultrasonic power enabled the quantitative analysis of the ultrasonication-induced amyloid formation process. Protein Sci. 21 (1), 38-49 (2012).
- Maxit, B. Particle size measurements of dark and concentrated dispersions by dynamic light scattering. , (2010).
- Darlington, T. K., Neigh, A. M., Spencer, M. T., Guyen, O. T. N., Oldenburg, S. J. Nanoparticle characteristics affecting environmental fate and transport through soil. Environ Toxicol Chem. 28 (6), 1191-1199 (2009).
- Mejia, J., Lucas, S. Protocol for the particle determination of a given MNM by the centrifuge liquid sedimentation (CLS) technique. , (2015).
- Jenway. Model 6305 Spectrophotometer. , (2014).
- Michen, B., et al. Avoiding drying-artifacts in transmission electron microscopy: Characterizing the size and colloidal state of nanoparticles. Sci Rep. 5, 9793 (2015).
- Contamine, R. F., Wilhelm, A. M., Berlan, J., Delmas, H. Power measurement in sonochemistry. Ultrason Sonochem. 2 (1), S43-S47 (1995).
- Kimura, T., et al. Standardization of ultrasonic power for sonochemical reaction. Ultrason Sonochem. 3 (3), S157-S161 (1996).
- Raso, J., Mañas, P., Pagán, R., Sala, F. J. Influence of different factors on the output power transferred into medium by ultrasound. Ultrason Sonochem. 5 (4), 157-162 (1999).
- Matarredona, O., et al. Dispersion of Single-Walled Carbon Nanotubes in Aqueous Solutions of the Anionic Surfactant NaDDBS. J Phys Chem B. 107 (48), 13357-13367 (2003).
- Jiang, L., Gao, L., Sun, J. Production of aqueous colloidal dispersions of carbon nanotubes. J Colloid Interface Sci. 260 (1), 89-94 (2003).
- Jensen, K. A., Kembouche, Y., Christiansen, E., Jacobsen, N. R., Wallin, H., Guiot, C., Spalla, O., Witschger, O. The generic NANOGENOTOX dispersion protocol-Standard operation procedure (SOP). , 32 (2011).
- Jacobsen, N. R., Pojano, G., Wallin, H., Jensen, K. A. Nanomaterial dispersion protocol for toxicological studies in ENPRA. Internal ENPRA Project Report. , National Research Centre for the Working Environment. Copenhagen, Denmark. (2010).
- PROSPEcT. Protocol for nanoparticle dispersion. , (2010).
- CPS Instruments, E. urope Introduction to Differential Sedimentation. , Netherlands. Available from: http://www.cpsinstruments.eu/pdf/Introduction%20Differential%20Sedimentation.pdf (2007).
- Mavrocordatos, D., Pronk, W., Boller, M. Analysis of environmental particles by atomic force microscopy, scanning and transmission electron microscopy. Water Sci Technol. 50 (12), 9-18 (2004).
- Moon, Y. K., Lee, J., Lee, J. K., Kim, T. K., Kim, S. H. Synthesis of Length-Controlled Aerosol Carbon Nanotubes and Their Dispersion Stability in Aqueous Solution. Langmuir. 25 (3), 1739-1743 (2009).
- Cheng, X., et al. Characterization of Multiwalled Carbon Nanotubes Dispersing in Water and Association with Biological Effects. J Nanomat. 2011, 12 (2011).
- Dassios, K. G., et al. Optimization of Sonication Parameters for Homogeneous Surfactant-Assisted Dispersion of Multiwalled Carbon Nanotubes in Aqueous Solutions. J Phys Chem C. 119 (13), 7506-7516 (2015).
- Domingos, R. F., et al. Characterizing Manufactured Nanoparticles in the Environment: Multimethod Determination of Particle Sizes. Environ Sci Technol. 43 (19), 7277-7284 (2009).
