La rétine humaine est composée de régions fonctionnellement et moléculairement distinctes, y compris la fovéa, la macula et la rétine périphérique. Nous décrivons ici une méthode à l’aide de biopsies punch et élimination manuelle des couches de tissu d’un œil humain de disséquer et recueillir ces régions rétiniennes distinctes pour l’analyse protéomique en aval.
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Article de méthode
Dissection de la rétine humaine et pre-choroïde pour l’analyse protéomique
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La rétine humaine se compose de la neuroretina sensorielle et le sous-jacent épithélium pigmentaire rétinien (RPE), qui est fermement complexé à la couche choroïde vasculaire. Différentes régions de la rétine sont anatomiquement et moléculairement distinctes, faciliter les fonctions uniques et montrant la différence de susceptibilité à la maladie. Analyse protéomique de chacune de ces régions et couches peut fournir des informations vitales dans le processus moléculaire de nombreuses maladies, notamment la dégénérescence maculaire de l’Age (DMLA), diabète sucré et le glaucome. Toutefois, la séparation des régions rétiniennes et des couches est essentielle avant l’analyse protéomique quantitative peut être effectuée. Nous décrivons ici une méthode de dissection et collection des régions rétiniens fovéale, maculaires et périphériques et sous-jacent pre-choroïde complexe, impliquant des biopsies punch régional et élimination manuelle des couches de tissus de l’oeil humain. Unidimensionnel SDS-PAGE, mais aussi l’analyse protéomique en aval, comme la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS), peut servir à identifier les protéines dans chaque couche rétinienne disséqué, révélant des biomarqueurs moléculaires de la maladie de la rétine.
Introduction
La rétine, RPE et choroïde sont des tissus complexes qui démontrent des différences régionales importantes dans l’expression de la protéine, une fonction physiologique et pathologique de susceptibilités1,2. Par exemple, les maladies comme la dégénérescence maculaire de l’Age (DMLA), rétinite pigmentaire et Rétinopathie séreuse centrale chaque démontrent localisation caractéristique dans la fovéa, macula ou rétine périphérie1,3, 4,6. Nous présentons ici une méthode démontrant comment distincte rétinienne régions peuvent être dégustées de façon indépendante. L’objectif général de cette méthode est de fournir un guide fiable pour la collecte des échantillons de tissu des centrale, maculaires et les zones périphériques de la rétine humaine et pre-choroïde pour l’analyse protéomique. La raison d’être pour le développement et l’utilisation de cette technique est que par le biais de l’analyse protéomique de ces régions rétiniennes spécifiques, importantes aperçus moléculaires peuvent être acquise dans les fonctions physiologiques et physiopathologiques de ces régions.
Cette approche promet de révéler le fondement de la protéomique de susceptibilités de maladie régionale relative et pour faciliter l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques. En effet, enquêtes de protéomique du corps vitré et ses interactions avec la rétine ont permis de mieux comprendre clés la composition moléculaire et la fonction des tissus sains et malades5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Toutefois, les analyses protéomique comparative claire des régions distinctes de rétiniens manquent. La technique vous aidera à soutenir ces études indispensables, offrant des avantages par rapport aux autres méthodes en présentant une collection tissus fiables et reproductibles. Plus encore, l’approche est très accessible, profitant du poinçon de taille standard et facilement accessibles des tissus outils de biopsie. Notre technique met l’accent sur la collection appropriée et le stockage des tissus pour la protéomique traitement, faire des considérations importantes pour la stabilité des protéines et de la dégradation. Ainsi, cette méthode est plus appropriée pour les enquêteurs, considérant en aval analyse moléculaire des facteurs de la protéomique.
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Protocole
cette étude a été approuvée par l’Université de l’Iowa ' s Institutional Review Board et adhère aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki.
1. Foveal et maculaire Punch biopsie
- ouvert et butterfly l’oeil de l’homme, telle qu’elle se compose de 4 volets distincts du tissu, comme décrit dans une publication précédente. 5
- en commençant par un œil humain papillon placé dans une boîte de Pétri, centrez un outil de biopsie de poinçon de 4 mm sur la fovéa, appuyez vers le bas et rouler doucement jusqu'à ce qu’une incision est faite autour de la fovéa.
- Générer ensuite une incision autour de la macula de centrage et enfonçant un outil de biopsie de poinçon de peau de 8 mm dans les arcades de la macula, exerçant une pression modérée et rouler. Cela produira un deuxième anneau externe du tissu qui entoure le premier.
2. Punch de biopsie rétinienne périphérique
outil biopsie- utiliser le poinçon de 4 mm peau de faire une série de coups de poing dans la rétine périphérique, juste à l’extérieur de l’arcade. Ici, faire deux coups de poing pour chaque volet du quadrant.
Remarque : Après tous les coups sont faits, l’oeil aura deux poinçons concentriques dans le centre, ce qui représente la fovéa et la macula, et deux poinçons à la base de chaque rabat-totalisant 8 perce dans la rétine périphérique.
3. Fovéa et Macula biopsie Collection
- comme le tissu est maintenant prêt pour la collecte, recueillir toutes les biopsies de tissus dans des microtubes distinct et congeler à l’aide d’azote liquide pour le traitement en aval. Conserver tous les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Utilisez une pince courbe de Colibri 0,12 pour saisir les bords du tissu translucide de la fovéa rétinienne. Collecter, élever et séparer les tissus fovéale de la pre-choroïde sous-jacente.
- De même, utiliser la pince Colibri 0,12 à saisir la bague extérieure du tissu translucide macula. Si le tissu est encore attaché au tissu adjacent ou sous-jacent, utiliser une paire de ciseaux Westcott pour couper avec précaution le bord, capturant le composant rétiniens et dissection de loin n’importe quel tissu de nerf optique inclus dans le punch.
4. Collection de rétine périphérique
- utiliser la pince courbée de Colibri 0,12 pour séparer doucement les disques du périphérique de tissu rétinien de la pre-choroïde sous-jacente et dans des microtubes individuels.
- En cas de gel vitréen résiduel, utiliser la pince pour soulever et séparer le gel là autant que possible avant le prélèvement du tissu rétinien. Après avoir retiré la rétine, la choroïde-RPE pigmentée demeure au-dessous de.
5. Fovéale et Macula pre-choroïde Collection
- pince Colibri utilisation la 0,12 à saisir les bords du tissu pre-choroïde sombre qui se trouve sous la zone de la fovéa supprimée. Séparez avec précaution ce tissu de la sclérotique et la collect.
- à l’aide de la pince même, saisissez les bords de l’anneau externe du tissu de pre-choroïde sombre qui sous-tendent la zone maculaire supprimée. Séparez avec précaution ce tissu de la sclère en saisissant les bords en différents points autour de l’anneau et en tirant légèrement. Finalement, l’anneau de pre-choroïde tissu va être délogé et peuvent être obtenu.
NOTE : Secondaire pince dans la main opposée peut être utiles pour manipuler le tissu pre-choroïde au moment du retrait. Comme le tissu rétinien, Wescott ciseaux peut être utilisé pour faciliter le retrait de tous les tissus qui n’était pas entièrement incisés à l’aide de l’outil de perforation.
6. Collection de pre-choroïde rétine périphérique
- utiliser la pince Colibri 0,12 à se pour décoller de la pre-choroïde dans les zones périphériques poinçon 8.
- Comme auparavant, placez le tissu pre-choroïde dans des microtubes et congeler à l’aide d’azote liquide pour le traitement en aval. Conserver tous les échantillons à-80 ° C jusqu'à utilisation.
7. Ciseaux de Dissection
Remarque : si la lame de biopsie de poinçon est terne ou l’outil de biopsie de punch n’est pas poussé assez dur, il peut être pas un le tissu environnant épuré.
- Dans ces cas, le tissu écarter autant que possible, puis utilisez les ciseaux Westcott pour couper et séparer.
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Résultats
Rétinienne et tissu pre-choroïde peuvent être traitées de différentes façons pour répondre à une enquête individuelle. Après le prélèvement, le chercheur possédera des échantillons de la rétine et pre-choroïde du tissu la région fovéale, extérieur macula et rétine périphérique (Figure 1). Plus précisément, le poinçon de la région centrale comprendra la fovéa, le parafovea et une petite quantité de la perifovea adjacent. Le poinçon maculaire englobe le reste d...
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Discussion
Après le tissu manipulation des échantillons, de collecte et de traitement sont des considérations essentielles14. Conservation dans l’azote liquide est préférable à une fixation chimique, car ce dernier peut causer des dommages à la structure des protéines, qui puisse fausser l’analyse en aval. En outre, préservation de l’azote liquide est préférable aux méthodes qui n’impliquent pas la congélation des échantillons. Notamment, Ferrer et coll. ont montré des différences significatives dan...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Remerciements
VBM est soutenue par des subventions de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 et R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 et la recherche pour prévenir la cécité (RPB), New York, NY. MT et GV sont pris en charge par les NIH grant T32GM007337.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Outil de biopsie cutanée à l’emporte-pièce de 4 mm | Miltex | REF 33-34 | |
| Outil de biopsie cutanée à l’emporte-pièce de 8 mm | Miltex | REF 33-37 | |
| 0,12 Pince | Colibri Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Ciseaux Wescott | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Tubes à microfuge | Eppendorf | #022364111 | 1,5 mL |
| Azote liquide | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Références
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Réimpressions et autorisations
