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Article de méthode

Évaluation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de cellules endothéliales à l’aide de la Culture cellulaire 3D et sang total Non-anticoagulant

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DOI :

10.3791/56227

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5 septembre 2017

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1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un modèle in vitro qui permet l’étude et l’analyse de la coagulation dans le sang entier, de non anticoagulé. Anticoagulation dans le système dépend de l’effet anticoagulant naturel des cellules endothéliales saines et activation des cellules endothéliales se traduira par la coagulation.

Résumé

In vivo, les cellules endothéliales sont primordiales pour l’anticoagulation naturelle du sang circulant. Par conséquent, activation des cellules endothéliales entraîne la coagulation du sang. Ce phénomène est observé dans de nombreuses situations cliniques, comme la transplantation d’organes en présence d’anticorps d’anti-donneurs préformés, y compris la xénotransplantation, ainsi que dans la lésion d’ischémie/reperfusion. Afin de réduire l’expérimentation animale selon les 3R normes (remplacement, réduction et raffinement), in vitro modèles pour étudier l’effet des cellules endothéliales activation sur la coagulation du sang serait hautement souhaitable. Cependant, des systèmes de culture de cellules endothéliales à plat communs fournissent un rapport surface-volume 1-5 cm2 de l’endothélium par millilitre de sang, ce qui n’est pas suffisant pour traitement anticoagulant naturel, endothéliale induite. Mise en culture des cellules endothéliales avec des microporteurs perles peut accroître le ratio de surface-volume de 40 à 160 cm2/ml. Cet augmentation du rapport est suffisant pour assurer l’anticoagulation « naturelle » de sang, afin que l’utilisation des anticoagulants peut être évitée. Ici un in vitro avec des microporteurs système est décrit pour étudier les effets de la modification génétique de cellules endothéliales porcines sur la coagulation du sang entier, non anticoagulé. Dans l’essai décrit, principales cellules endothéliales aortiques porcines, soit type sauvage (WT) ou transgéniques pour humain CD46 thrombomoduline et ont été cultivées avec des microporteurs perles puis exposés au sang humain non-anticoagulé fraîchement tiré. Ce modèle permet la mesure et la quantification des cytokines comme activation marqueurs de complément et de la coagulation dans le plasma sanguin. En outre, l’imagerie de cellules endothéliales activées et des dépôts d’immunoglobulines, complément - et la coagulation des protéines sur les perles d’endothelialized ont été réalisées par microscopie confocale. Ce test permet également de tester des médicaments qui sont censés pour prévenir la coagulation et, par conséquent, activation des cellules endothéliales. Sur le dessus de son potentiel de réduire le nombre d’animaux utilisés pour de telles enquêtes, l’essai décrit est facile à réaliser et toujours reproductible.

Introduction

L’endothélium vasculaire est constitué d’une monocouche de cellules endothéliales (EC) qui bordent la lumière des vaisseaux sanguins. Dans un état physiologique, ce repos sont chargés de l’entretien d’un environnement anti-inflammatoire et un anticoagulant. 1 c’est médiée par l’expression d’anticoagulant et protéines anti-inflammatoires sur la surface de l’EC. Par exemple, activation de EC causée par l’ischémie/reperfusion blessures ou rejet vasculaire de (xeno-) transplantés entraîne une modification de la surface endothéliale d’un anticoagulant et anti-inflammatoires état pro-inflammatoire et Pro-coagulant organes État. 1

Pour étudier l’interaction fascinante et complexe entre les facteurs de l’endothélium et la coagulation, modèles in vitro qui imitent tant que possible la situation in vivo sont fortement souhaitables. Une limitation courante qui caractérise conventionnelles in vitro tests de coagulation est l’utilisation de sang non coagulé qui rend l’analyse des effets médiés par coagulation ardu et ne peut pas reproduire les même recalcification du sang citraté résultats obtenus avec du sang frais non-anticoagulé. 2 en outre, dans les systèmes de cultures cellulaires de plat traditionnel il est impossible d’exploiter les propriétés anticoagulantes de l’endothélium, comme une surface suffisante de cellules endothéliales par volume sanguin n’est pas joignable. Le modèle présenté ici permet de surmonter ces limitations en cultivant EC sur la surface des perles avec des microporteurs sphérique, alors qu’un ratio de surface-to-sang d’EC de > 16 cm2/ml peut être atteint, ce qui est similaire à la situation dans les petites artérioles ou veines, et suffisantes permettre à l’anticoagulation « naturelle » du sang, qui a été décrit par la surface de l’EC. 3 , 4 sang entier peut être utilisé sans anticoagulants ajoutés dans ce paramètre. Des échantillons de sang peuvent être collectées au cours de l’expérience et des cytokines, des facteurs de coagulation et marqueurs d’activation complément soluble peuvent être détectés et quantifiées. En outre, EC-enduit avec des microporteurs perles peuvent être analysées pour les dépôts d’immunoglobulines et de complément ainsi que l’expression des marqueurs d’activation EC par microscopie confocale. Une autre application intéressante comprend les essais de médicaments qui sont censés pour prévenir la coagulation et, par conséquent, activation des cellules endothéliales. 5 bien que ce modèle ne peut totalement remplacer l’expérimentation animale, elle offre une méthode pour tester les hypothèses fonctionnelles spécifiques ex vivo à l’aide de cellules et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche fondamentale sur l’ischémie/reperfusion transplantation des blessures ou (xeno).

Le modèle décrit a été utilisé pour imiter la xénotransplantation dans quelles cellules endothéliales aortiques porcines (PAEC) sont cultivées sur les perles avec des microporteurs et incubées en présence de sang entier, non anticoagulé. Différente PAEC transgénique, transportant plusieurs gènes humains tels que CD46 pour la régulation du système du complément et/ou thrombomoduline (hTBM) pour la régulation du système de la coagulation, ont été analysées pour leurs propriétés anticoagulantes. Systèmes d’activation, complément et coagulation de cellules endothéliales sont étroitement contrôlées et reliés entre eux. 6 il est donc important de comprendre comment les différentes cellules transgéniques se comportent après une exposition au sang humain, en ce qui concerne l’expression de molécule adhérence et cytokines, effusion du glycocalyx et une perte de protéines anticoagulantes. 7

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Protocole

allemand Landrace porcs (type sauvage élevé dans une ferme locale et transgénique élevés à l’Institut de race d’animaux moléculaire et biotechnologie, Université Ludwig-Maximilian, Munich, Allemagne), pesant entre 30 kg à 40 kg, ont été utilisés dans Cette étude. Tous les animaux étaient logés dans des conditions normales, avec eau et nourriture ad lib. Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément à la Loi sur les animaux au Royaume-Uni (procédures scientifiques) et le Guide de NIH pour les soins et Use of Laboratory Animals, ainsi que la Loi de la protection Suisse des animaux. Toutes les études sur l’animal respecte les directives d’arrivée. Le Comité de l’expérimentation animale du service vétérinaire cantonal (Canton de Berne, Suisse) a approuvé toutes les procédures d’animaux, l’autorisation ne. BE70/14. Protocoles expérimentaux ont été affinés selon les principes 3R et état-of-the-art anesthésie et gestion de la douleur ont été utilisées pour réduire au minimum le nombre d’animaux et de réduire l’exposition des animaux au stress et douleur au cours des expériences.

sang provient des individus sains par ponction veineuse système fermé conformément aux directives suisses de compétence et d’éthique de l’hôpital universitaire de Berne. L’expression " sang anticoagulé non " signifie que le sang n’a pas été traité avec un anticoagulant.

les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles. Familiarité avec la technique stérile de culture de cellule de base est nécessaire.

1. isolement du PAEC

Remarque : segments de l’aorte thoracique de 6 à 10 cm ont été extraites des euthanasiés allemand Landrace porcs de 3 à 6 mois d’âge (utilisé pour d’autres expériences in vivo) et immédiatement transféré dans une bouteille en verre de 500 mL contenant un milieu de transport (DMEM + 1 % pénicilline/streptomycine).

  1. Préalablement recouvrir une plaque 6 puits fibronectine 12,5 µg/ml dans du PBS 1 x et le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
  2. Préchauffer PBS stérile 1 x et cell culture moyen (DMEM).
  3. Sortir de l’aorte de porc de milieu de transport.
  4. Placer l’aorte sur une plaque de polystyrène.
  5. Rincer doucement au préalable de PBS chaud.
  6. Couper l’aorte longitudinalement et fixez-le avec des aiguilles.
  7. Ajouter un milieu de culture cellulaire chaud sur la surface intérieure de navire.
  8. Aspirer de milieu de culture cellulaire de la fibronectine et ajouter le milieu de culture de cellules fraîches (DMEM additionné de 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine et 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix).
  9. Faire tremper un coton-tige dans le milieu de culture cellulaire. Tamponner le bourgeon d’ouate sur le sommet de la surface intérieure de navire doucement et lentement dans la même direction.
  10. Frotter les cellules dans un puits de 6 puits plaque ronde par ronde.
  11. Faire la même chose pour le reste des puits.
  12. Vérifier les cellules au microscope et placer la plaque de 6 puits dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO 2.
  13. Changer le milieu de la deuxième journée et modifiez-le à nouveau tous les 2-3 jours.
  14. Lorsque les cellules vont être confluentes, trypsinize des cellules et leur semence dans une fiole de T75 (PAEC P1).

2. PAEC caractérisation

  1. manteau avant une chamberslide de 8 puits avec la fibronectine 12,5 µg/mL dans du PBS 1 x et le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
  2. Graines de 5 x 10 4 cellules/puits et incuber pendant la nuit dans l’incubateur à 37 ° C.
  3. Laver les cellules deux fois avec du PBS ++ (PBS additionné de CaCl 2 et MgCl 2), 300 μL/puits.
  4. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde de 3,7 % pendant 10 min à température ambiante, 200 μL/puits.
  5. Laver les cellules 3 fois avec du PBS ++, 300 μL/puits.
  6. Ajouter 300 μl de PBS 1 x-3_% BSA (tampon de blocage) et laisser 30 min à température ambiante.
  7. Appliquer les anticorps primaires (anti-VE-cadhérine, anti-CD31, anti-vWF) dilués dans un détergent 1x-1%BSA-0.05% PBS, 160 μL/puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
  8. Laver 3 fois avec du PBS ++ (200 μL/puits).
  9. Appliquer les anticorps secondaires et DAPI dilué dans un détergent 1x-1%BSA-0.05% PBS, 160 μL/puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
  10. Laver 3 fois avec du PBS ++ (200 μL/puits).
  11. Monter les lames avec du milieu de montage de la base de glycérine et vérifier l’expression de marqueurs de cellules endothéliales sous un microscope à fluorescence.
    NOTE : Les cellules endothéliales aortiques porcines Culture dans une fiole de T175 (milieu de faible concentration de glucose DMEM + 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine et 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix) jusqu’au confluent de 90 % est atteint. (ensemencement des cellules de 6 densité 1 x 10, 90 % confluence correspondent approximativement à 5 x 10 6 cellules).

3. Revêtement de perles avec des microporteurs

  1. 7 mL de perles avec des microporteurs se mêlent 42 mL de solution de collagène dans un tube de 50 mL (100 μg/mL, dilué dans une solution d’acide acétique 0,2 %) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
  2. Laver les perles deux fois avec 25 mL de PBS pH 7,4 (ajouter 25 mL de PBS, mélangez bien avec la pipette et attendre jusqu'à ce que les perles sont installés puis jeter le surnageant et répétition) et une fois avec 25 mL de milieu DMEM.
  3. Couvrir les perles dans le tube de 50 mL avec 10mL de milieu 199 additionné de 10 % de BF, 1 % pénicilline/streptomycine, 1 % L-Glutamine, 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix et 25 μL d’héparine (5000 UI/mL) et permettre l’équilibration pendant 10 min avant d’utiliser.

4. Prélèvement de cellules

  1. enlever le milieu de culture cellulaire du T175 flacon contenant PAEC et ajouter 5 mL de tampon au phosphate pH 7.4.
  2. PBS de retirer du flacon T175.
  3. Ajouter 5 mL d’EDTA Trypsin-0.05% et incuber pendant 3-4 min à 37 ° C.
  4. Recueillir les cellules en rinçant le ballon avec 15 mL de milieu de culture cellulaire et transférer la suspension dans un tube de 50 mL.
  5. Centrifuger des cellules à 1 200 g pendant 8 min à température ambiante, enlever l’excès du milieu et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture cellulaire.

5. Ensemencement des cellules dans la fiole d’agitateur

  1. Ajouter 20 mL de milieu de culture cellulaire à la suspension cellulaire et resuspendre.
  2. Ajouter 20 mL milieu de culture cellulaire (w/o de cellules) dans la fiole de 500 mL agitateur magnétique.
  3. Ajouter les cellules aux talons avec des microporteurs lavé à l’étape 3.3 et mélanger soigneusement avec une pipette sérologique de 25 mL.
  4. Transvider le mélange de perles/cell dans la fiole de toupie magnétique.
  5. Rincer le tube de 50 mL avec 10 mL de milieu de culture cellulaire pour recueillir les cellules restantes.
  6. Ajouter une autre 85 mL de milieu de culture cellulaire dans le ballon de la fileuse et placez-le dans l’incubateur pendant une nuit à 37 ° C dans un agitateur (100 x g, intervalle de mélange : 3 min toutes les 45 min).
  7. Ajouter 50 mL de milieu de culture cellulaire (volume total 200 mL) et continuer à remuer pendant 24h supplémentaire à 37 ° C dans un agitateur (100 x g, intervalle de mélange : 3 min toutes les 45 min).
  8. Ajouter le milieu RPMI incolore (additionné de 10 % FBS, pénicilline/streptomycine 1 % 1 % L-Glutamine, 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix et 25 μL d’héparine) jusqu'à atteindre 320 mL de volume total.
  9. Remplacer le milieu de chaque mL de 48 h: 100 supprimer de vieux milieu et ajouter 100 mL de frais RPMI incolore supplémenté.
  10. Culture des cellules pendant 5 à 7 jours. Le temps dépend de l’état de la confluence des perles revêtement cellulaire.
< classe p = « jove_title "> 6. Vérification de la confluence

  1. 200 μL de perles enduit de cellule à l’aide d’une pipette de recueillir et de les transférer dans un tube en polypropylène.
  2. Laver les perles 3 fois avec 600 μl de PBS 1 x (Ajouter PBS, incliner le tube et mélanger doucement pour éviter le détachement des cellules, les perles d’attente pour s’installer, jetez le PBS et répétez).
  3. Difficulté les perles pendant 10 min en ajoutant 200 μL d’acide parapicric.
  4. Laver 3 fois avec 600 μl de PBS 1 x.
  5. Ajouter DAPI dilué dans du PBS 1 x et incuber pendant 10 min.
  6. Transférer les perles sur une lame de verre et appliquer un lamelle couvre-objet à l’aide du milieu de montage glycérol basé.
  7. Visualiser les perles sous un microscope confocal.

7. Procédure expérimentale

  1. enlever les perles revêtement cellulaire de la fiole de l’agitateur magnétique (procédures n’ont pas à être fait dans des conditions stériles) avec une pipette sérologique de 10 mL et de les transférer dans des tubes en polypropylène à fond rond 12 mL.
  2. Laissez les billes s’installer (environ 1-2 min) et enlever l’excès du milieu.
  3. Ajouter des perles plus aux tubes jusqu'à ce que chaque tube contient exactement 2 mL de perles.
  4. Ajouter RPMI clair 5 mL dans chaque tube et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
  5. Laissez les billes s’installer et enlever l’excès du milieu.
  6. Répéter la procédure de lavage une fois de plus avec RPMI et enlever tout excès du milieu.

8. L’incubation avec sang anticoagulé-Non

  1. prudemment et lentement (à l’aide de jet ni Vacutainer) prélever du sang d’un volontaire sain et ramasser dans les tubes en polypropylène neutre 9 mL (sans anticoagulant).
  2. Transvaser lentement 8 mL de sang avec une pipette sérologique de 10 mL dans chacun des tubes en polypropylène contenant 2 mL de cellule-enduit perles (le volume total sera de 10 mL). Toujours éviter une manipulation brutale du sang ou des perles pour éviter l’activation prématurée de EC. La procédure prend 1-2 min.
  3. Incliner délicatement le mélange de sang/perle pour assurer un mélange égal et sceller le bouchon avec le film de paraffine.
  4. Placer les tubes sur une table horizontale inclinable (avec réglages inclinaison douces seulement) à l’intérieur d’un incubateur de 37 ° C et le record de temps de coagulation.
    1. à des intervalles de temps définie, par exemple après 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, retirez au moins 1,5 à 2 mL de mélange de sang-perle pour l’analyse de sérum ou de plasma.
      NOTE : pour 6 points dans le temps nous vous suggérons ayant plus de 3 répétitions au sein d’un groupe de cellules, comme le prélèvement de sang se fera dans différents tubes.
    2. Pour la collecte de sérum, laisser le sang à coaguler. Pour collecter le plasma, ajoutez EDTA ou citrate de tubes de 2 mL avant d’ajouter des échantillons de sang.
    3. Stocker les tubes sur la glace, centrifuger à 2 500 g pendant 10 min à 4 ° C et conserver le sérum/plasma à 80 ° C jusqu'à l’utilisation.
      NOTE : On trouvera des précisions sur les matériaux dans la Table des matières

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Résultats

Après 7-10 jours de culture placé dans le cône d’hélice (Figure 1), les cellules étaient confluentes, couvrant toute la surface des perles avec des microporteurs (Figure 2). Vérification de l’État confluency est une étape importante car une monocouche de non-confluent d’EC sur les microbilles entraînera une diminution marquée du temps de coagulation, compte tenu de l’avec des microporteurs surface des perles est fortement Pro-coa...

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Discussion

Le modèle présenté ici est adapté pour la coagulation des études permettant l’analyse des différents aspects de la coagulation et de son interaction avec EC. 8 dans la recherche de la xénotransplantation, c’est un système utile pour tester les propriétés anticoagulantes de différents ECs porcins génétiquement modifiés après incubation avec le sang humain 9.

Les étapes plus critiques du protocole sont celles assurant la couverture cellulaire compl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Swiss National Science Foundation (FNS, Grant No. 320030_156193). Les auteurs remercient Dr Benoît Werlen pour fournir les perles avec des microporteurs de Biosilon. Nous remercions également le Prof. Hans Peter Kohler et Prof. André Haeberli d’aide à la mise en place du modèle de perle avec des microporteurs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PAECIsolé de l’aorte de porc dans notre laboratoire
Microcarrier beads (Biosilon)Thermo Fisher Scientific160-250
Collagen I, BovinGibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
Medium 199SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
Tubes neutresSarstedt02.1726.001
Tubes en polypropylèneSimportT406-2A
Flacons d’agitationTecnomara
Agitateur biologiqueBrouwerMCS-104S
Rat anti CD31R& D SystemsMAB33871Dilution 1:100
Chèvre anti-rat IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003Dilution 1:500
Chèvre anti VE-cadhérineSanta Cruzsc-6458Dilution 1:100
Lapin anti vWFDAKOA0082Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG &ndash ; Sondes moléculaires Alexa 488A11055Dilution 1:500
Chèvre anti Lapin - FITCSouthern Biotech4050-02Dilution 1:500
DAPISigma32670-25MG-FDilution 1 µ ; g/mL
0,05 % Trypsine-EDTAGibco25300-054
FBSGibco10270-106Concentration : 10 % dans un milieu de culture cellulaire
AdaptateurSarstedt14.1205
Microscope confocalCarl ZeissLSM 710
Logiciel d’analyse d’imagesImage JDisponible gratuitement sur : https://imagej.net
Supplément de milieu de croissance cellulaire endothélialeMixPromoCellC-392162 mL dans 500 mL de DMEM
Pénicilline Streptomycine Gibco15140-122Concentration : 1 % dans le milieu de culture cellulaire
L-GlutamineGibco25030-024Concentration : 1 % dans le milieu de culture cellulaire
Heparinun natricumDrossa Pharm AGConcentration du stock : 5000 U.I./ mL
Lames de chambreBioswisstec AG30108
CaCl2 x 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 x6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA7030
Médium de montage GlycergelDakoC0563

Références

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

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