Cellule entière courants induits par l’Application de la bouffée de GABA dans des tranches de cerveau

Résumé

Les auteurs décrivent la technique puff, par lequel les réactifs pharmacologiques peuvent être administrés pendant l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière et mettre en évidence les différents aspects des caractéristiques qui sont indispensables à son succès.

Résumé

Gestion pharmacologique est couramment utilisée dans le cadre de cellules entières patch clamp enregistrement dans des tranches de cerveau. Une des meilleures méthodes de demande de drogue au cours de l’enregistrement électrophysiologique est la technique de souffle, qui peut être utilisée pour étudier l’effet de réactifs pharmacologiques sur des activités neuronales dans des tranches de cerveau. Le plus grand avantage d’application bouffée, c’est que la concentration du médicament autour du site d’enregistrement augmente rapidement, ce qui empêche une désensibilisation des récepteurs membranaires. Utilisation efficace d’application feuilletée implique une attention particulière aux éléments suivants : la concentration de la drogue, les paramètres de la micropipette bouffée, la distance entre l’extrémité d’une micropipette feuilletée et le neurone enregistré et la durée et pression au volant la bouffée (livres par pouce carré, lb/po2). Cet article décrit une procédure étape par étape pour l’enregistrement des germes entiers courants induits par bouffées d’acide gamma - aminobutyrique (GABA) sur un neurone d’une tranche de cortex préfrontal. Notamment, la même procédure peut être appliquée avec des modifications mineures aux autres régions du cerveau comme l’hippocampe et le striatum et aux préparations différentes, telles que les cultures de cellules.

Introduction

La technique de patch clamp, un outil de base pour l’étude des signaux électriques dans les neurones, a été développée dans les années 1970^1,2. Un avantage majeur de cette technique est qu’elle fournit des connaissances sur les traitements spécifiques (p. ex., pharmacologiques) peuvent altérer les fonctions neuronales ou canaux en temps réel³. Évaluation pharmacologique de fonction neuronale au cours de l’enregistrement dans une tranche de cerveau cellule entière exige que la demande de drogues, telles que les agonistes ou antagonistes des récepteurs spécifiques, les neurones en cours d’enregistrement. Cette méthode permet l’identification des altérations neuronales qui se produisent après l’application d’un médicament spécifique, conduisant ainsi à une meilleure compréhension des propriétés physiologiques et pathologiques des neurones⁴. Bien que l’administration pharmacologique peut être effectuée via une perfusion⁵ ou feuilletée⁶, ce dernier est la technique supérieure. En particulier : (i) puff demande rapidement augmentations de drogue concentration autour du neurone enregistrée à un niveau tel que la désensibilisation des récepteurs membranaires est empêchée ; (ii) le volume de drogue soufflé est extrêmement faible, de sorte qu’il y a peu d’effet sur la solution du bain, ce qui réduit donc les éventuels effets indésirables des produits chimiques administrées sur des tranches de cerveau ; (iii) le protocole bouffée peut être défini et enregistré, rendant l’expérience très exactement reproductible ; (iv) feuilletée représente une utilisation économique des agonistes/antagonistes, en particulier lorsque ces réactifs sont coûteux ou difficiles à obtenir.

Ici, nous nous concentrerons sur l’enregistrement des germes entiers courants induits par bouffées GABA en tranches de cerveau parfaitement préparés, une préparation qui a l’avantage des circuits du cerveau relativement bien préservé. Comment nous effectuons courants inhibiteurs induits par bouffée⁷ seront décrites dans cet article. À l’aide de césium (Cs⁺)-basé des solutions internes et maintenant les neurones à 0 mV, nous allons introduire GABA-pouf évoquée par courants postsynaptiques inhibitrices (eIPSCs) avec des détails techniques appropriés. À l’aide d’un modèle murin de la dépression induite par le lipopolysaccharide (LPS) injection⁸, nous montrons que l’eIPSC amplitude évoquée par une bouffée de GABA est considérablement réduit dans les tranches des souris injectées LPS par rapport aux commandes du véhicule. Notre intention est que cet article devrait montrer comment la technique de la bouffée est largement applicable à des études visant à évaluer l’effet des produits chimiques, composés ou médicaments sur des activités neuronales dans des tranches de cerveau.

Protocole

Au logement des animaux et animaux de toutes les expériences ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par le Comité d’éthique pour la recherche animale à l’Université normale de Chine du Sud, selon les lignes directrices établies par l’Institut National de protection des animaux Santé.

1. préparation des Solutions

1. préparer 500 mL de standard artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) contenant les composants décrits dans notre ouvrage publié ⁷ comme indiqué au tableau 1.
   1. Verre propre utilisation béchers avec de l’eau déionisée pour préparer une nouvelle solution de fsca. Nettoyer les spatules avec de l’eau déminéralisée et sécher avant d’utiliser ajouter NaCl, KCl, NaH ₂ PO ₄, NaHCO ₃, MgSO ₄, D-glucose et ajoutez le CaCl ₂ après avoir propagé la solution avec 95 % O ₂ / 5 % CO ₂ mélange pendant environ 20 min (comme indiqué au tableau 1) dans 500 mL d’eau désionisée. Remuer jusqu'à ce que complètement dissous.
   2. S’assurer que le FSCA est complètement effacer sans aucune précipitation. Puis, ajustez le pH à 7,2 – 7,4. Bulle avec un mélange de gaz composé de 95 % d’O ₂ et 5 % CO ₂ pendant environ 20 min.
2. Préparer 250 mL de solution de découpe tranche contenant les produits chimiques ⁷ décrit dans le tableau 2.
   1. Ajouter KCl, MgCl ₂ NaH ₂ PO ₄, NaHCO ₃, choline·Cl, D-glucose et ajoutez le CaCl ₂ modifié comme indiqué dans 1.1.1, à 250 mL d’eau désionisée et dissoudre comme décrit en 1.1.1 et 1.1.2.
   2. Après barbotage avec 95 % O ₂ / 5 % de CO ₂, placer la solution dans un congélateur pendant 15-20 min pour que la solution de découpe devient glacée et partiellement gelé.
      Remarque : Nous utilisons cette solution de découpe en tranches de 1-2 mois-vieilles souris ; la formule peut être différent pour les souris âgées de 2 mois.
   3. Solution de LPS préparer par dissolution dans une solution saline stérile exempt d’endotoxine isotonique (0,9 % NaCl). LPS est administré par voie intrapéritonéale (0,5 mg/kg) et commencer l’enregistrement 2 h plus tard.

2. Préparation de tranches de Cortex préfrontal

1. prendre la solution de découpe sortis du congélateur et homogénéiser pour obtenir une barbotine. Placer la solution sur la glace et bouillonner constamment avec 95 % O ₂ / 5 % de CO ₂.
2. à l’aide de ciseaux grande, forte, rapidement décapiter une souris comme décrit ⁹ et immédiatement mis la tête dans un bécher rempli de glacee (0-4 ° C) solution de découpe.
3. Couper le haut du crâne le long de la ligne médiane en direction caudale-à-nez avec des ciseaux fins et enlever les parties latérales de crâne. Enlever le cerveau avec une fine spatule déposer en solution de découpe glacee.
   Remarque : Les étapes 2.2-2.3 doivent se faire rapidement (idéalement < 1 min).
4. Placer le cerveau sur le couvercle d’une boîte de Pétri 9 cm rempli de glaçons. Rincez le cerveau avec la solution de coupe glacée. Couper le cervelet et le bulbe olfactif avec une lame de rasoir.
5. Colle cyanoacrylate appliquer au modèle détenteur d’un vibratome. Placez soigneusement le bloc du cerveau sur la goutte de colle, rostral face vers le haut et plonger immédiatement dans la solution de découpe glacee.
6. Régler le support de lame de la vibratome à un angle de 15° par rapport à l’horizontale et se préparer à 350 µm tranches de cerveau coronale (fréquence de vibration de lame = 85 Hz, vitesse = 0,1 mm/s).
7. à l’aide d’une pipette, transfert les tranches dans la chambre de récupération remplis de FSCA, incuber pendant 1 heure (à la droite) avec un bouillonnement constant de 95 % O ₂ / 5 % de CO ₂.

3. Cellule entière Patch enregistrement

micropipettes de

1. faire verre borosilicaté pour utilisation comme électrodes d’enregistrement ou feuilletée micropipettes conformément aux lignes directrices spécifiques du tire-câble manuel. Pour l’enregistrement des électrodes, résistances de pointe sont de l’ordre de 4-6 M Ω, tandis que feuilletée micropipettes ont des diamètres de pointe dans la gamme de 2 à 5 µm.
2. Ajouter bloqueur des canaux Na ⁺ (TTX, 1 µM), au canal rapide Na ⁺ + bloc et donc de potentiels d’action, de l’ACSF et maintenir un débit constant de cette solution de 2 à 3 mL/min dans la chambre d’enregistrement, par une pompe péristaltique dans la chambre et l’aspiration hors de lui. Bulle le FSCA avec 95 % O ₂ / 5 % de CO ₂ en permanence pour assurer la viabilité des tranches de.
3. Transférer une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur modifiée dont pointe fine a été coupé à la taille de la tranche. Couvrir la tranche avec une ancre platine tranche avec des fils de nylon parallèles espacées ≥ espacés de 2 mm pour contenir la tranche sur la plate-forme.
4. Remplir la micropipette enregistrement avec solution interne ⁷ (tableau 3) et remplir les micropipettes bouffée de GABA à 10 µM, 50 µM et 100 µM (dissous dans l’ACSF) ou fsca comme excipient.
5. Pour éviter l’obstruction par des débris, appliquez une légère pression positive à l’aide d’une seringue de 1 mL avant d’immerger l’électrode d’enregistrement dans le fsca. À l’aide d’un micromanipulateur sous un microscope (objectif 4 x), positionner la micropipette d’électrode et feuilletée enregistrement afin que les pointes apparaissent au centre de l’image vidéo dans le moniteur ( Figure 1 A).
6. Ajuster la mise au point du microscope (40 objectif x) tout en réduisant progressivement la micropipette feuilletée et placez-le au-dessus du neurone d’enregistrement à un angle de 45°. Maintenir la distance entre l’extrémité de la micropipette feuilletée et le neurone a enregistré entre 20 à 40 µm ( Figure 1 B). Lentement et soigneusement approcher le neurone avec l’électrode d’enregistrement et puis relâchez la pression positive. Appliquer une succion faible et brève à travers le tuyau connecté au porte-électrode pour créer un joint de giga ohms.
7. Maintenir la tension à 0 mV. Après la formation du sceau giga ohms, compenser rapide et lente capacitance manuellement ou automatiquement. Appliquez ensuite une brève et forte aspiration dans la tubulure mentionnée ci-dessus pour accéder au mode cellule entière.
Mode de
8. enregistrement eIPSC en voltage clamp. Appliquer la pression faible de gaz (azote, 4 à 6 lb/po2) à la micropipette feuilletée à l’aide un Picospritzer contrôlée par un générateur d’étape de tension 8 Master pour livrer GABA simple ou jumelé bouffées ( Figure 2).
9. Modifier la durée de la bouffée pour obtenir les meilleurs résultats d’eIPSC ( Figure 3) et de mesurer l’eIPSC dans le modèle de la dépression induite par LPS ( Figure 4).

Résultats

La technique de souffle permet aux chercheurs d’étudier l’effet des médicaments sur des récepteurs particuliers sur la surface d’un neurone donné. Dans cet article, nous nous concentrons sur les courants médiées par les récepteurs GABA. La figure 1 illustre les micropipettes feuilletée et enregistrement. Pour éliminer tout effet sur les neurones enregistrés la pression physique générée par le souffle, le FSCA et bouffées de saccharose (Fi...

Discussion

Puff demande est largement utilisé pour évaluer des récepteurs post-synaptiques fonction^3,4,7, mais nécessite un contrôle précis pour chaque expérience. Nous décrivons une procédure impliquant patch de cellules entières de serrage, qui démontre le que GABA-pouf induit CISP (p. ex., eIPSCs) dans des tranches de cerveau cortical préfrontal. La résistance de l’électrode d’enregistrement est MΩ environ 5, tandis que le diamètre de l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Micropipettes en verre borosilicaté	Shutter Instruments	BF150-86-10	Diamètre extérieur de 1,50 mm ; diamètre intérieur de 0,86 mm
Extracteur de micropipette	Shutter Instruments	MODÈLE P-97  ;	Extracteur de micropipette Flaming/Brow
Micromanipulateurs	Shutter Instruments	MP-285
Amplificateur contrôlé par ordinateur  ;   ;   ;	Multiclamp 700B		Molecular Devices
;	Dispositifs moléculaires	Digidata 1440A
Caméra d’imagerie	Nikon·s ;	2115001	Matériel d’inspection
Microscopie  ;	Nikon·s ;	Eclipse FN1  ;
Master 8	A.M.P.I.	Master-8 Stimulateur d’impulsions
Vibratome Slicer	Leica	VT 1000S
Lame de rasoir	Gillette	74-S	FLYING EAGLE
Moniteur vidéo	Panasonic	WV-BM 1410
502 Glue	Deli	7146	Cyanoacrylate Colle
Pompe péristaltique	Shanghai JIA PENG Corporation	BT100-1F
Caméra vidéo	Olympus America Medical	OLY-150
Tuyaux de transfert	Biologix	30-0138A1