Summary
Ein Protokoll wird für die Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen (UCNs) und deren zellulären Anwendungen für Kanal-Protein-Verordnung auf Nah-Infrarot (NIR) Beleuchtung präsentiert.
Abstract
Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristalle (UCNs) haben viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren anhand ihrer vielversprechenden und kontrollierbaren optische Eigenschaften, die für die Absorption von Nah-Infrarot (NIR) Licht und können anschließend konvertieren Sie es in Multiplex-Emissionen, die über eine Vielzahl von Regionen vor der UV-Strahlung zu sichtbaren in der NIR umfassen. Dieser Artikel stellt detaillierte experimentelle Verfahren für Hochtemperatur-Co Niederschlag Synthese von Kern-Schale-UCNs, die verschiedene Lanthanoid-Ionen in Nanokristallen für die effiziente Umwandlung von tiefen Gewebe durchlässig NIR Erregung (808 integrieren nm) in eine starke blaue Emission bei 480 nm. Durch die Kontrolle der Oberflächenmodifikation mit biokompatiblen Polymer (Polyacryl Säure, PAA), die als vorbereitet UCNs erwirbt große Löslichkeit in Pufferlösungen. Die hydrophilen Nanokristalle sind weiter mit spezifischen Liganden (Dibenzyl Cyclooctyne, DBCO) für die Lokalisierung auf der Zellmembran funktionalisiert. Bei NIR Licht (808 nm) Bestrahlung, hochkonvertiert blaue Emission effektiv aktivieren die Licht-gated Kanal-Protein auf der Zellmembran und speziell die Zustrom kation (z.B. Ca2 +) im Zytoplasma zu regulieren. Dieses Protokoll bietet eine praktikable Methode zur Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierten UCNs und anschließende biokompatible Oberflächenmodifizierung für weitere mobile Anwendungen.
Introduction
In den letzten Jahren haben Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristalle (UCNs) verbreitet wurde, als Alternative zu herkömmlichen organischen Farbstoffen und Quantenpunkte in biomedizinischen Anwendungen, die vor allem auf ihre hervorragenden chemischen und optischen Eigenschaften basieren, auch gute Verträglichkeit, hohe Beständigkeit gegen Immunofluoreszenz und schmale Bandbreite Emission1,2,3. Noch wichtiger ist, können sie als eine viel versprechende Nanotransducer mit ausgezeichneten Gewebe eindringen Tiefe in Vivo zum Konvertieren von Nah-Infrarot (NIR) Erregung in eine breite Palette von Emissionen aus UV, sichtbar, und die NIR-Regionen durch ein Multi-Photon dienen. Großbildschirmen Prozess4,5. Diese einzigartigen Eigenschaften machen Lanthanid-dotierte UCNs dienen als besonders Erfolg versprechend Vektor für biologische sensing, biomedizinische Bildgebung und Krankheiten Theranostik6,7,8.
Die allgemeinen Komponenten des UCNs basieren vor allem auf die dotierten Lanthanoid-Ionen in der isolierenden Host-Matrix mit einer sensibilisierend (z.B., Yb3 +, Nd3 +) und einem Aktivator (z.B., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) im Inneren des Kristalls homogen9. Verschiedene optische Emission von der Nanokristalle wird lokalisierten elektronischen Übergang innerhalb der 4f -orbitale der Lanthanid Dotierstoffe aufgrund ihrer Leiter-wie angeordneten Energieniveau10zugeschrieben. Daher ist es wichtig, die Größe und Morphologie der synthetisierten UCNs mit Mehrkomponenten Lanthanid Dotierstoffe genau zu kontrollieren. Von rechts wurden einige vielversprechende Methoden gut für die Vorbereitung der Lanthanoid-dotierten UCNs, einschließlich thermische Zersetzung, Hochtemperatur-Co Niederschlag, hydrothermale Synthese, Sol-Gel-Verarbeitung, etc.11 eingerichtet , 12 , 13 unter diesen Ansätzen, die Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode ist eine beliebte und praktische Strategien für UCNs-Synthese, die streng kontrolliert werden kann, gewünschte qualitativ hochwertige Nanokristalle mit einheitlicher Form vorbereiten und Größenverteilung in einer relativ kurzen Reaktionszeit und kostengünstige14. Jedoch sind die meisten Nanostrukturen synthetisiert durch diese Methode hauptsächlich begrenzt mit hydrophoben Liganden wie Ölsäure und Oleylamine, die in der Regel ihre weitere Bioapplication aufgrund der begrenzten hydrophobe Liganden Löslichkeit in wässriger Lösung behindern 15. Daher ist es notwendig, geeignete Oberflächenmodifizierung Techniken um biokompatible UCNs in biologischen Anwendungen in Vitro und in Vivovorzubereiten.
Hier präsentieren wir Ihnen das detaillierte experimentelle Verfahren für die Synthese von Kern-Schale UCNs Nanostrukturen durch die Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode und eine machbare Veränderung Technik zu funktionalisieren biokompatible Polymer auf UCNs Oberfläche für Weitere zelluläre Anwendungen. Dieser UCNs Nanoplatform enthält drei Lanthanoid-Ionen (Yb3 +, Nd3 +und Tm3 +) in die Nanokristalle, starke blaue Emission zu erwerben (~ 480 nm) bei NIR leichte Erregung bei 808 nm, die größere Eindringtiefe hat in lebendes Gewebe. Es ist allgemein bekannt, dass Nd3 +-dotierten UCNs minimierte Wassereffekte Absorption und Überhitzung in diesem spektralen Fenster anzeigen (808 nm) im Vergleich zu herkömmlichen UCNs auf 980 nm Bestrahlung16,17, 18. Darüber hinaus um die UCNs in biologischen Systemen zu verwenden, die hydrophoben Liganden (Ölsäure) auf der Oberfläche des UCNs werden zunächst durch Ultraschallbehandlung in saurer Lösung19entfernt. Dann sind die Liganden-freie UCNs mit einem biokompatiblen Polymer (Polyacryl Säure, PAA), gute Löslichkeit in wässrigen Lösungen20erwerben weiter modifiziert. Darüber hinaus als ein Proof of Concept in zelluläre Anwendungen, hydrophilen UCNs sind weitere funktionalisiert mit molekularen Liganden (Dibenzyl Cyclooctyne, DBCO) für die konkrete Lokalisierung auf der N-3-Zellmembran getaggt. Bei NIR Licht (808 nm) Bestrahlung, die blauen hochkonvertiert Emission bei 480 nm kann effektiv aktivieren eine Licht-gated Kanal-Protein, Kanalrhodopsine-2 (ChR2), auf Zellen die Oberfläche und erleichtern somit kation (z.B. Ca2 + -Ion) Zustrom durch die Membran lebender Zellen.
Dieses video Protokoll bietet eine praktikable Methode für Lanthanid-dotierte UCNs Synthese, biokompatible Oberflächenmodifizierung und UCNs Bioapplication in lebenden Zellen. Unterschiede in der Synthesetechniken und chemischen Reagenzien in Nanocrystal Wachstum beeinflusst die Größe Verbreitung, Morphologie und Großbildschirmen Lumineszenz (UCL) Spektren des endgültigen UCNs Nanostrukturen in Zelle Experimente verwendet. Dieses detaillierte video-Protokoll ist bereit zu helfen neue Forscher auf diesem Gebiet zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit des UCNs mit der Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode und vermeiden die häufigsten Fehler in UCNs biokompatible Oberflächenmodifizierung für weitere Mobile Anwendungen.
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Protocol
Vorsicht: konsultieren Sie bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Nutzen Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Synthese von UCNs bei hoher Temperatur (~ 290 ° C), einschließlich der Verwendung von technischen Kontrollen (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (z.B. Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).
1. Synthese des NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) Kern-Schale-Nanokristalle
- Synthese von NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) Kern Nanostruktur
- Vorbereitung der RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F Methanol Stammlösung
Hinweis: die seltenen Erden (RE) Lanthanoid-Ionen sind Yttrium (Y), Ytterbium (Yb), Thulium (Tm) und Neodym (Nd).- Auflösen 500 mg Yttrium(III) Acetat Hydrat in 5 mL Methanol (100 mg/mL), 250 mg Ytterbium (III)-Acetat-Hydrat in 5 mL Methanol (50 mg/mL), Thulium (III)-Acetat-Hydrat in 1 mL Methanol (10 mg/mL), 10 mg und 10 mg Neodym (III)-Acetat-Hydrat in 1 mL metha Nol (10 mg/mL) in Glasfläschchen mit einem Ultraschall Reinigungsbad für 2 min.
- 400 mg NaOH in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 20 mL Methanol mit Ultraschall Reinigungsbad vorzubereitende NaOH-Stammlösung (20 mg/mL) zu kombinieren.
- Kombinieren 600 mg NH 4 F in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 30 mL Methanol mit Ultraschall Reinigungsbad NH 4 F-Stammlösung (20 mg/mL) vorzubereiten.
Hinweis: Platzieren Sie die Stammlösung Lanthanid-komplexe, NaOH und NH 4 F in Glasfläschchen, versiegeln mit Parafilm und speichern Sie sie im Kühlschrank bei ~ 4 ° C bis benötigt. Die vorbereiteten Methanol Stammlösungen sind einmal alle 2 Wochen ersetzt.
- Vorbereitung der NaYF 4: Yb/Tm/Nd Kern Nanostruktur
- Pipette 3 mL der Ölsäure und 7 mL 1-Octadecene in ein drei-Hals Flasche 50 mL.
- Kombinieren 1.089 mL Y (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung, 0,608 mL der Yb (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung, 83,6 µL Tm (CH 3 CO 2) 3 Lager-Lösung und 128,5 µL der Nd (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung in den Kolben.
- Einen Thermometer (0 - 360 ° C-Bereich) in den Kolben passen und lassen Sie ihren Tipp Tippen Sie auf die Lösung. Legen Sie die Flasche in einem Glasbehälter mit Silikonöl Phenylmethyl.
- Erhitzen der Lösung auf 100 ° C mit einer Heizplatte aus Methanol verdunstet. Schließen Sie die Flasche an einen Schlenk-Linie mit einem dual Vakuum/Gasarmatur zur Beseitigung der restlichen Methanols und das Reaktionsgemisch unter Vakuum für 2 – 3 min. unter Rühren.
- Erhöhen die Temperatur auf 150 ° C und halten diese Temperatur für 60 min. Maintain Rührgeschwindigkeit von 700 u/min während der Synthese.
Hinweis: Stellen Sie eine mäßige Geschwindigkeit rühren bis zu vermeiden, die Lösung Platschen. - Der Heizplatte zu stoppen und halten Sie die Flasche bei Raumtemperatur ermöglichen die Lösung abkühlen langsam.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten. - Kombinieren 2 mL NaOH-Methanol-Stammlösung und 2,965 mL NH 4 F-Methanol-Stammlösung in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Ziehen Sie den Schlauch mit der Kappe und mischen Sie die Lösung durch leistungsstarke vortexen für 5 s.
- Hinzufügen der NaOH-NH 4 F Mischung langsam in die Flasche durch eine Glaspipette über 5 min.
- Erhöhen die Temperatur der Mischung auf 50 ° C und halten dieser Temperatur für 30 min.
Hinweis: Stellen Sie die Temperatur von nicht mehr als 50 ° C, weil die hohe Temperatur Kristall Kernbildung und Wachstum fördern wird. - Erhöhen Sie die Temperatur (~ 100 ° C) zu verdampfen aus Methanol und verbinden Sie den Kolben zu einer Schlenk-Linie mit dual Vakuum/Gasarmatur zur Beseitigung der restlichen Methanols und das Reaktionsgemisch unter Vakuum für ca. 2-3 min.
- Schalterstellung der Absperrhahn die Küvette mit Stickstoff füllen.
- Erhöhung der Temperatur bis 290 ° C bei einer Heizrate von ~ 5 ° C/min. halten die Reaktionsmischung bei 290 ° C für 1,5 h.
- Der Heizplatte zu stoppen und entfernen Sie die Flasche um das Reaktionsgemisch langsam bei Raumtemperatur unter Rühren abkühlen lassen.
Achtung: Seien Sie vorsichtig mit der heißen Platte mit hoher Temperatur (> 400 ° C), schwere Verbrennungen bei Hautkontakt zu vermeiden. - Übertragen Sie die Mischung in die Flasche in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Flasche mit 30 mL Ethanol und übertragen Sie die Lösung auf die Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Produkt bei 4.000 × g für 8 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
- Fügen Sie 10 mL Hexan Zentrifugenröhrchen und neu verteilen das Produkt mit Beschallung (60 kHz, 240 W) für mind. 2
- 30 mL Ethanol hinzufügen das Rohr. Drehen Sie das Gerät bei 4.000 × g für 8 min und dann verwerfen des Überstands.
- Neu zerstreuen die feste Produkte im unteren Teil Zentrifugenröhrchen mit 5 mL Hexan. Die Lösung im Kühlschrank bei ~ 4 ° C für einen nächsten Schritt zu speichern.
Hinweis: Die Großbildschirmen Emission von Kern-Schale-UCNs wird durch bestrahlen die Lösungen mit einem 808 nm-Laser (2 W) getestet.
- Vorbereitung der RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F Methanol Stammlösung
- Vorbereitung der NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) Kern-Schale-Nanokristalle
- 3 mL der Ölsäure und 7 mL 1-Octadecene in ein 50 mL-drei-Hals-Kolben zu kombinieren. Fügen Sie 1,082 mL der Vorratslösung Y (CH 3 CO 2) 3 und 2,87 mL Nd (CH 3 CO 2) 3 Vorratslösung in den Kolben.
- Erhaltenen Kern Nanostruktur (80 mg in 5 mL Hexan aus Schritt 1.1.2.18) in den Kolben unter Rühren hinzufügen.
- Einen Thermometer (0 - 360 ° C-Bereich) in den Kolben passen und lassen Sie seine Spitze, die Mischung zu berühren. Legen Sie die Flasche in einem Glasbehälter mit Silikonöl Phenylmethyl.
- Erhitzen Sie die Mischung bei 100 ° C auf der Oberseite Heizplatte aus Methanol und Hexan verdunsten. Schließen Sie die Flasche an einen Schlenk-Linie mit einem dual Vakuum/Gasarmatur zur Beseitigung des restlichen Lösungsmittels und das Reaktionsgemisch unter Vakuum für 2 – 3 min. unter Rühren.
- Erhöhen die Temperatur auf 150 ° C und halten Sie sie für 60 min. pflegen die Rührgeschwindigkeit bei 700 u/min bei der Synthese.
Hinweis: Stellen Sie eine mäßige Geschwindigkeit rühren bis zu vermeiden, die Lösung Platschen. - Der Heizplatte zu stoppen und entfernen Sie die Flasche um die Lösung langsam bei Zimmertemperatur abkühlen lassen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten. - Pipette 2 mL NaOH-Methanol-Stammlösung und 2,965 mL NH 4 F-Methanol-Stammlösung in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Ziehen Sie den Schlauch mit der Kappe und mischen Sie die Lösung durch leistungsstarke vortexen für 5 s.
- Hinzufügen der Mischung in die Flasche durch eine Glaspipette langsam über 5 min.
- Erhöhen die Temperatur der Mischung auf 50 ° C und halten Sie sie bei 50 ° C für 30 min.
Hinweis: Stellen Sie die Temperatur nicht höher als 50 ° C weil die hohe Temperatur Kristall Kernbildung und Wachstum fördern wird. - Erhöhen Sie die Temperatur (~ 100 ° C) zu verdampfen aus Methanol und verbinden Sie den Kolben zu einer Schlenk-Linie mit dual Vakuum/Gasarmatur zu entfernen, die restliche Methanol, halten das Reaktionsgemisch unter Vakuum für ca. 2-3 min.
- Schalterstellung der Absperrhahn die Küvette mit Stickstoff füllen.
- Erhöhen die Temperatur bis 290 ° C bei einer Heizrate von ~ 5 ° C/min. halten die Reaktionsmischung bei 290 ° C für 1,5 h
- Der Heizplatte zu stoppen und entfernen Sie die Flasche um das Reaktionsgemisch langsam bei Raumtemperatur unter Rühren abkühlen lassen.
Achtung: Seien Sie vorsichtig mit der heißen Platte mit hoher Temperatur (> 400 ° C), schwere Verbrennungen bei Hautkontakt zu vermeiden. - Übertragen Sie die Mischung in die Flasche in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Flasche mit 30 mL Ethanol und übertragen Sie die Lösung auf die Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Produkt bei 4.000 × g für 8 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
- Fügen Sie 10 mL Hexan Zentrifugenröhrchen und neu verteilen das Produkt mit Beschallung (60 kHz, 240 W) für mind. 2
- 30 mL Ethanol hinzufügen das Rohr. Drehen Sie das Gerät bei 4.000 × g für 8 min und dann verwerfen des Überstands.
- Neu zerstreuen die feste Produkte im unteren Teil Zentrifugenröhrchen mit 5 mL Hexan. Speichern Sie die Lösung im Kühlschrank bei ~ 4 ° C bis benötigt.
Hinweis: Die Großbildschirmen Emission von Kern-Schale-UCNs wird durch bestrahlen die Lösungen mit einem 808 nm-Laser (2 W) getestet.
2. Synthese von biokompatiblen UCNs Nanostrukturen
- Vorbereitung der Liganden-freie UCNs Nanopartikel
- kombinieren 30 mL Ethanol mit der als vorbereitet Oleate-capped UCNs Lösung (Schritt 1.2.18) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4.000 × g für 8 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
- Kombinieren Sie 10 mL saure wässrige Lösung (pH = 4) angepasst von HCl (0,1 M) mit dem Niederschlag in 50 mL Zentrifugenröhrchen und auflösen den Niederschlag durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 30 min.
- Übertragung der Lösung in ein Glas Fläschchen mit kräftigen rühren für 2 h.
- Extrahieren die wässrige Lösung mit 30 mL Diethylether zu entfernen die Ölsäure, wiederholen dreimal.
- Fügen Sie 10 mL Wasser in den kombinierten Äther-Schichten mit sanft schütteln.
- Sammeln die wässrige phase zusammen (20 mL) und fügen Sie 20 mL Aceton mit vortexen für 5 s.
- Spin down das Produkt bei 35.000 × g für 10 min und den Überstand verwerfen. Den Niederschlag in 2 mL Wasser auflösen.
- Vorbereitung des Polymers geändert UCNs (PAA-UCNs)
- 200 mg Polyacryl Säure zu kombinieren (PAA, Mw = 1.800) mit 20 mL Wasser durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 20 min. Fügen Sie der oben genannten Liganden-freie UCNs in der PAA-Lösung mit kräftig rühren.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 durch NaOH-Lösung (1 M) mit Beschallung (60 kHz, 240 W), für 30 min. halten Sie die Mischung für 24 h bei Raumtemperatur unter Rühren.
- Sammeln die Ausfällung durch Zentrifugation bei 35.000 × g für 10 min. wieder auszusetzen das Produkt in 10 mL Wasser durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 5 min und Zentrifuge wieder bei 35.000 × g für 10 min. diesen Schritt wiederholen Sie dreimal.
- Neu verteilen das Produkt in 8 mL Wasser durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 5 min. speichern die Lösung im Kühlschrank bei ~ 4 ° C bis benötigt.
- Vorbereitung der funktionellen DBCO-UCNs-Nanopartikel
- Spin-down PAA@UCNs als vorbereitet (1 mg) durch Zentrifugation bei 35.000 × g für 10 min. wieder aussetzen des Niederschlags in 1 mL trocknen DMF durch Ultraschallbehandlung (60 kHz, 240 W) für 1 min und Zentrifuge wieder bei 35.000 × g für 10 min. diesen Schritt zweimal wiederholen.
- Auflösen des Niederschlags in 200 µL trocknen DMF in einer Glasflasche. Hinzufügen von EDC (14 mg), HOBT (12,2 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) und DIPEA (16 µL) in die Durchstechflasche mit magnetischen rühren für 24 h
- Sammeln das Produkt durch Zentrifugation bei 35.000 × g für 10 min. Überstands entfernen und erneut aussetzen des Niederschlags in 1 mL DMSO und Zentrifuge wieder bei 35.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Zerstreuen, das Produkt in 0,2 mL DMSO und Speicher im Kühlschrank bei ~ 4 ° C vor dem Gebrauch.
3. Bioapplications DBCO-UCNs in der Verordnung der Membrankanäle in lebenden Zellen
- Kultur der HEK293 Zellen in Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) mit 10 % FBS, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin ergänzt und in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 ° c Seed 1 × 10 5 Zellen in 1 mL DMEM/Brunnen in einem 12-Well-Platte zu erhalten und bewahren Sie es in den Inkubator für 24 h
- Kombinieren das Plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µg) mit P3000 Transfection Reagens (2 µL) in Eagle ' s Minimum wesentlichen Medien (MEM) (100 µL) in Microcentrifuge Schlauch A, und fügen Sie Transfection Reagens (1,5 µL) in MEM (100 µL) im Rohr B.
- Die Mischung aus Lösungen in Tuben A und B für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Verbinden die Lösung in Röhre A und B mit 400 µL MEM. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL zweimal serumfreien DMEM.
- Fügen Sie die 600 µL Transfektion Mischung in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte und inkubieren Sie den Zellen bei 37 ° C Inkubator für 4 Std. Entfernen Sie das Medium und waschen zweimal mit 1 mL DMEM.
- 1 mL DMEM mit 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM in DMSO) in den Brunnen und halten Sie es für 2 Tage im Inkubator.
- Entfernen Sie das Medium und einmal mit 1 mL PBS waschen. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA (0,25 %) Lösung in jede Vertiefung des 12-Well-Platte und bei 37 ° C inkubieren Sie bis Zellen (~ 2 min) gelöst haben. Re Kultur der Zellen in einer konfokalen Petrischale mit 1 × 10 5 Zellen/Brunnen in 1 mL DMEM für Übernachtung.
- Des Mediums zu entfernen und fügen Sie 1 mL frische DMEM mit 2 µL DBCO-UCNs (50 mg/mL) in die Schüssel für 2 h bei 37 ° C. Für die konfokale Bildgebung waschen Zellen zweimal mit DMEM und 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) für 30 min.
- Für die intrazellulären Calcium-Analyse, inkubieren Sie die Zellen mit der Mischung von 1 µL Rhod-3 Uhr (10 mM), 10 µL Probenecid (250 mM) und 10 µL laden Puffer (Pluronic Tensid polyols,0.1% w/V)) in 1 mL DMEM Medium für 30 min im Dunkeln.
- Waschen der Zellen mit serumfreien DMEM und Bestrahlen mit 808 nm NIR Licht bei der Dosierung von 0,8 W/cm 2 für 20 min (5 min Pause nach 5 min Beleuchtung).
- Tragen die bildgebenden Ergebnisse auf das konfokale Mikroskop (Laserquelle: 561 nm Laser; Detektorbereich: 610/75 nm; Objektiv: 100 x 1,4 NA Öl, Belichtungszeit: 100 ms). Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA (0,25 %) Lösung in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C bis Zellen (~ 2 min) gelöst haben. Wieder aussetzen der Zellen in 1 mL PBS für Flow-Zytometrie (FCM)-Analyse (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
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Representative Results
Die schematische Syntheseverfahren von Kern-Schale Lanthanid-dotierte UCNs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und hochauflösenden Übertragung Elektronenmikroskopie (HRTEM) Bilder von Core- und Core-Shell UCNs Nanostrukturen bzw. gesammelt wurden (Abbildung 1). Die Liganden-freie UCNs sind durch das Entfernen der hydrophoben Ölsäure auf der Oberfläche des UCNs in saurer Lösung vorbereitet und mit hydrophilen Polymer (PAA) geändert. Dann sind die COOH-capped PAA-UCNs mit DBCO-NH2 durch eine Kondensationsreaktion Amid funktionalisiert. Die TEM-Bilder der Liganden-frei UCNs, PAA-UCNs und DBCO-UCNs sind in Abbildung 2dargestellt. Die dynamische Lichtstreuung (DLS), Zeta potential Ergebnisse und Großbildschirmen Lumineszenz (UCL) Spektren der DBCO-UCNs bzw. gesammelt werden (Abbildung 3). Die Fourier-Transformation (FTIR) Infrarotspektroskopie DBCO-NH2, PAA-UCNs und DBCO-UCNs sind in Abbildung 4dargestellt.
In Zelle Experimente bestätigt die erfolgreiche Expression von ChR2 auf der Zellmembran der offensichtlichen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Marker (Venus) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie (Abb. 5A). DBCO-UCNs sind speziell auf die Oberfläche des ChR2 exprimierenden HEK293 Zellen durch Klick Reaktion (Abb. 5A) lokalisiert. Die intrazellulären Calcium-Analyse bei NIR Lichtstimulation bestätigt auch konfokale Bildgebung und Flow Cytometry (FCM) auf Basis einer standard Leuchtstoffröhren Ca2 + Kennzahl, Rhod-3 AM (Abbildung 5 b, C).
Abbildung 1: Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierten UCNs. (A) schematische Darstellung des Syntheseprozesses von UCNs. (B, C) TEM des Kerns (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0,5/1 %)) und Kern-Schale (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs Nanostrukturen. Maßstabsleiste: 50 nm. Einschub: HRTEM Bilder von Core- und Core-Shell UCNs Nanostrukturen. Maßstab: 5 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Synthese von funktionalen UCNs Nanostrukturen. (A) schematische Darstellung des Syntheseprozesses Liganden-freie UCNs, PAA-UCNs und DBCO-UCNs, beziehungsweise. (B, C, D) TEM Bilder von Liganden-freie UCNs, PAA-UCNs und DBCO-UCNs. Maßstab: 100 nm in Gruppe B und 50 nm im Bedienfeld "" C/D. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. FTIR-Spektroskopie der DBCO-NH2, PAA-UCNs und DBCO-UCNs, bzw.. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Charakterisierung von DBCO-UCNs in Pufferlösung. (A) DLS-Ergebnisse der DBCO-UCNs. (B) Zeta mögliche Ergebnisse der PAA-UCNs und DBCO-UCNs (Mittelwert ± SD). (C) UCL Spektren von Core- und Core-Shell UCNs in Hexan (1 mg/mL), PAA-UCNs und DBCO-UCNs im Wasser (1 mg/mL) separat (Ex: 808 nm). Einschub: Lumineszenz-Foto von UCNs mit 808 nm Bestrahlung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Zelluläre Anwendungen des DBCO-UCNs bei NIR Licht Beleuchtung. (A) Confocal Imaging ChR2 exprimierenden N3-getaggt HEK293 Zellen mit DBCO-UCNs (oben) und PAA-UCNs (unten) für 2 h bei 100 µg/mL inkubiert. Grün: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), blau: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Maßstabsleiste: 20 µm. (B) zellulären Ca2 + Bildgebung mit Rhod-3 Uhr, vor und nach der NIR-Licht-Bestrahlung (0,8 W/cm2 für 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Maßstab: 10 µm. (C) Quantitative FCM Analyse der normalisierten Fluoreszenzintensität der zellulären Ca2 + mit verschiedenen leichten Dosierungen Beleuchtung (Mittelwert ± SD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieser Artikel hat ein Verfahren für die Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen (UCNs) und ihre Oberflächenmodifikation mit funktionalen Moieties für mobile Anwendungen vorgestellt. Dieses neuartige Nanomaterialien besitzt hervorragende optische Eigenschaften, die UV- und sichtbaren Lichts bei NIR leichte Erregung durch einen Multi-Photonen Großbildschirmen Prozess abgeben können. In diesem Protokoll, die Kern-Schale-UCNs-Nanostrukturen (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) sind bereit von einer Hochtemperatur-Co Niederschlag-Methode in einer Mischung aus Ölsäure und 1-Octadecene. TEM-Bilder zeigen die Morphologie dieser Kern und Kern-Schale-Nanokristalle sind kugelförmig mit einem Durchmesser von 20 nm und 30 nm bzw. impliziert eine Schalendicke von ca. 5 nm (Abbildung 1). Die Kern-Schale-Architektur ist auch durch die Bilder mit hoher Auflösung TEM im Einschub von Abbildung 1, die ähnliche Gitter Fransen mit derjenigen der Kern UCNs Nanostrukturen zeigt offenbart. Darüber hinaus einen typischen d-Abstände um 0,52 nm gut mit dem Abstand der (100) Ebene der β-NaYF4 stimmt, was darauf hinweist, dass die Core- und Core-Shell UCNs-Nanostrukturen höchst kristallisiert sind und die gleiche Kristallstruktur pflegen. Darüber hinaus die Großbildschirmen Lumineszenz Spektren zeigen die Kern-Schale-Nanokristalle Strahlen starke blaue Emission mit einer viel höheren Intensität bei 480 nm als die Core-Partikel nach Anregung mit einem Diodenlaser, eine kontinuierliche Welle bei 808 zu erreichen ( nm Abbildung 4). Die verstärkte Emission von Kern-Schale-UCNs ist zurückzuführen auf die unterdrückten Oberfläche abschrecken Wirkung von Yb3 +, Nd3 +und Tm3 + -Ionen, die in der inneren Schicht der Kern-Schale-Nanokristalle21eingebettet sind. Diese Ergebnisse bestätigen nachdrücklich die erfolgreiche Vorbereitung der Lanthanoid-dotierten Kern-Schale UCNs Nanomaterialien in diesem Vorschlag.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in der Hochtemperatur-Co Niederschlag Synthese von diese Nanokristalle. Erstens sollte das zusätzliche Volumen der Lanthanoid-Ionen-Stammlösung im Syntheseprozess von Kern und Kern-Schale-UCNs streng kontrolliert werden (Schritt 1.1.2.2). Hohe doping-Ionen führt zu einer Konzentration im Zusammenhang mit Kreuz-Entspannung oder abschrecken Wirkung durch Ion-Ion Interaktion in der Nanokristalle21. Zweitens sollte die Temperatur gehalten werden, bei weniger als 50 ° C, komplette Keimbildung zu gewährleisten, nachdem NaOH und NH4F sind in den Kolben (Schritt 1.1.2.9 und Schritt 1.2.9), der entscheidend für eine einheitliche Morphologie zu gewährleisten, durch die Förderung von Kristallwachstum basierend auf Ostwald ist hinzugefügt reifende Effekte22. Drittens können die Größe und die optischen Eigenschaften von Kern-Schale-Nanopartikeln hauptsächlich durch Anpassung der Höhe der Lanthanoid-Ionen in den Vorläufern der Schale (Y3 + und Nd3 +) und als vorbereitet Kern Partikel (Schritt 1.2.1) gesteuert werden. Es ist auch wichtig, dass die Morphologie von Kern-Schale-Nanokristallen auf dem anisotropen Shell Wachstum der verschiedenen Arten von Core-Partikel basiert, die eignet sich für die Modulation der unterschiedlichen optischen Emissionen von UCNs bei NIR Beleuchtung23.
Darüber hinaus ist es auch eine erhebliche Herausforderung effektiv hydrophobe UCNs in hydrophilen UCNs Nanopartikel für weitere biologische Anwendungen konvertieren. Obwohl einige Methoden zur Verbesserung der Biokompatibilität von UCNs in Pufferlösung, gemeldet wurden einschließlich Ligand Austausch, Silica Beschichtung, Oleate-Deckelung Liganden Oxidation, etc., leiden sie unerwartete Aggregation, zeitaufwendig, und komplexe Verfahren24,25,26. Hier entwickeln wir eine einfache Methode um Wasser dispergierbar Liganden-freie UCNs Nanostrukturen zu erhalten durch das Entfernen der Ölsäure auf der Oberfläche des Oleate-capped UCNs in einer Säure-Wasser-Lösung (pH = 4). Der pH-Wert von HCl eingestellt ist entscheidend für die Freigabe des Oleate Liganden Steuern und die Leuchtkraft der UCNs beeinflussen. Noch wichtiger ist, eine biokompatible Polymer (Polyacryl Säure, PAA) mit einer großen Anzahl von Carboxylgruppen, die Gruppen mit der Lanthanoid-Ionen auf der Oberfläche des UCNs durch Koordination Zusammenspiel verbinden können, die weitere funktionelle Gruppen für weitere chemische zur Verfügung stellt Änderung. Daher funktionalisieren wir DBCO-NH2 Moieties auf der Oberfläche des UCNs für weitere spezifische N3-Zellmembran Lokalisierung getaggt. Die TEM-Bilder der Liganden-freie UCNs, PAA-UCNs und DBCO-UCNs in Abbildung 2 zeigen die große Dispersität und Löslichkeit von diesen Nanostrukturen in Pufferlösung nach Oberflächenmodifikation. Darüber hinaus wurde Fourier Transform (FTIR) Infrarotspektroskopie durchgeführt, um die Oberflächenmodifikation von DBCO Gruppen auf UCNs Nanoplatform zu charakterisieren. Wie in Abbildung 3dargestellt, ist die starke Band um 3.430 cm-1 aufgrund der H-O stretching Vibrations der Carboxylgruppen, und die beiden Bands zentriert auf 1550 cm-1 und 1458 cm-1 sind verbunden mit der asymmetrischen und symmetrische Dehnung Schwingungsmoden der Carboxylat Anionen, zeigt die erfolgreiche Beschichtung von COOH Gruppe-haltigen Polymeren (PAA) auf der UCNP Oberfläche. Nach Reaktion mit DBCO-NH2 Moieties ist eine offensichtliche Band bei 1.635 cm-1 basierend auf der C = C-stretching Vibration auf dem aromatischen Ring von DBCO Gruppen, die steht im Einklang mit dem FTIR-Spektrum des DBCO-NH2 Moieties zur gleichen Wellenzahl. Darüber hinaus zeigt das dynamische Lichtstreuung (DLS) Ergebnis den erhöhten hydrodynamischen Durchmesser des DBCO-UCNs in wässriger Lösung (96.4±10.4 nm) (Abb. 4A). Die Zeta potenziellen Ergebnisse zeigen auch die negativen Oberfläche der PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) und DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) bzw. (Abbildung 4 b), zeigt die große Löslichkeit und Stabilität der diese Nanostrukturen in Pufferlösung. Darüber hinaus die UCL-Spektren von PAA-UCNs und DBCO-UCNs zeigen, dass sie ähnliche hochkonvertiert Emission bei 480 emittieren nm auf 808 nm Lichteinstrahlung (Abbildung 4), die für weitere NIR Licht-vermittelten Photoaktivierungen in biologischen genutzt werden können Systeme.
Darüber hinaus als ein Proof-of-Concept, um die Bioapplication der funktionalisierten UCNs in lebenden Zellen zeigen eine Licht-gated Kanal-Protein (ChR2) auf der Zelloberfläche, die Zellfunktionen regulieren durch Vermittlung des Zustroms von Ionen kationen entwickelt (z.B. Ca2 +) in das Zytoplasma27,28,29. Die erfolgreiche Expression ChR2 auf der Membran der Zelllinie HEK293 bestätigt das Vorhandensein des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Markers (Venus) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie (Abb. 5A). Darüber hinaus die Lokalisierung von UCNs auf der N-3-tagged Zellmembran ist offensichtlich auf der Zelloberfläche (blau) nach 2 h Inkubation, die darauf zurückzuführen sind, die die verbleibenden DBCO Gruppen auf der Oberfläche von UCNs Nanostrukturen mit gefärbt sind visualisiert ein Azid-haltigen Fluoreszenzfarbstoff (5-Carboxytetramethylrhodamine-Azid, Rhod-N3) durch die kupferfreie Bioorthogonal klicken Sie auf die Reaktion. Darüber hinaus NIR Licht (808 nm) wird genutzt, um die lokalisierten UCNs Nanotransducer auf der Zelloberfläche bestrahlen die aktivieren könnenLicht-gated ChR2 Kanal-Proteine und Ca2 + -Ionen Zustrom durch die Membran erleichtern. Wie in Abbildung 5 bgezeigt, ist eine signifikante Erhöhung der rote Fluoreszenz in das Zytosol beobachtet von einem fluoreszierenden Ca2 + Standardindikator, Rhod-3 bin, während keine offensichtliche Fluoreszenz-Inkrement bei fehlender Beleuchtung aufgenommen wird. Analyse der quantitativen Zytometrie (FCM) in Abbildung 5 zeigt auch, dass solche NIR-Licht-responsive Fluoreszenz-Erweiterung ist Licht-Dosis-abhängige, eindeutig darauf hindeutet, dass die biokompatible DBCO-UCNs effektiv regulieren können die Kanalproteine auf der Zellmembran bei NIR-Licht-Bestrahlung.
Zusammenfassend lässt sich sagen basierend auf den oben genannten Ergebnissen, erwarten wir, dass dieses Protokoll nicht nur detaillierte experimentelle Verfahren für Hochtemperatur-Co Niederschlag Synthese von Kern-Schale UCNs Nanostrukturen bietet, sondern auch eine einfache entwickelt Technik für biokompatible Oberflächenmodifizierung von UCNs für weitere NIR Licht-vermittelten Photoaktivierungen in Anwendungen in der Biologie. Noch wichtiger ist, basierend auf die Beweggründe für diese Methode, die optischen Eigenschaften der UCNs weiter einstellbar durch Dotierung verschiedener Lanthanoid-Ionen (z.B.Erbium (III), Holmium (III), etc.) in den Kristallen zu emittieren UV, grün, rot, und NIR Licht auf 808 nm Lichteinstrahlung30. Darüber hinaus kann die UCNs Oberfläche mit verschiedenen funktionellen Gruppen (z.B., Peptid, Protein, Lipid, targeting Liganden, etc.) für weitere biomedizinische Anwendungen31,32geändert werden. Diese Vorteile können machen biokompatible UCNs Nanomaterial einen geeigneten Kandidat für das Studium der physiologischen Prozesse in Vitro und in Vivo, und somit als personalisierte Nanomedizin für klinische Theranostik in der Zukunft.
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Disclosures
Wir haben nichts zu veröffentlichen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) und (RG 35/15) in Nanyang Technological University, Singapore und National Natural Science Foundation von China (NSFC) (Nr. 51628201) vergeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
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