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ce protocole suit approuvés dans des expériences : les humains (1) par l’éthique Comité de Monash Centre médical et les animaux (2) par le Comité d’éthique de l’Université de Melbourne.
1. Lavage broncho-alvéolaire (LBA) Macrophages
- BAL d’usage pour obtenir les macrophages pulmonaires en : (1) homme soumet par bronchoscopie 6 et la souris (2) à l’aide d’aspiration trachéale intra 13 .
NOTE : Acquisition des macrophages entraîne généralement une activation de ces cellules. Les macrophages proviennent de patients qui nécessitent une bronchoscopie pour enquêter sur un éventuel problème médical et pas tous les sujets peuvent convenir pour l’analyse des METs (cela devra être déterminé pour chaque projet).
- Prendre la solution de BAL et la centrifuger (500 x g pendant 10 min) pour former une boulette, laver deux fois avec le milieu de culture (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) avec 5 % de sérum de veau foetal et 1 % L-glutamine) à température ambiante et puis diluer dans 4 mL de medi de culture des cellules Umm.
- Si nécessaire, demande officielle numération différentielle ; la plupart des cellules (généralement > 80 %) seront des macrophages 6.
NOTE : Ceci sera généralement interprété par un service clinique histologie l’aspect morphologique des types différents de cellules 6.
- Effectue une cellule viable macrophage compte sur la solution de BAL utilisant le bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre.
NOTE : Solution de BAL est obtenue chez l’homme et de la souris comme indiqué à l’étape 1.1.
- Ajouter 1-4 x 10 5 macrophages aux plaques 24 puits sur lamelles couvre-objet en 500 µL de milieu de culture par puits et laisser une nuit à 37 ° C ; les cellules respectera les lamelles couvre-objet. Pour les échantillons humains, ajouter des antibiotiques (par exemple, la pénicilline et la streptomycine, 10 4 U/mL) pour prévenir la contamination bactérienne.
2. Immunofluorescence Labeling/microscopie des Macrophages BAL
Remarque : les cellules sont respectées sur les lamelles comme indiqué plus haut.
- Enlever le milieu de culture et laver les cellules avec en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Difficulté des cellules dans le fixateur de paraformaldéhyde/periodate/lysine (PLP) de 2 % pendant 10 min.
- Laver les cellules brièvement dans du PBS et puis permeabilize à 0,2 % Tween 20 dans du PBS pendant 20 min.
- Cellules de bloc de sérums de poulet 10 % à 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dilué dans du PBS pendant 30 min.
Anticorps - incuber avec contrôle primaire et isotype pendant 1 h à température ambiante à des concentrations de 1/100 (plus de détails spécifiques sont répertoriés dans la Table des matières) à 37 ° C.
Remarque : Pour les échantillons de BAL, un marqueur spécifique des macrophages est habituellement pas nécessaire.
- Après l’ajout d’anticorps primaires, laver les cellules dans du PBS et incuber encore avec l’anticorps secondaires correspondants pendant 40 min à température ambiante.
- Laver les sections dans PBS et monter avec milieu de montage à base DAPI de visualisation en utilisant un microscope confocal (comme mentionné ci-dessus) au laser les excitations 405, 488, 561 et 647 nm et un 40 X, 1,0 NA huile objectif.
3. Des échantillons de tissus pulmonaires
Remarque : pour les études in vivo des tissus pulmonaires, étudier les échantillons après l’exposition pertinente (par exemple, tel que décrit par O ' Sullivan et al. 7). l’exposition qui est le plus pertinente pour cette expérience sont les micro-organismes infectieux, en particulier les bactéries. Les souches de souris qui pourraient être utilisés pour cette méthode sont les souris C57BL/6 ou BALB/c, 10-12 semaines, poids 25 à 30 g et mâle.
- Euthanasier souris, via une injection intrapéritonéale de kétamine (400 mg/kg) et de xylazine (40 mg/kg). Ouvrir la cavité thoracique et exposer les poumons et le cœur à l’aide de ciseaux et pinces chirurgicales.
- En infusion chaude PBS à l’aide d’une aiguille de calibre 21 dans le ventricule droit de laver le sang des vaisseaux pour 30 s, puis laisser infuser 10 mL de fixateur PLP 2 % pendant 30 s (dans le ventricule droit).
- Utilisez chaud PBS (42 ° C) pour lavage de la cavité thoracique ouverte. Intubation de la trachée avec une aiguille de calibre 21 et un bout de tube de 0,8 mm coupé à la taille et à injecter 800 µL de préchauffé (à 42 ° C), à bas point de fusion point solution à 3 % d’agarose.
- Tie au large de la trachée avec de la soie tressée (USP 4.0). Placez le fil autour de la trachée, juste en dessous du point d’insertion de la canule et fixez-le via un nœud simple. Pour solidifier l’agarose, administrer des PBS glacée autour des poumons. Retirer les poumons et le cœur comme une pâté de maisons de la cavité thoracique à l’aide de ciseaux et dissection non tranchante. Retirez chaque poumon individuellement et puis corrigez-les pendant 16 h 2 % PLP ou formol à 4 ° C.
- Stocker les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu’au tissu de sectionnement. Ces méthodes d’obtention des tissus pulmonaires ont été décrites précédemment 13.
- Pour préparer le tissu pulmonaire échantillons utilisent les étapes suivantes.
- Tissus de tissus (réséqués à l’étape 3.1) fix pulmonaires dans 10 % de formol tamponné naturelles pendant 24 h à température ambiante. Transfert à 75 % d’éthanol et mettre dans un robot de tissu sur un cycle de 12 h, (2,5 h à 75 % EtOH, 3 h en EtOH absolue, 3,5 h à solvant 3 b et pendant 3 h à la paraffine).
- Embed en paraffine standard pour créer des blocs (FFIP) fixés au formol, paraffine, qui sont stockés à température ambiante.
Remarque : À ce stade, il est généralement commode couper les sections de poumon pour lames standards.
- Couper les sections de poumon FFIP à 4-5 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et monter sur facturé, enduits diapositives comme décrits par O ' Sullivan et al. 7
- montage de diapositives, mettre 3 gouttes de milieu de montage sur les lamelles de 60 x 24 mm (taille 1.5), inverser la diapositive sur la lamelle couvre-objet et faire sortir l’excès du milieu. Hermétiquement sceller avec du vernis à ongles et conserver à température ambiante.
4. Préparation/microscopie des échantillons de tissu de poumon
- à la cire, réhydrater et prétraitement de l’échantillon de tissu de poumon FFIP avec la solution de l’antigène.
- Anhydre le FFIP glisse pendant 60 min à 60 ° C. Mettez ensuite les lames dans une solution de xylène pour 30 min et le transfert de solution d’éthanol 70 % pendant 5 min à température ambiante. Rincer à l’eau du robinet.
- Place dans une pellicule plastique résistant à la chaleur et sous réserve de la recherche d’HIER-antigène dans un autocuiseur pendant 10 min à 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Cool pendant 20 min. Laver deux fois dans l’eau du robinet pendant 5 min sur un rocker, puis une fois avec du PBS sur base berçante.
- Bloc avec du sérum de poulet de 10 % à 5 % BSA/PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Tacher le tissu.
- Pour définir les METs dans les macrophages, ajouter des anticorps primaires (MMP-9, H3Cit et F4/80) à 1 % BSA/PBS pendant 16 h à 4 ° C à la dilution de 1/100 (des détails précis sur les quantités d’anticorps sont répertoriés dans la Table des matières). Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min sur une base berçante.
Anticorps - Achieve détection par fluorescence par incubation avec secondaires correspondant à 1 % BSA/PBS pendant 40 min à température ambiante. Les anticorps sont : anti-souris poulet (1) 488 (vert), anti-chèvre poulet (2) 594 (rouge) et (3) âne anti-souris 647 (rouge sombre).
- Laver les sections dans du PBS et monter avec DAPI-contenant du milieu de montage pour la coloration de la chromatine.
- Obtenir les images fluorescentes utilisant un laser confocal à balayage tête attachée à un microscope inversé.
Lasers nm
- Excite la préparation avec la 405, 488, 561 et 647. Capturer des images de 512 x 512 pixels seul plan en cliquant sur la ligne séquentielle, nivellement button (2 ligne moyenne) à l’aide de 20 X 0,1 air de NA et NA 40 X 1.0 huile objectifs.
- Obtenir au moins dix champs de vue par la section d’analyse et de données pour chacun des résultats (c.-à-d. 10 haute puissance champs de vision (HFOV) pour le contrôle, 10 pour l’échantillon stimulée, etc., pour chaque souris).
Remarque : Pour obtenir un échantillon représentatif de l’ensemble du domaine, un système de matrice peut être utilisé dans laquelle le domaine est divisé en différentes sections et pour chaque échantillon différent la même matrice est utilisée pour sélectionner des champs de vue (par exemple, le champ peut être divisé en 9 sections et sur le centre et les 4 coins, deux VOHF sont prélevés).
5. En trois dimensions (3d) imagerie de METs
Remarque : METs étant 3D structures, en prenant plusieurs z-pile des images, qui sont reconstituées, peuvent donner des informations précieuses.
- Section les spécimens de poumon de blocs de paraffine, à 200 µm en utilisant un vibratome à une amplitude fixée à 1,8 mm et la vitesse de 0,1 à 0,5 mm/s.
- Bloc de tissu pulmonaire avec 20 % du sérum respectif (10 % de sérum de veau foetal et le sérum de poulet 10 %) et ensuite permeabilize dans du PBS complétée et 3,75 % Triton X 100 de 7 h à température ambiante sous agitation modérée.
- Tacher les sections pendant 16 h à 4 ° C avec les anticorps primaires pertinentes (MMP-9, H3Cit et F4/80) dans 200 µL de volume dans des tubes de microcentrifuge (concentrations d’anticorps sont répertoriées dans la Table des matières).
- Laver les sections dans du PBS, 3 fois pendant 10 min avant l’incubation avec l’anticorps secondaires pertinents à température ambiante pendant 1 h.
- Tacher les sections de poumon pour DAPI (1:5 000) dans la solution pendant 20 min, avant d’ajouter les lamelles au microscope slides dans du PBS.
- Obtenir des images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal inversé (40 x 1.3 NA) équipé de 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm et 635 nm lasers.
- Enregistrer 3D z-piles de 0,54 µm d’épaisseur avec z-découpe optimale pour l’objectif 40 x 1,3 à huile NA.
Remarque : Le logiciel utilisé variera selon le microscope individuel. Un exemple de comment le logiciel peut être utilisé pour un microscope est fourni en supplémentaire 1 fichier.
6. Analyse d’image
Remarque : l’analyse des échantillons nécessite l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’imagerie spécifique et exemples sont répertoriés dans la Table des matières. Alors que le programme spécifique utilisé dépendra de l’analyse des résultats, les points énumérés ci-dessous sont importants.
- Analyse des BAL échantillons
- définir le nombre de macrophages en sélectionnant la couche bleue pour DAPI et en assignant une taille minimale pour les cellules (par exemple, > 18 µm de diamètre). Grâce au logiciel pertinent, mesurer le nombre de macrophages par domaine.
- Compter le nombre de cellules qui présentent les caractéristiques d’une EMU par la présence de chromatine extracellulaire détectée par DAPI avec co-expression d’autres marqueurs (par exemple, MMP12, PAD2 et H3Cit).
Remarque : Le nombre de marqueurs qui peuvent être analysées dépend du nombre de lasers disponibles, mais idéalement en plus DAPI, au moins deux autres marqueurs doivent être inclus. Les autres produits moins les paramètres spécifiques à l’expression de la MET (p. ex., nombre de cellules avec la chromatine extracellulaire et un noyau élargi) peut être utilisé.
- Pour comparer l’expression MET en BAL échantillons (entre le contrôle, fumée et groupes de fumée/DNase traité), analysent un minimum de 100 macrophages BAL par exemple.
- Pour mesurer les anticorps secondaire et isotype contrôler les niveaux de fluorescence ; mesurer un minimum de 100 cellules dans chaque échantillon pour leur fluorescence. Mesurer le niveau moyen de la fluorescence de fond pour chaque marqueur (par exemple, H3Cit) à l’aide de logiciels standard.
- Pour définir l’expression MET, compter les cellules avec le phénotype typique (p. ex., chromatine extracellulaire avec la co-expression de H3Cit et MMP9) et pour chaque MET, mesurer le degré de fluorescence des marqueurs (par exemple, H3Cit et MMP9). Exclure les cellules produisant les METs si leur coloration n’était pas au-dessus du contrôle arrière-plan et isotype.
- Pour des échantillons humains de BAL, analyser un minimum de 100 cellules pour chaque échantillon pour le pourcentage des macrophages qui rendent les METs. Pour les échantillons murines, comme les cellules sont plus petites et les METs sont plus difficiles à définir, analyser un grand nombre de cellules pour chaque échantillon (par exemple, 200 macrophages).
- L’analyse des échantillons de tissus pulmonaires
- pour déterminer la présence de METs dans les tissus pulmonaires, utilisez le marqueur spécifique de macrophages par exemple F4/80.
- Définir la présence des METs dans les tissus pulmonaires à l’aide de la co-localisation de F4/80 dans les cellules qui expriment la chromatine extracellulaire avec d’autres paramètres figurant à l’article 6.1.
- Déterminer les niveaux de fluorescence de fond dans les échantillons avec l’anticorps secondaire et les contrôles de l’isotype. Exclure les METs d’analyse qui ne sont pas au-dessus de fond.