Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Объектив Бесплатные видео микроскопии для динамического и количественный анализ культуры адэрентных клеток

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

Объектив Бесплатные видео микроскопии позволяет нам контролировать клеточных культур непосредственно внутри инкубатора. Здесь мы описываем полный протокол, используемый для приобретения и анализировать 2,7 дня приобретения культивируемых клеток HeLa, ведущих к dataset 2,2 х 106 измерения отдельных клеток морфологии и 10584 клеточного цикла треков.

Abstract

Здесь мы показываем, что объектив Бесплатные видео микроскопии позволяет нам одновременно захватить кинетика тысяч клеток непосредственно внутри инкубатора, и что это возможно для мониторинга и количественной оценки одиночных клеток вдоль нескольких циклов клеток. Мы описываем полный протокол, используемый для мониторинга и количественной оценки культуре клеток HeLa 2.7 дней. Во-первых, приобретение культуры клеток производится с микроскопом объектив Бесплатные видео, и затем данные анализируются следующие четыре этапа: мульти волны голографической реконструкции, клетки слежения, клетки сегментации и деление клеток обнаружения алгоритмы. В результате мы покажем, что это возможно собрать dataset с участием более чем 10000 клеточного цикла треков и более чем 2 х 106 клеток морфологических измерений.

Introduction

Мониторинга культивируемых клеток млекопитающих на протяжении нескольких циклов клеток и точного измерения ячеек размер и клетки сухой массы является сложной задачей. Несколько лейбл бесплатно оптические методы могут выполнять эту задачу1,2: фазосдвигающие интерферометрии3, голографические цифровой микроскопии (DHM)4,5,6, 7, quadriwave боковой наклон интерферометрии8,9 и количественную фазу томография10,11. Эти методы привели к многие новые идеи в понимании клеточного цикла mammalian клеток. Однако они редко связаны с автоматической ячейки отслеживания алгоритмов и их пропускная способность остается ограниченным, при измерении ячейки массового траекторий1 (N < 20 соответственно3,4,5 , 6). Следовательно, Роман оптический метод необходим для измерения массы клеток траекторий с большой статистики (N > 1000).

В этой статье мы продемонстрировать способность объектива Бесплатные видео микроскопии одновременно изображения тысячи клеток непосредственно внутри инкубатора, и затем определить метрики одну ячейку вдоль тысячи отдельных клеточного цикла треков. Объектив свободный микроскопии является количественных этап визуализации технику, которая позволяет приобретение фазы изображения плотно упакованных клеток через очень большое поле зрения (обычно несколько десятков мм2, здесь 29,4 мм2)12,13 ,14,15. Определяются несколько метрик на уровне отдельной ячейки, например, ячейка области, клетки сухой массы, клетки толщина, длина главной оси клеток и клеточной пропорции12,15, от каждого изображения. Затем применив алгоритм отслеживания клеток, эти особенности могут быть отображены для каждый single cell как функция время эксперимента,14,,15. Кроме того выявляя возникновение клеточных делений в ячейке треков, можно извлечь другие важные сведения, такие как первоначальная клеточная сухой массы (сразу после деления клетки), окончательный клеточной сухой массы (непосредственно перед деление клеток) и клетки цикла, длительность, то есть, время между двух последовательных подразделений15. Все эти измерения может быть вычислена с очень хорошей статистики (N > 1000) поскольку большое поле зрения обычно позволит анализ 200 до 10 000 ячеек в одной свободной объектив приобретения.

Для того, чтобы объяснить эту методологию, основанную на объектив Бесплатные видео микроскопии, мы описываем протокола для мониторинга и количественной оценки культуре клеток HeLa 2.7 дней. Анализ данных является 4 ступенчатый процесс, основанный на мульти волны голографической реконструкции, отслеживания клеток, клеток сегментации и деление клеток алгоритмов. Здесь показано, что пространственное разрешение и относительно высокой частоте кадров (одно приобретение каждые 10 минут), полученные с этой установки объектива Бесплатные видео микроскопии совместим с стандартных алгоритмов клеток отслеживания. Полный анализ этого набора данных приводит к измерение 10,584 клеток треков на полных цикла клетки.

Подводя итог, объектив Бесплатные видео микроскопии является мощным инструментом автоматически контролировать тысячи неподписанных, несинхронизированные и неизмененной клетки за эксперимент; Каждая ячейка, отслеживается в течение нескольких циклов клеток. Таким образом, наши измерения обеспечивают среднее значение нескольких параметров клеток, но что более важно, между клеток изменчивость над большой популяции клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. клеточная культура мониторинг приобретения

  1. Рост клеток HeLa в среде DMEM + глютамин (например, GlutaMAX) средний, дополненная 10% (v/v) тепло инактивированная плода теленка сыворотки и 1% пенициллина и стрептомицина.
  2. Покройте 6-ну дно культуры стекла с фибронектина (25 мкг/мл) за 1 ч. Затем семена 2 х 104 клетки на хорошо.
  3. В процессе приобретения измените носитель каждые 3 дня.
  4. Промежуток времени приобретения используйте видео объектив свободный Микроскоп (коммерчески доступных).
    Примечание: Это на основе изображений, объектив свободной вычислительной технике как описано Ozcan и др. 16 , который был изменен для выполнения постоянного мониторинга в инкубаторе при контролируемой температуре 37 ° C12,15. К услугам гостей комплементарный металло-оксидный полупроводник (CMOS) сенсор с пикселей 1,67 микрон и площадью изображений 6.4 x 4,6 мм2. Несколько волн освещение обеспечивается multichip света Светоиспускающий диод (СИД) устройство, которое обеспечивает освещение красного, зелёного и синего. Длины волн центрируются, 636, 521 и 452 Нм соответственно с спектральный 25, 45 и 25 Нм соответственно. Красный зеленый синий (RGB) светодиоды расположены выше 150 мкм обскуры на расстоянии приблизительно в 5 см от клеток. Силы света, измеренная рядом светодиод как низко как 10 мкВт на каждой длине волны и время освещения только одну секунду на приобретение. Следовательно никаких проблем фото токсичность, как ожидается, когда клеточных культур наблюдаются под микроскопом объектив Бесплатные видео.
  5. Поместите контейнер культуры клеток, положить в контакте с CMOS-датчик (рис. 1). Используйте контейнер с стекла coverslip внизу, которая имеет важное значение для качества приобретения объектив бесплатно. Можно также использовать пластиковые контейнеры, но приобретения свободной объектив будет ухудшаться вследствие плохой оптическое качество этих контейнеров.
  6. Управление видео объектив свободный Микроскоп с приобретения программного обеспечения (коммерчески доступных), который выполняет промежуток времени приобретения и голографической реконструкции. Параметры, которые должны вводиться пользователем в интерфейсе программного обеспечения являются частота кадров, продолжительность эксперимента и тип клеточной культуры, т.е. адэрентных клеток или плавающей клетки.
  7. Входных параметров, приобретение программного обеспечения. Задайте частоту кадров присвоено одно приобретение каждые 10 минут и установить «приверженца» тип культуры клеток.
    Примечание: Частота кадров одного приобретения каждые 10 минут представляет собой хороший компромисс, поскольку она обеспечивает надежный ячейки отслеживания в то время как размер результирующего набора данных для анализа по-прежнему разумным. Быстрый частоты кадров достижимые с этой установки объектива бесплатно микроскопии — одно приобретение каждые 5 минут. Дальнейшее увеличение частоты кадров приводит к чрезмерного нагрева CMOS сенсор, который может влиять на жизнеспособность клеток в культуре.
  8. Запустите промежуток времени приобретения, и голографической реконструкции алгоритм (коммерчески доступных) будет автоматически обрабатывать свободной объектив приобретения для получения изображения этапа культуры клеток. Голографические реконструкции алгоритм основывается на нескольких волны фазы поиска алгоритм17 и обеспечивает реконструированный фазы изображения RGB в диапазоне [-π, + π] для каждой одной ячейки над большое поле зрения 29,4 мм2. Принцип свободной объектив в линии голографии является освещать тонкий образец (z = 0) с плоской волны (амплитуды 1 после нормализации) и для обнаружения на CMOS-датчик изображения интенсивность последующих дифракции на короткое расстояние z = Z, обычно в 1 мм после Пример. В нашей установки, освещение последовательно переключается на 3 длинах волн (λ1= 0,450 мкм, λ2= 0.540 мкм, λ3= 0.647 мкм) для измерения три модели дифракции той же пробы.

2. клетки культуры анализ данных

  1. Для отслеживания ячейки, используйте Trackmate алгоритм, открытым исходным кодом Фиджи плагин для автоматизированного отслеживания одной частицы18. На первых, загрузить полный промежуток времени приобретения в Фиджи (нагрузки изображений последовательности команд). Ввиду большого размера наборов данных, который имеет обычно 400 RGB кадры 29,7 МБ, это быстрее, чтобы загрузить их в 8-битном формате. Далее модуль Trackmate Фиджи проводит пользователя через несколько этапов алгоритма отслеживания клеток, а именно стадии обнаружения клетки, стадии трекера ячейки и несколько фильтров, применяемых к обнаружений клеток и вычисляемые треков. На каждом этапе настройки алгоритмов и отображать результаты сразу так, что, при необходимости, одно могут легко перемещаться вперед и назад перенастраивать параметры. Различные меню интерфейса Trackmate показаны на рисунке 2 с фактические параметры, используемые для эксперимента клетки HeLa.
  2. Задайте входные параметры приобретения программного обеспечения как после (см. Рисунок 2). Установите оценкам blob диаметром до 15 пикселей, детектор порог до 0,25, увязки максимальное расстояние до 15 пикселей, разрыв закрытие Макс расстояние до 15 пикселей и количество мест в треки 3.5.
    Примечание: Эти параметры будут явно отличаются от одного эксперимента на другой, особенно «оценкам blob диаметр» которая соответствует размер ячейки (приведены в пикселях 1,67 мкм). То же замечание относится к «ссылок Макс расстояние», которых приходится максимальное расстояние, пройденное ячейки в течение двух последовательных кадров (приведены в пикселях 1,67 мкм). Его оптимальное значение будет зависеть от подвижности клеток, но также на плотность клеток.
  3. В конце процесса отслеживания клеток, генерировать результаты в виде трех текстовых файлов («Анализа» кнопку, см. Рисунок 2). Наиболее полезным файл, названный «Места в статистике треки», состоит из таблица с перечнем всех обнаруженных клетки с их соответствующие (x, y) позиции по приобретению, их номер кадра и их номер трека. На основе этих данных выполняют клетки сегментации и выявления клеточных делений, с помощью специальных алгоритмов (см. файлы дополнительного кода). Два других файлов названы «Ссылки в статистике треки» и «Отслеживать статистику» и включают все результаты, касающиеся треков, например трек длительностей, количество обнаруженных недостатков, отслеживать начальный кадр, и т.д.
  4. Использовать алгоритм сегментации клеток (см. дополнительный код файл) автоматически извлечь несколько метрик, описанием морфологии клеток из реконструированных фазы изображения. Эти метрики являются площадь поверхности клетки (S), клетки главной оси Длина (L), клетки малая ось Длина (l) и пропорции клеток (L/l). Фаза, оправился от свободной объектив микроскопии пропорциональна плотности и толщины слоя образца, как обсуждалось ранее,15.
  5. Помимо морфологических особенностей ячейки экстракт количественных клетки сухой массы (МЧР) измерения из реконструированных этап13,19,20
    Equation 1Уравнение (1)
    где φ(x,y) это реконструированный фазы сдвиг19, длина волны λ и α = 1.8 x 10-4 м3/кг конкретных преломления, который касается изменения показателя преломления для сухой массы1, 19.
  6. Оцените толщину ячейки с помощью оценки разницы между клеток преломления и что средства массовой информации культуры. Связь между ячейки толщиной h(x,y) и измеренных фазовый сдвиг задается20:
    Equation 2Уравнение (2.1)
    Equation 3Уравнение (2.2)
    с Δn(x,y) = nклеток (x,y) - nсреднего (x,y), преломления разница между ячейкой и культуры средств массовой информации. В следующем, предположим постоянное значение Δn = 0,025, который оценивается от преломления, измеренная в ядрах клеток HeLa (n = 1.35511) и что фосфат амортизированное saline (PBS) культуры средств массовой информации (n = 1,33). Хотя толщина значение ячейки является лишь ориентировочной, поскольку она основана на предположении, его относительные различия имеют смысл и может быть использована для выявления деления клеток.
  7. Используйте специальный алгоритм (см. файл дополнительного кода) обнаружить возникновение клеточных делений и затем извлечь клетки треков, которые связаны с обнаруженного клеточных делений, чтобы обнаружить деления клеток, клеток с измеренной толщины, больше, чем 8 мкм сначала определяются, а затем проверить ли новая ячейка появляется тесно в пространстве и времени. Таким образом обнаружения клеточных делений опирается на двух надежных критериев. 21,22,на lensfree в промежуток времени приобретения23могут применяться альтернативные и более сложные методы обнаружения деление клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для процесса голографической реконструкции, светлое поле описывается скалярным полем A (где Equation 4 комплекс значение A на плоскости на расстоянии z из образца и боковой позиции Equation 5 и на длине волны λ). Распространения света моделируется Huygens-Френеля теории, которая предоставляет Пропагатор ядра Equation 6 . Таким образом, амплитуда поля на плоскости детектор, z связано с света амплитуда 0 , следующие отношения:
Equation 7т.е.Equation 8
с Equation 9 , где i — комплексное число (я2=-1)

Измерения интенсивности моделируется просто Equation 10 . Цель реконструкции алгоритма заключается в найти поле «хорошие» A0, относящиеся к наблюдаемой выборки, которых дифракционной будет соответствовать измеренной интенсивностью яz. Стратегия призвана рассмотреть фазу поле амплитуды φ детектор в плоскостиz как неизвестные проблемы и оптимизировать многоспектральных общей вариации критерий объекта. Более конкретно учитывая поля
Equation 11

Equation 12т.е.Equation 13
для любого этапа поле φz, Equation 14 идеально соответствует данных с Equation 15 . Таким образом, чтобы последующие поле Equation 16 является полем возможной амплитудой в плоскости образца, учитывая наблюдаемое интенсивности изображения. Это причина, почему критерий A0 используется для указания уникальное решение среди всех возможностей сопоставления данных. Критерий для сведения к минимуму был выбран в качестве:
Equation 17
где x и y являются координаты на плоскости, т.е. Equation 18 . С помощью такой критерий позволяет выбрать среди всех возможных областях, образец поле отображения острых кромок на той же позиции для всех длин волн, который физически значимым. Этот метод уменьшает возникновение Твин изображения в поле реконструированный 0. Твин изображения является важный артефакт, что результаты от недостатка информации этап в ходе процесса приобретения.

Для практических расчетов, интегралы дискретизации с пространственной выборки соответствует резолюции детектор, производные Собел операторами и извилины заменяются Huygens-Френеля Пропагатор Equation 19 выполняются путем идти в пространстве Фурье где Equation 20 имеет простое выражение: Equation 21 . Минимизация ε (реальный) критерий в отношении (реальные) набор переменных Equation 22 решается с помощью нелинейной конъюгированных градиента метод, который требует градиент ε должна быть вычислена для любого этапа, связанного с каждым детектор пикселей для каждого Длина волны.

Мобильный этапе реконструкции разверток
Рисунок 3 показывает результаты голографической реконструкции одного кадра промежуток времени приобретения НеЬа клетки в культуре. На рисунке 3a показывает полное поле зрения приобретения сырья в синий канал на площади2 29,4 мм. Основываясь на это изображение и те, которые приобрели в красный и зеленый каналы, голографические реконструкции производит RGB изображение фазы ячеек, как показано в цифры 3b и 3 c. Реконструированный фазы изображения экспонатов локально завернутый фазы артефакты, соответствующие клетки, которые индуцируют фазы сдвига превышает + π. Чтобы выполнить простой этап разверток, мы реализован эвристический среднее, а именно мы обнаруживаем Пиксели со значением Equation 23 превышает 0,3 и установить эти пикселей + π. Этот простой метод основан на свойстве реконструкции фаза изображения RGB. В теории в каждой точке мы должны измерять коэффициент Equation 24 равным Equation 25 . Но в случае митотическая ячейки, когда фазы переноса происходит, эта связь больше не поддерживается в изображении RGB реконструированный фазы (Рисунок 3f). Упомянутые выше эвристический метод использует это свойство, так что простой Бинаризация может использоваться для обнаружения пикселей, представляя фазы обмотки. Результаты реконструированный фазы изображения до и после развертки показано в цифры 3f и 3 g, соответственно. Эти без оболочки фазы изображения затем вводятся в алгоритм отслеживания клеток. Без этого распаковки шага алгоритм отслеживания клеток сможет обнаружить, что клетки в отделе и клетки большой толщины, который подорвет окончательные результаты. Разрешение изображения реконструированный фазы был оценкам около 5 мкм15 (полношаговыми пространственное разрешение), который является довольно грубый. Тем не менее можно наблюдать такие детали, как lamellipodia и мобильных цитоплазмы (цифры 3f и 3 g). Самое главное изображение, полученное путем свободной объектив микроскопии показывает большой контраст и освобождается гало артефактов. Это облегчает обнаружение автоматического клеток и клеток отслеживания.

Анализ данных культуры клеток
Для извлечения клеточного цикла отслеживает, анализ данных опирается на целый ряд различных алгоритмов, а именно ячейки отслеживания выполненных с плагином Trackmate Фиджи, обнаружение подразделений и, в конечном счете, извлечение клеток цикла треков, т.е. последовательность между двумя клеточных делений. В следующем мы обсуждаем качества результатов этих алгоритмов, когда по сравнению с ручной измерений.

Рисунок 4 показывает различные экране захватывает ячейка отслеживания результатов, результаты алгоритма обнаружения клеток и результаты анализа клеток отслеживания. Обнаружение клеток в объектив бесплатно приобретения (цифры 4a-4 c) является первым шагом алгоритма клетки отслеживания. Чтобы проверить алгоритм обнаружения клеток, мы вручную Аннотированная небольшую часть покадровой свободной объектив приобретения (214 кадров 663 x 663 мкм2). Мы вручную выбран в общей сложности 5365 клеток позиций и сравнить эти результаты с результатами, полученными на Trackmate Фиджи плагин. Рисунок 5 показывает результаты с точки зрения верно обнаружения, ложных срабатываний и негативы ложных. Результате чувствительность — около 96% и положительное прогностическое значение, как большой, как 99,7%. Эти высокие значения отражают хорошее качество реконструированный фазы изображений, полученных с установки объектива Бесплатные видео микроскопии. После обнаружения клеток, алгоритм сегментации клеток позволяет измерять — для каждой ячейки — несколько различных показателей, например область ячейки, ячейки сухой массы и толщины ячейки. Рисунок 6a изображен принцип алгоритма сегментации и Рисунок 6f показывает изображений сегментированной в последовательности времени для региона интерес 663 x 663 мкм2 (так же, как показано на рис. 5). Инициирует, алгоритм сегментации, ограничивание фазы изображения (см. Рисунок 6b) и затем он применяет посева процедуры (см. рис. 6 c). А именно пикселей в центре обнаруженных клетки присвоено значение соответствующего трека. X-Y позиции клеток и их соответствующий номер трека предоставляются в файле «Места в статистике треки», полученные после ячейки отслеживания. Затем итерационный наполнения процедура осуществляется расширяющий семян к границам ячейки (цифры 6 c-e) определяется начальный порог (Рисунок 6b). Эта процедура заполнения опирается на основные операции в математической морфологии, например, дилатация и эрозии. Результат сегментации затем можно вычислить несколько метрик на уровне отдельной ячейки, т.е. морфологические особенности как длина ячейки, ячейки области и пропорции клеток, но также, что более важно, клетки сухой массы согласно Уравнение 1. Для того чтобы оценить надежность микроскопии объектив Бесплатные измерения клетки сухой массы, мы сравнили образ свободной объектив реконструированный фазы фиксированной НеЬа клетки (рис. 6 g) с того же региона, полученные с помощью цифровой голографические микроскопия с 5 X цель (рис. 6 h). Рисунок 6i показывает ячейку сухой массы измеряется означает объектив бесплатно микроскопии как функция сухой массы, измеренная с DHM для 302 сегментирована НеЬа клетки. Существует хорошая корреляция между двумя измерениями (коэффициент определения R2 -0.86, склон = 0,9, смещение = pg-17). Из рис 6iмы можем оценить точность клетки сухой измерения массы с помощью микроскопии, объектив бесплатно. Точность, измеряется как среднеквадратическая ошибка между данными, объектив бесплатно и линейной fit, составляет около 16 pg.

При компиляции все измерения одна ячейка за полный промежуток времени приобретения, то это можно получить scatterplots несколько метрик как функцию от времени, как показано на рисунке 7. Эти scatterplots предоставить информацию о кинетике культивируемых клеток через очень большой численностью населения. Количество ячеек в поле зрения увеличивается с 2000 до 15 000 (рис. 7a). Умножается на число моментов времени, это приводит к большим набором данных 2,2 х 106 обнаружены клетки, каждая из них характеризуется его координаты и морфологические особенности, т.е. клетки сухой массы (рис. 7b), область ячейки (рис. 7 c) , сотовый средняя толщина (рис. 7 d), длина главной оси (рис. 7е) и пропорции (Рисунок 7f).

Важно отметить, что сочетание отслеживания ячейки и ячейки алгоритмы сегментации позволяет нам измерения кинетики на уровне отдельной ячейки. Например на рисунке 8 показан анализ ячейки отслеживать продолжительностью около 66 часов и экспонируется четыре клеточных делений на T0 + 4.1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36,7 h и T0 + 53,3 h. рис. 8А Показать результаты автоматического ячейки алгоритма сегментации, которая позволяет нам эффективно разграничить поверхности этой ячейки. Используя ячейки сегментации, можно вычислить несколько метрик как функцию от времени, например площади поверхности клетки (Рисунок 8b), клетки сухой массы (c на рис. 8), средняя толщина клеток (рис. 8 d) и ячейки подвижность (Рисунок 8e). Из этих графиков одно может четко измерить кинетики этих клеточных показателей между клеточных делений. В частности можно наблюдать увеличение площади ячейки и сухой массы в течение клеточного цикла. Кроме того, с помощью автоматического обнаружения клеточных делений, три различных клеточного цикла треки могут быть извлечены из этого трека и длительность клеточного цикла, т.е. за период между двумя отделами, может быть оценена. На треке одну ячейку, показано на рисунке 8, мы измерили три длительность клеточного цикла, а именно 16.4 h, 16.2 h и 16,7 h. компиляции всех клеточного цикла треки из анализа 2.7 дней промежуток времени приобретения результаты обнаружения 16725 клеточных делений и Описание 10,584 треков клеточного цикла. Затем можно измерить среднее и изменчивость продолжительности цикла клетки с звука статистики. Мы обнаружили, что распределение продолжительность цикла клетки рядом с нормальным распределением (Рисунок 9a) с среднее 16,5 h и относительной стандартное отклонение 12,4% (стандартное отклонение, измеренная на разделенных среднее распределение Гаусса пик ). Среднее время 16,5 h удвоения согласуется с длинами клеточного цикла, измеряется вручную на треке, представленные на рисунке 8. Это находится однако в нижнем диапазоне опубликованных значений для Хела удвоение время которого являются обычно между 20 и 30 h24,25,,2627. Однако в ссылку28, упоминается также за короткое время удвоения 16.2 ± 1,7 ч. С целью дальнейшего проверить наши измерения длин клеточного цикла и подтвердить надежность нашей свободной объектив микроскопии технику, мы выполнили ручного отслеживания 100 треков клеточного цикла (10148 клеток позиции). На cell цикл треков, полученные вручную (N = 100) измеренные клеточного цикла составляет 16.7±1.9 ч (N = 100, рис. 9b). Это очень близко к измерению 16.5±2.1 ч (N = 10,584) получил с автоматической ячейки отслеживания, демонстрируя действительность общего анализа. При сравнении ручного отслеживания траекторий в один определяется автоматически, мы обнаружили, что 67% клеточного цикла треков были успешно обнаружены и автоматически измерять длины цикла клеточного цикла хорошо связанный с теми, измеренная вручную (рис. 9b). Эффективность обнаружения траекторий клеточного цикла была измерена в первых 32 часов эксперимента, при плотности ниже 150 клеток/мм2. Этот уровень обнаружения очевидно уменьшается со временем, как клетки плотность увеличивается до ~ 500 клеток/мм2. Количество обнаруженных клеточного цикла треков достигает плато в T0 + 32 h (рис. 9 c) в то время как количество клеток по-прежнему увеличивается раза три между T0 + 32 h и T0 + 72 h (Рисунок 7а). Учитывая количество ложных срабатываний положительные и отрицательные, Рисунок 9b представляет 5 промахов очки: 4 из них из-за ложных отрицательных обнаружения (цикл длина > 25 h) и 1 в обнаружении ложных положительных (цикл Длина < 10 h). Чтобы получить этот результат, мы использовали высокий порог на толщину (8 мкм) в клеточного деления алгоритм обнаружения, чтобы пользу низкий уровень ложных положительных. Кроме того, были отфильтрованы треков, представляя несоответствия, т.е. клеточный цикл, продолжительность которого ниже 6 h и треки с сухой массы траектории, что не увеличивается линейно как функцию от времени. Они являются лишь 3% от общего числа треков клеточного цикла. В результате распределение длины клеточного цикла, полученные автоматически хорошо приближенная по Гауссу (рис. 9а) с низкой количество коротких треков (длина < 10 h, 5,1% от общего числа треков клеточного цикла), которые будут результатом false позитивные отдел обнаружений. Аналогичным образом, треки, отображение длинный клеточный цикл, который будет частично результаты от ложных отрицательных отдел обнаружений, также редки (клеточный цикл длина > 25 ч, 2,4% от общего числа треков). Ручного отслеживания траекторий клеточный цикл использовался также для дальнейшей оценки отслеживания ячейки, выполненных с плагином. Мы измерили на 6693 клетки общую точность локализации 1,6 мкм на точек сопоставления, которая находится в пределах 1 пикселями (1,67 мкм).

Другие параметры могут рассматриваться, как первоначальный сухой массы клеток (сразу после разделения), окончательный сухой массы (как раз перед деление клеток), а также средние темпы роста в течение клеточного цикла. Рисунок 9 d участки сухой массы начальной и конечной ячейки как функцию от времени. Это показывает, что оба начальной и конечной ячейки сухой массы уменьшаться с течением времени. Значение медианы начальной ячейки, сухая масса уменьшается от 223 pg вплоть до 130 ПГ и окончательный клетки сухой массы от 460 pg вплоть до 220 стр. Соотношение между двумя остается стабильным в 1,89 ± 0,12 в течение всего эксперимента (Рисунок 9 d-e). Наконец 9f рисунок показывает эволюцию клетки сухой массы прирост как функцию от времени над 10,584 треков клеточного цикла, и мы обнаружили, что снижение темпов роста клеток является общая тенденция для населения всей ячейки в этом конкретного эксперимента.

Figure 1
Рисунок 1: объектив бесплатно микроскопии. () схема установки приобретение объектива бесплатно микроскопии. (b) картина 6 скважин объектив Бесплатные видео Микроскоп. Она использует датчик изображения CMOS с пикселей 1,67 микрон и площадью изображений 6.4 мм x 4,6 мм = 29,4 мм2. Освещение осуществляется разноцветных светодиодов RGB наряду с точечным, размещены на расстоянии приблизительно в 5 см от образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: интерфейс Trackmate. Основные меню плагина, показано с фактические параметры, используемые для клеток HeLa эксперимент. Диаметр около больших двоичных объектов было присвоено 15 пикселей, детектор порог был установлен до 0,25, увязки максимальное расстояние было присвоено 15 пикселей, разрыв закрытие Макс расстояние было присвоено 15 пикселей и количество мест в треков было присвоено значение 3.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Голографические реконструкции процесса. () Raw приобретение НеЬа клетки в культуре с помощью объектива бесплатно микроскопии (полное поле зрения 29,4 мм2). (b) деталь (). (c) деталь (b). (d) RGB реконструкции фаза изображения (полное поле зрения 29,4 мм2). (e) деталь (d). (f) деталь (e). (g) фазы изображения получены после фазы развертки для сравнения (f), прежде чем развертки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рис: экран захватывает ячейка отслеживания результатов с помощью плагина Trackmate Фиджи. () результаты алгоритма обнаружения ячейки, которая основана на лапласиана детектор Гаусса (LoG). На рисунке показано полное поле зрения объектива свободный приобретения в T0 + 16h40min, в котором обнаруживаются 2,451 клетки. Последний окружены с фиолетовым круга. (b) результаты алгоритма клетки отслеживания. Все треки ячейки отображаются более 50 кадров (~ 8 часов) с код цвета, соответствующего средней скорости. (c, d) Подробное изображение (а) и (b) соответственно (желтый прямоугольник). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Проверка этапа обнаружения клетки клетки отслеживания алгоритма. () Купированные образ HeLa клеток в культуре (663 x 663 мкм2) где ячейка выбрана вручную отмечены голубые кресты и те обнаружены с алгоритмом клетки отслеживания, отмеченные красными крестами. Это позволяет определение ложных положительных обнаружения (красный кружок) и отрицательных ложных срабатываний (оранжевый круг). (b) скорость истинной обнаружения (зеленая линия), ложные положительные (красная линия) и обнаружения ложноотрицательные (оранжевый), выводятся как функцию от времени эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: результаты сегментации ячейки. () реконструирован фазы образа региона интерес промежуток времени приобретения в T0 + 7 h (663 x 663 мкм2). (b) алгоритм инициирует сегментации, бинаризация, которую фазы изображения (c) сегментации начинается с инициализации процедуры, т.е. установленных точках центра города обнаруженной клетки к значению соответствующего трека. (d-e) Далее и итеративно процедуры заполнения осуществляется расширяющий начального заполнения границ ячейки определяется начальный порог (b). (f) результат сегментации алгоритма показан для временной последовательности области мкм2 663 x 663 (так же, как показано на рис. 5). Сегментация отображается как окрашенной поверхности накладывается поверх изображения, реконструированный фазы. Отметить, что объектив свободный сигнал главным образом исходит от ядерного региона и сегментированных районы находятся недалеко от ядра. (g) реконструирован фаза полученная свободной объектив микроскопии в фиксированной НеЬа клетки. Это обрезанное изображение полное поле зрения 29,4 мм2. (h) фаза образ региона, показано на (g) полученные цифровые голографической микроскопии с 5 X цель (NA 0.12) освещается с помощью лазера на 647 Нм. (я) участок клетки сухой массы, полученные с помощью микроскопии, объектив бесплатно как функция сухой массы, измеряемая посредством Вывинтить. Рассеяния компилирует 302 клетки измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: анализ данных объектива свободный промежуток времени приобретения 2.7-день клеток HeLa. () общее количество клеток учитываются в полное поле зрения 29,4 мм2 как функцию от времени. (b) рассеяния клетки сухой массы как функция времени. На каждый бокс соответствующие бин 6 часов, красный Центральный знак указывает средний, и нижней и верхней границ поля указывают 25 и 75-й процентили, соответственно. Усы распространяется на самых крайних точек данных не считаются промахами. (c-f) Scatterplots ячейки сегментирована области (c), клетки средняя толщина (d), длина главной оси клетки (e) и пропорции клеток (f) как функцию от времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: анализ данных о траектории клеток 2.7 день (10 мин интервал кадра). () клеток сегментации исполнил на промежуток времени приобретения клетки трек, продолжительностью около 66 h. Клетки интереса отображается с синей накладкой. Каждый обрезанное изображение — 53 x 53 мкм2. Клеточных делений отображаются с желтой кругах. (b) участок области ячейки как функцию от времени. (c) время эволюции клетки сухой рассчитанная масса от integral этапа над районом сегментирована ячейки согласно уравнение (1). Толщина (d) участок средней ячейке вычисляется как функцию от времени согласно уравнение (2). Клетки толщина экспонатов острые пики, соответствующие клеточных делений (желтые круги в (а) и красные линии в (b-c-d-e)). (e) участок подвижности клеток как функцию от времени. (f) сегментации результаты, соответствующие до последнего кадра трека в T0 + 66h20min, когда плотность клеток около 475 клеток/мм2. Изображение является 200 х 200 µm2 сосредоточены на клетки интереса. Белые пятна (красные звездочки) соответствуют мусора клеток, которые появляются после одного дня культуры клеток. (g) 800 x 800 мкм2 обрезанное изображение реконструированный этап последнего кадра трека этой ячейки. Клетка интерес окружена желтым кружком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: анализ клеточного цикла. () распределение длительность клеточного цикла 2.7-день наблюдения за культурной HeLa клеток (N = 10, 584 клеток циклов). Распределение длительность клеточного цикла находится недалеко от Гаусса с среднее 16,5 часов и относительной стандартное отклонение, равное 12,3% (стандартное отклонение, измеренная на разделенных среднее распределение Гаусса пик). (b) сравнение между ручной и автоматической ячейки отслеживания для определения длины клеточного цикла. Ручного отслеживания включает 100 траекторий клеточного цикла (10148 клеток позиции). (c) распределение начиная время траекторий автоматически обнаруженных клеточного цикла. (d) участок, измеренной первоначальная клеточная сухой массы (сразу после деления клеток, черные точки) и окончательный клеточной сухой массы (как раз перед деление клеток, красные точки) как функцию от времени. На каждый бокс соответствующие бин 6 h, красный Центральный знак указывает средний, и нижней и верхней границ поля указывают 25 и 75-й процентили, соответственно. Усы распространяется на самых крайних точек данных не считаются промахами. (e) рассеяния окончательный ячейки сухой массы как функция первоначальный сухой массы. (f) эволюция клетки сухой массы прироста как функцию от времени эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: код «segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m». Этот Matlab код использует набор данных «trackmate» для выполнения сегментации клеток полный промежуток времени приобретения которых реконструированный фазы изображения сохраняются в папке «folder_out». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: код «lineage_Version_Jove.m». Этот код использует массив «trackmate», обработанных с алгоритмом сегментации клеток (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), чтобы извлечь траекторий клеточного цикла и определить различные параметры интерес, например., клетка Продолжительность цикла, первоначальная клеточная сухой массы и окончательный клетки сухой массы. Этот код состоит из двух частей, первая часть посвящена обнаружения деления клеток, и вторая часть с анализом траектории клеточного цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы покажем, что объектив Бесплатные видео микроскопии может использоваться внутри инкубатор для захвата кинетика тысяч клеток. Для того чтобы описать общую методологию, мы объяснили, как промежуток времени приобретения 2.7 день клеток HeLa в культуре могут быть проанализированы с стандартными алгоритмами клеток отслеживания. Результатом является набор показывая 2.2 x 106 клеток измерений и 10,584 треков клеточного цикла. Приобретений были исполнены на культуры клеток Hela с относительно большим расстоянием к ячейке (ячейка плотность < 500 клеток/мм2) и клеточной морфологии, которые могут быть аппроксимированы с диска. Эти две функции облегчают применение автоматического анализа клеток слежения, которая делает его возможным для сбора такого большого набора данных. Другие клеточные линии с меньшего расстояния к ячейке или более сложных морфологии будет сложнее отслеживать и последующие наборы данных будет меньше.

Мы считаем, что этот подход является интересным для многих исследований, например для пролиферации клеток и клеток размер исследований. Последние являются важной областью исследований в фундаментальных биологии и многие вопросы остаются без ответа, как красиво обсудили в обзоре Гинзбург и др. 29. Протокол, предложенные в этой работе обеспечивает таким образом средства для измерения важные метрики необходимых для клеток распространения исследования, т.е. Длительность клеточного цикла, сухой массы клеток, клеток сухой массы соотношение между концом и началом цикла и ячейки темпы роста сухой массы. Помимо изучения пролиферации клеток этот метод будет представлять интерес для изучения миграции клеток, так как он может производить большое количество треков, каждый из которых длится несколько часов. Настоящий Протокол выходит за рамки современных14,30 , демонстрируя в первый раз на приобретение тысяч клеток треков в течение более чем 10 h.

В заключение мы разработали easy-to-use объектив бесплатно технику, которая позволяет отслеживать одновременно тысячи клеток лейбл бесплатно в течение нескольких дней культуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы не имеют ничего подтвердить.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
  2. Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
  3. Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
  4. Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
  5. Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
  6. Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
  7. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
  8. Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
  9. Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
  10. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  11. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  12. Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
  13. Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
  14. Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
  15. Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
  16. Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
  17. Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
  18. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
  19. Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  20. Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
  21. Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
  22. Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
  23. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
  24. Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
  25. Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
  26. Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
  27. Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
  28. Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
  29. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
  30. Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).

Tags

Клеточная биология выпуск 132 микроскопия объектив бесплатно видео цитометрии плотной клеточных культур количественная микроскопия
Объектив Бесплатные видео микроскопии для динамического и количественный анализ культуры адэрентных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allier, C., Vincent, R., Navarro,… More

Allier, C., Vincent, R., Navarro, F., Menneteau, M., Ghenim, L., Gidrol, X., Bordy, T., Hervé, L., Cioni, O., Bardin, S., Bornens, M., Usson, Y., Morales, S. Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56580, doi:10.3791/56580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter