Summary
変形可能なそで壁付けマイクロ流路では、フロー制御、パーティクル処理、チャネル ディメンションのカスタマイズ、使用中に他の再構成を提供しています。我々 は、その形状を変更することができるピンの配列のそで壁付けマイクロ流路を作製する方法をについて説明します。
Abstract
マイクロ コンポーネントは、異なるキー マイクロ流体混合、分離、粒子トラップや反応などを実現するために様々 な形状を持つ必要があります。チャネル形状を維持しながら作製後も変形するマイクロ流路は高時空再構成できます。この再構成は、既存の「再構成」または「統合」マイクロ流体システムにすることが難しいこのようなキー マイクロ流体機能に必要です。長方形のピンの両端の横方向に一直線に並べられた配列から成る変形側壁とマイクロ チャネルの作製法について述べる。縦方向にピンを作動させるピンの端そしてこうして、離散化チャネルの側壁の形状を変更します。ピンのギャップは、メニスカス力によって引き起こされる隣のピンが付着したり不要な漏れを引き起こす可能性が。ピン ギャップが閉じ、エラストマーのバリアを伴う炭化水素-フッ素樹脂懸濁液ベースのギャップの充てんを紹介しています。再構成可能なマイクロ流体デバイスをこの強力な時空間チャネルで変位の流れを生成することができます。 またはチャネルのあらゆる領域で流れを止めることができます。この機能を促進し、オンデマンドでは、非-流体、気泡、粘性液体セルの処理作製の時に自分の存在や行動が知られている場合でも。
Introduction
マイクロ流体デバイス - マイクロ サイズ少量の液体とは、フローを制御する - は、増加の移植性と、多くの場合、手頃な価格の医学プロシージャの「チップ」形式に小型化を提供しています。最近レビュー1で解説した、スペースおよび肯定的な特徴から成る様々 なマイクロ コンポーネントを混合、分離、粒子捕捉反応など基本的かつ主要流体機能を実現するために開発されています。
一方、多くのマイクロ流体デバイスの動作は設計段階で決定されます、マイクロ流体デバイスのいくつかの種類は、構造や動作の製造後変更を許可します。ここで我々 はこの機能を「再構成」と呼びます。マイクロ流体システムの再構成は一般に時間とデバイスの設計に必要なコストを削減や時間の経過とともにマイクロ レイアウトや機能のカスタマイズを可能します。
再構成可能なマイクロ流体デバイスは、次の 3 つのカテゴリに分類を説明しました。最初に、エラストマー チャンネルの変形により流量、使用中に変更する方向。再構成を得るためには、エラストマーのチャンネルが空圧源2、点字アクチュエータ3、または4をシールの圧縮など様々 な外部で制御可能な力によって変形されます。配線の多層流体回路、磁気モジュラー チャンネルなどの可能なモジュラー デザインに再構成可能デバイス第二に、依存とチューブ ベース マイクロ5。第三に、デバイス自体は、再構成可能なないが電極アレイ (デジタル マイクロ流体として呼ばれる)6,7とハンギング ドロップ製マイクロ流体デバイス8液滴輸送は、オンデマンドを有効にします。流れや流体の経路の切り替え。
それにもかかわらず、これらの再構成の多くはトポロジカル巨視的レベルで制限されます。たとえば、多くの統合されたマイクロ流体デバイスの流れを停止または定義済み領域のマイクロ チャンネルを折りたたむことにより流れ方向を変更します。しかし、崩壊するために領域の数と位置は再構成可能ではありません。デジタル マイクロ流体ハンドリング能力のさまざまながありますが、可能なフローは、主として各液滴の体積により限定するべき。さらに、セルの細胞培養媒体のような液滴で培養される、余分な労力が蒸発と液滴からのガス放散を防ぎ浸透圧ショックや突然の pH 変化を避けるために必要です。
チャネル機能レベルの再構成を実現するために使用の9のときにそれらを動的に再構成する機械要素の配列から成っていた可動のそで壁付けマイクロ流体デバイスを提案する.変形可能な側壁を形成するには、ピンの両端にサイドウォールのセグメントが定義されるように、小さな長方形ピンも並んでいた。ピンをスライドできる交通機関を許可する側壁の変形またはセル、泡、およびチャネル内粒子のパターニング。デッド ボリュームを最小化し、再構成を最大化するため、隣のピン間の距離を最小化する持っていた。しかし、中小企業に働く強力な毛細管内部を接続するピンの間のギャップし、マイクロの外部入力ピンのギャップ、メディア蒸発、細菌や細胞毒性汚染、最終的に細胞を引き起こし、液体のリークが発生死。そこで、長期細胞培養10環状ピン アクションに耐え漏れのない離散側壁型再構成可能流体チャネルを開発しました。
この記事では、細胞培養エリアの漸進的な増加に続いて再構成することができます分離された側壁付きマイクロ細胞培養デバイスを構築するためのプロトコルを提供します。個々 のチャネルの側壁の気密性は、蛍光イメージングを使用してテストされます。細胞培養の互換性と細胞パターニングの能力は、オンチップ細胞培養を使用して評価されます。
このマイクロ システムは、適切なチャネルの設計が前もって決定されることはできません必要に応じて変更する必要がありますたびに適しています。細胞の成長や流れやトラップのアクティブな線虫またはチャネルで予期しない動作を他の小さなオブジェクトへの移行に基づくチャネル幅およびフロー レートを調整するまたはさまざまな raw サンプルやバイオを受け入れるようにこのシステムを使用できるなど、まだデザインの時に考案されたないです。
Protocol
1. ピン (図 2A) のエッチング
- アセトンに浸すことによって長方形ピンを脱脂します。
- 10% 硝酸 4 mL に浸漬によってピンをパッシベーションし、オーブンで 30 分の 65 ° C のソリューションを加熱します。
- 残留酸除去し、乾燥したペーパー タオル 5 分脱イオン水でピンを超音波照射します。5 分のための脱イオン水でピン 2 h.Sonicate 用離型剤の 0.5 mL でピンを浸します。
- エッチング皿 (図 2C) を作製します。
- ルーラーを使用してスライド ガラスに 4 mm のギャップを持つ 2 つの平行線を刻むまたは描画します。
- Coverglasses カット 2 つの長方形の 1 つの表面に、耐薬品性、低粘度の接着剤を適用します。
- 4 mm のギャップでスライド ガラス上の 2 つのカット coverglasses を接着します。平行線をガイドとして使用します。
- エッチング皿にシリコーン系粘着剤の 2 行を省略 (位置と輪郭のサイズを図 2Cを参照)。
注: (STL モデルファイルは補足資料として付属) 3 D 印刷のテンプレートは、簡単にかつ正確に線を引く役立ちます。 - その直線の両端で 2 mm 長いヒント接着ライン パターンに没頭しているようにエッチング皿にピンを置きます。ピンが完全に覆われていることを確認して、輪郭を描画するための接着剤を調剤します。38 ° C まで加熱加湿発酵槽にエッチング皿を転送します。接着剤を治すために一晩を待ってください。
- ガラス瓶でゆっくりと 5.0 M 塩酸 0.2 mL に 0.5 M 硝酸 0.2 mL を追加します。
注意: 混合物として知られている王水は非常に腐食性および爆発性です。耐酸性ゴム手袋、安全ゴーグルを着用し、酸を処理するときは、細心の注意を行使します。ソリューションを格納しないでください。積極性を減少することが可能として硝酸を減らします。 - 65 ° C まで加熱ホット プレートにエッチング料理を置くピンの覆いを取られた領域に酸の混合物の 0.4 mL を注ぐ。10 分待ってし、酸をビーカーに転送します。
- 脱イオン水で 0.8 M 重炭酸ナトリウム溶液 5 mL をピンのエッチングの地域を含むすべての残りの酸を中和します。
- ピンセットで縦にピンを引いて、エッチング皿からピンを削除します。5 分 5 分アセトン超音波処理に続いて脱イオン水でピンを超音波照射します。
- ステップ 1.2 のようにピンのエッチングの地域をパッシベーションします。
- レチクルとショップ顕微鏡を用いたエッチング ピンの幅を確認してください。エッチング時間が、エッチングの領域の幅が 0.2 ± 1.7 の説明を調整 0.02 mm。
- 70% エタノール 5 ml を含んでいるガラスの瓶にピンを転送します。層流フードにバイアルをもたらします。バイアルからピンをピックアップし、乾燥すること。
2. シリコーン スラブ貯水池とピンが空白の作製。
- ピンと固定側壁のスペースのための金型を製作し、典型的なリソグラフィ プロセスによって。
- 1,000 rpm でスピン塗布装置を使用して負のエポキシ レジスト 1 mL で脱脂ガラス スライドをコートします。一度この手順 15 分繰り返し 95 ° C のホット プレート上のフォトレジストを乾燥します。
- コート コーティングされたフォトレジストでスライド ガラスに 2,000 rpm で同じフォトレジストの第 3 層をスピンします。30 分間、95 ° C のホット プレート上のフォトレジストを乾燥させます。
- Photoplotted フィルムを通して UV スポット光源から 450 mJ/cm2 365 nm の紫外光をレジスト層を公開します。ハンド噴霧器を使用して溶剤 (酢酸 2-メトキシ-1-メチルエチル) を噴霧して 15 分開発 95 ° C のホット プレートに露出したフォトレジスト、フォトレジストを焼くし、窒素ガスでブロードライします。
- パターンフォトレジストとスライド ガラスをプラスチックの皿の下部に配置します。
- ポリジメチルシロキサン (PDMS) のプレポリマーを 3 mm の厚さに金型に注ぐ。10 分間-800 kPa の真空デシケータの PDMS プレポリマーを debubble します。
- メスを使用して部分的に硬化された PDMS スラブ 1 h. Demold 65 ° C のオーブンで PDMS プレポリマーを治します。1 h の 120 の ° C のオーブンで PDMS を完全に治します。
- ガイドライン パターンに沿って同じメスと PDMS スラブから離れて不規則なエッジをトリムします。正確なしピンの挿入スロット (、図 1を参照) を定義する描画面で特にできるだけきれいにカットします。
- 生検パンチを用いた PDMS スラブのメイン チャンネルの両端に入口/出口の 2 mm 径の穴を穿孔します。同様に、エアチャンネル通気口の両端に 1 mm 径の穴を穿孔します。チャンネル レイアウトとこれらの穴の位置は、図 1を参照してください。
3. ギャップの充てんとバリアの場所の作製とデバイスの組立。
- マイクロ組立を作製します。
- 10 分の 60 ° C に加熱洗浄液での 10 × 20 mm 4 号 coverglass を浸します。
- 脱イオン水で coverglasses を 2 回洗い、10 分の 120 ° C で乾燥します。
- プラズマ結合、coverglass PDMS スラブ:
- スパッタ装置の真空チャンバーに PDMS スラブ (チャネル機能側を) と洗浄 10 の × 20 mm 4 号 coverglass を配置します。
- 60 ペンシルバニアを生成する空気の真空プラズマにチャンバーをポンプを起動 (20 mA) 30 s。
- 商工会議所をすぐに発散します。ボンド、PDMS のチャネル機能側スラブの端の coverglass に配置します。
- 10 分の 65 ° C のオーブンで結合層を配置します。
- 滅菌コンテナーを使用して層流フードに接着層をもたらします。30 分間の紫外線殺菌するそれら。
- 層流フードの端はマイクロの他の側壁を形成するようスロットにピンを挿入します。隣のピンは (参照図 1B) 両方の垂直方向の終点との接触を避けるために長さの異なるべきであります。垂直方向の端の間に大きなスペースをお勧めします。空間 (N-1) × (ピン幅) が可能な場合は、別のピンの長さ (L 図 2A) とピンのN種類用意しています。
- ベース (図 2B) を作製します。
- 作るまたはベースの一部ファイルを読み取り、2 つの数値制御 (NC) ファイル (ツールパスを含む; 補足資料として含まれている) を作る CAD/CAM ソフトウェアを使用しています。4 mm 径のエンドミルと直径 1 mm エンドミル 2 番目最初補足 NC ファイルを使用します。
- 3 mm 厚透明ポリメチルメタクリ レート (PMMA) ボードを CNC ミルにクランプします。
- コンピューター NC (CNC) ミルのコント ローラー上の最初の NC ファイルを開きます。CNC ミルに 4 mm のエンドミルをインストールし、アクリル ボードにエンドミルを触れることにより、ゼロの部分を探します。ボードをカットする NC コードを実行します。
注: は、時折冷却とチップ除去のための圧縮空気で先端工場を爆破します。 - 3.2.3 第 2 NC ファイルと 1 mm のエンドミルを使用してを繰り返します。
- 洗剤と機械加工部品を脱脂、乾燥したペーパー タオル。スプレー部分は 70% のエタノールと層流フードにそれらをもたらします。
- ピン ギャップの充てんとエラストマーの障壁を作製します。
注: 手順 3.3.1 - 3.3.7 は、層流フードで無菌実行する必要があります。- 重量で白色ワセリンと 2:1 の比率で四フッ化エチレン樹脂粉末を混合することによってギャップの充てんを準備します。超音波ホモジナイザーを使用して混合物を均質化します。
- ギャップの充てんをディスペンサー シリンジに注ぐ。プランジャーを挿入し、注射器の先端を埋めるためにそれをプッシュします。針を接続し、針の先端がいっぱいなるまでプランジャーを再びプッシュします。同様に、プランジャーと針、ディスペンサー シリンジを準備し、シリコーン接着剤で埋めます。
- アダプター チューブを使用して空気圧ディスペンサーに各シリンジを接続します。シリコーン粘着剤と 250 kPa と 280 kPa にフィラーのディスペンス圧力を調整します。
- ベースのポケットの端にシリコーン粘着剤を塗布します。ポケットに、10 × 20 mm No.4 coverglass を置き、しっかりと結合するそれを押します。
- ベースの 2 つの外部スロットに沿って 2 つのセグメントを描画する約 1 mm の深さにシリコーン粘着剤を塗布します。その他のスロットに沿ったセグメントを描画する約 1 mm の深さにギャップフィラーを調剤します。
- 別のポケットの端にシリコーン粘着剤を塗布します。ポケットにマイクロ アセンブリ (3.1) を置き、しっかりと結合するそれを押します。
- 3.3.5 ギャップの充てんとシリコーン接着剤は完全にピンを埋め込むことと、スロットに開口部がないことを確認するを繰り返します。
- 滅菌コンテナー蓋付きステンレス ボックスなどのデバイスを置きます。38 ° C まで加熱加湿発酵槽にコンテナーを転送します。層流フードの一日のエラストマーのバリアを治します。
- 各ピンまで 1 mm 硬化エラストマー バリアからピンに隣接するピンに沿って移動します。
- 30 分の紫外光を用いたデバイスを滅菌します。
4. マイクロ流体デバイスの評価
- 蛍光を用いた漏洩を検出します。
- 高級ツールまたはデスクトップ ロボットを用いたマイクロ流路を開きます。可能なチャネルを通して一貫したチャネル幅を確認します。
- 蛍光に希釈する 10 μ M での脱イオン水で緑の蛍光染料を薄めます。
- 蛍光ソリューションを micropipettor とマイクロのエンド ・ ポートの 1 つに追加します。この手順は、ソリューションにチャネルを記入します。
- マイクロ流体デバイスと 2 枚の大きなプラスチックの皿の脱イオン水で濡れている吸水性の紙を置きます。少なくとも 24 時間の CO2を 37 ° C、5% で皿を孵化させなさい。
- 顕微鏡カメラで倒立蛍光顕微鏡によるマイクロ チャネルの蛍光グリーンの画像を記録します。
- 適切な画像解析ソフトウェアの蛍光画像を開き、ギャップの充てんとピンの界面漏れ (蛍光グリーン) がないを確認します。
- マイクロの種子セルです。
- (携帯型) によって 70 〜 80% コンフルエント細胞を含む細胞培養器を準備します。外し、培地に細胞を中断します。
- (速度と時間は細胞の種類に依存) 細胞を遠心し、培地を吸引します。
- 中の少量の細胞を再懸濁します。細胞カウンターでセルをカウントし、1.5 × 106から 1.5 × 107セル/ml の細胞密度を調整します。
- まっすぐ 400 μ m ワイド チャネルを作成する素晴らしいツールやデスクトップ ロボット (図 1B) を用いたマイクロ流路を開きます。できるだけチャネル全体にフラットとして側壁にピンの位置を調整します。マイクロのエンド ・ ポートのいずれかに細胞懸濁液を追加し、チャネルを入力します。
- 文化を開始する地域の側壁を定義するピンのいずれかを見つけます。倒立顕微鏡下で細胞文化領域でセルを囲む 2 つの隣接するピンを閉じます。
- チャネルからすべてのセルを追放する外側を内側から順にからすべてのピンを閉じます。優しくエンド ・ ポートから懸濁液を吸引し、それらに媒体を追加します。
- 4.1.4 で説明するように、デバイスをインキュベートします。細胞の約 70-80% が合流、文化圏を広げるピンをゆっくりと開きます。
Representative Results
再構成可能なマイクロ チャネルの構造は、図 1に示すです。複数の長方形ピンはガラス基板上に配置された、接触ピンの長い方の側面が並んでいた。PDMS シート パンチ穴とピン高さと同じ深さの凹部にチャネルの入口/出口貯水池、チャネル天井、ピンから成っているチャネルの壁の反対側の別の側壁を形成するピンの両端が覆われています。ピン、壁 (PDMS シートの顔の 1 つ)、およびガラス基板に囲まれた地域では、1 つのマイクロ流路を形成します。
前述のよう、提案マイクロ流体システムの再構成は、多くの小さなピンが非常に小さいが零でないギャップと並行に配置によって実現されます。以前のレポートで問題は隙間から毛細管現象によって生成される強力な流れだったこの問題を克服するために、ギャップは最初ギャップフィラーでいっぱいだった。このプロトコルでは粘性の炭化水素とフッ素樹脂粉末の分散混合物は、ギャップの充てんとして使用されました。しかし、ギャップの充てん自体はまた毛管効果の対象となります。したがって、図 1に示すように、結果の再構成可能なマイクロ炭化水素/フッ素樹脂ギャップの充てんとギャップの充てんの外側の周囲に形成されたエラストマー バリアがあります。ピンの真ん中を薄く充分な厚さを確保するためのギャップの充てんと 2 つのピン間のエラストマー バリアの強度に合わせて必要です。
図 2Aは、側壁のセグメントを形成するピンの図面を示しています。ステンレス鋼グレード 316 L は、その耐腐食性と低溶出特性のための材料として選ばれました。ただし、余分な不動態化プロセスは互換性ピン細胞培養のために必要でした。ピンは正常に側壁セグメントを形成するバリなし正確に長方形のチップが必要です。さらに、ピンは、ピンは、ハンドルを押すことで簡単に移動できるように、「ハンドル」が必要です。各ピンが狭い中にいる、ピン間のエラストマーの厚さはピンの動きによって引き起こされるせん断に耐えるのに十分だった。デバイスを構成する他の部分とは異なり中間間伐以外のピンの作製の放電加工 (EDM) 小加工の最も正確なコスト効果の高い方法の 1 つだから専門会社から注文する必要があります。硬い金属製パーツ。加工のコストと曲げ加工中に破壊のリスクを軽減自分をエッチングによって中間間伐を実行します。
ギャップの充てん、エラストマーの障壁および最終的に再構成可能なマイクロ チャネルの水密が正常に機能することを確認、蛍光リーク検出を使用しました。図 3は、3 日マイクロ蛍光トレーサー染料を含む殺菌水で満ちていた後エラストマーのバリアの端付近の蛍光イメージを示します。蛍光イメージは液体充填エラストマーの障壁の目に見える端から約 200 μ m の深さに達するチャネルを示します。しかし、液体に到達しなかったギャップ注入口。また、エラストマーの障壁を通ってギャップフィラーの漏れは観察されなかった.この観測は、ピンとエラストマーの障壁の狭い中のタイトなフィットが隙間から液体の移行を防ぐことを示します。
最後に、図 4に示すように再構成可能なマイクロ流体デバイスの側壁を徐々 に展開することによって適応の文化圏で長期細胞培養を行った。0 d で少数の細胞は 1 ピン幅とその他の細胞が吸引されたに等しい空間内で限られていた。2 d でのセルは下面に取り付けられていた、増殖を始めた。2 つのピンは、すべてのセルがはっきりと見える、密度は低かったが、取り消されました。5 d でセルを増殖し続けたし、密度が増加しました。6 と 9 d は、他の 2 つのピンは細胞 underconfluent を保つために取り消されました。文化圏の緩やかな拡大の効果を図 4Bに示します。細胞密度指定のピンが取り消された日に急激な変化があった。ただし、指数は典型的な細胞培養に見られる細胞数の成長率を一定に保たれました。
図 1: 再構成可能なマイクロ流体デバイスを 1 つピン分離側壁と。(A)部品および再構成可能なマイクロ流体デバイスの構築。デバイスは、PDMS/ガラス マイクロ機能挿入 10 ステンレス鋼ピンの端によって形成された 1 つの側壁にまっすぐに 1 つのチャネルがあります。ギャップの充てんとエラストマーの障壁液体が、ピンの隙間から漏えいすることを防ぐことができます。Coverglasses、ギャップの充てんとエラストマーの障壁は、ポリメチルメタクリ レート (PMMA) ベースに固定されます。(B)自動ピン マニピュレーターです。金属のシートから作られるエンド エフェクタは、3 軸のデスクトップ ロボットに固定されます。1 つのピンを移動するには、は、エンド エフェクタは、垂直方向の端をプッシュします。長さが異なるとピンは、ピン幅の 3 倍の間隔で配置されます。間隔により、エンド エフェクタ仲間 1 つピン一度に十分なクリアランスで。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プロトコルで使用される機械加工部品の機械図面。単位がミリメートル;R指定半径寸法;(□) の正方形のシンボルを示します平方機能;tは厚さを示します。(A)側壁の一部として 316 L ステンレス鋼ピン。ピンを命じたし、説明のように加工することができます。これは機械加工の一部として注文されていないが、プロトコルの一部として行われたので犬の骨のような形を作るためにピン中央の間伐はこの図面に反映されません。(B)場所でピンの動きに対して coverglasses、ギャップの充てんとエラストマーのバリアを保持ポリメタクリル酸メチル (PMMA) ベース。(C)ピンの真ん中をエッチングに使用されるエッチング料理。エッチング皿を構築するには、4 枚のガラスは、シリコーン系粘着剤を使用して接着されています。シリコーン接着剤の輪郭のパターンは、図面に示すように、皿の上のピン配置に続いて皿の上に描画されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ピンの隙間から再構成可能なマイクロ チャネルから漏洩の蛍光検出します。ギャップフィラー (不透明) から成っているシール構造の位相コントラスト画像に再構成可能なマイクロ チャネルを充填緑の蛍光色素の蛍光イメージがオーバーレイされますとエラストマー障壁 (半透明)。エラストマー バリアの端半月板のような機能として表示されているし、上部の点線; で表されますエラストマーのバリアとギャップのフィラー間のインターフェイスは接触黒面積半月板のような機能として、下の点線で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 再構成型マイクロ流路内の変数セルの文化圏と進歩的かつ連続的な細胞の成長。(A)そで壁を移動することによって閉じ込められた細胞培養エリアの COS 7 細胞の成長。(B)の成長曲線と時間発展の A に示すように再構成可能なマイクロ可変サイズの文化圏に閉じ込められた COS 7 細胞密度の)。3 つの縦方向の矢印は、それぞれ 2、5、および 6 d で細胞培養エリアの拡大を示します。に加えて細胞数、細胞の密度は同じ文化圏、各指数関数的成長曲線に個別に取り付けられ、フレームに示すローカル倍加時間 (td [h]) を推定するために使用表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ピン分離マイクロはフル機能を備えたマイクロ チャネル、任意の既存のマイクロ流路と比較してチャネル形状で明らかに高い再構成があると考えています。我々 がここで提供されるプロトコルには、培養時間が長く密度の下で文化を維持する細胞培養表面エリアを徐々 に拡大できるマイクロ流体デバイスが有効になります。デバイスは、あらかじめ基板、設計や製作の時期に他の考察上のタンパク質をパターニングすることがなく細胞のチャネルでパターニングをまた提供します。さらに、この再構成可能なマイクロ流体デバイスは簡単にデバイスを処理することができます非常に少数の既存のマイクロ フロー困難等の処理を実装に役立つだろう強力なチャネルで変位の流れを生成します。これは、デバイスの設計に大きな変更なしこのデバイスを使用してセルと他の微生物、ガスその他の流体間の相互作用を評価できるということを意味します。
我々 は、外部フロー制御方法としてチャネルの 1 つの入口にラプラス圧または水圧を適用する検討しています。ピンとチャネルの天井/床のすき間から空気通気路に向かって流れが生成されますので、行き止まりで液体を押すことはお勧めしません。流体の多くの操作では、このようなピンの操作は必要ありません。たとえば、混合は、1 つのピン (すなわち、前後数回 1 つだけピンを移動) によって液体をマッシュ アップによって実現できます。
デバイスの最も重要な部分は、ピンです。長さに精密、並列処理、直角度と表面品質に必要ですピン、マイクロ チャネルを形成する必要があります、スムーズに移動する必要があります、および隣接するピンの動きをガイドする必要があります。したがって、図 2Aのように図面を提出することにより精密加工を専門とする会社からピンを並べる必要あることをお勧めします。その他の幾何学的な寸法を必要とする企業と明示的な表面粗さ指示可能性があります。ただし、ピンは再利用可能な取り扱い、硝酸で時折不動態処理された場合です。
エラストマーの障壁はもう一つの重要な特徴とその形成は、デバイスの作製プロセスの最も重要なステップです。精密に加工された基地再現性と信頼性の高い結果を得るため必要になります。未硬化のバリアにピンを配置することも重要なステップです。ピンも合わせ、ギャップの充てんと気泡なし壁に埋め込まれて保管してください。これらの手順は、このマイクロ流体デバイスと共通の問題である、ピンを通して漏れを防ぐ。
このデバイスを使用してその他の一般的な問題は) 取拘束されたピン、b) 細胞死と低成長率。これらの原因が考えられますが) ピン探針高さとシリコーン スラブ金型上にフォトレジスト層の高さのエッチング、表面、および寸法ミスフィットのピン中、貧しい品質のムラ (テーパーまたは波線) エッチングが含まれます。エッチング液製剤、温度、攪拌の調整は、ピンの動きを向上させる役立つことがあります。また、ワックスや接着剤を使用せず継手試験は、問題を解決するためのヒントを提供します。可能な要因 b)、ピン、エラストマー障壁用接着剤の選択および不完全な接着剤の硬化でエラーの十分な不活性化。一部のセルは、フィブロネクチンや他のタンパク質や細胞粘着を促進するポリマーによるマイクロ チャネル内コーティングを必要があります。さらに、セル文化実践 trypsinization や遠心分離などの最適化は、死んだ細胞のマイクロを低下します。
提示作製プロトコルの制限の 1 つは、側壁の 1 つだけは分離することです。サイドウォールの両側のピン配列でビルドされている場合、チャネルの再構成がさらに向上します。ピンと長く作製手順の 2 倍が必要ですが、これは技術的に実行可能なオプションです。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、科研費 (20800048、23700543) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oven | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Nitric Acid | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Stainless steel pins | Micro Giken | N/A | 0.3 mm crosssection, Grade 316L stainless steel, wire-cut EDM |
| Mold release agent | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Negative epoxy photoresist | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 26 x 60mm No.4 | |
| Acetone | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Glass slides (Large) | Matsunami Glass | 76 x 52mm No.1 | |
| Silicone adhesive | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| White petrolatum | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder | Power House Accele | Microfluon II | |
| Clear acrylic plate (3 mm-thick) | Various | N/A | |
| Pneumatic dispenser | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Hydrochloric acid | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Computer numerical control (CNC) mill | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| End mill (4 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| End mill (1 mm diameter) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Adhesive (chemical-resistant and low viscosity ) | Cotronics | Duralco 4460 | |
| Borisilicate glass vials | Various | To prepare HNO3+HCl solution (Aqua regia). Always select borosilicate glass. | |
| Sodium bicarbonate | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | AS12GTU | |
| Ultrasonic drill | Shinoda Tools | SOM-121 | Used as a ultrasonic homogenizer. |
| Spin coater | Active | ACT-220DII | |
| Hotplate | AS ONE | ND-1 | |
| Photoplotted film (12,700 dpi) | Unno Giken | N/A | Negative image of the recess at the bottom of a PDMS slab are plotted. |
| 2-methoxy-1-methylethyl acetate | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| UV spot light source | Hamamatsu | L8327 | Ultraviolet source |
| Nitrogen | Various | N/A | |
| Vacuum desiccator and pump | AS ONE | MVD-100, GM-20S | |
| Scalpels | Various | No.11 | |
| Biopsy punches (1.0mm and 2.0mm) | Kai Medical | BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm) | |
| Glass engraving pen | Various | N/A | |
| Cleaning solution | Tama Chemicals | TMSC | Dilute 1:100 with deionized water |
| Sputter coater | San-yu Electron | SC-708 | For plasma bonding. |
| Dispenser syringe (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Plunger | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| Blunt needle (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Adapter tube | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermenter | Japan Kneader | PF100 | |
| Green fluorescent dye (Alexa Fluor 488 carboxylic acid) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Large plastic dish | Greiner bio-one | 688161 | |
| Absorbent paper | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Inverted microscope | Leica | DMi8 | |
| Microscope camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Cell counter | FPI | OC-C-S02 | |
| Cell culture vessel | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 352095 | |
| Shop microscope | PEAK | 2034-20 | |
| Hand sprayer | FURUPLA | No.3530 | |
| Coverglasses (Rectangular) | Matsunami Glass | 10 x 20mm No.4 | |
| CAD/CAM software | Autodesk | Inventor HSM | |
| Nitrogen gas pressure regulator | AS ONE | GF1-2506-RN-V | Set to 0.1 MPa |
References
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- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139 (2016).
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- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250 (2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103 (2017).
