Summary
Heri præsenterer vi en hurtig, letkøbt og billig metode til opdigte brugerdefinerede Polydimethylsiloxan forme, der kan bruges til at producere hydrogel-baserede manipuleret væv med komplekse geometrier. Vi beskriver desuden resultater fra mekanisk og histologiske vurderinger foretaget på manipuleret hjerte væv fremstillet ved hjælp af denne teknik.
Abstract
Som inden for vævsmanipulering har fortsat med at modne, har der været stigende interesse i en bred vifte af væv parametre, herunder væv form. Manipulere væv figur på mikrometer til centimeter skala kan direkte cellejustering, ændre effektive mekaniske egenskaber, og håndtere begrænsninger relateret til næringsstof diffusion. Derudover kan fartøjet som en væv er forberedt give mekanisk begrænsninger på væv, resulterer i stress felter, der yderligere kan påvirke både celle og matrix struktur. Formede væv med stærkt reproducerbare dimensioner har også værktøj til in vitro- assays i hvilken prøve dimensioner er kritisk, som hele væv mekanisk analyse.
Dette manuskript beskriver en alternativ fabrikationsanlæg metode udnytter negative master forme fremstillet af laser ætset akryl: disse forme udføre godt med Polydimethylsiloxan (PDMS), tillade designs med dimensioner på centimeter skala og funktion størrelser mindre end 25 µm, og kan hurtigt designet og fremstillet til en lav pris og med minimal ekspertise. Minimal tid og omkostninger krav mulighed for laser ætset forme være hurtigt itereret på indtil en optimal design er fastlagt og tilpasses nemt til enhver analyse af interesse, herunder dem uden for feltet af vævsmanipulering.
Introduction
I de seneste to årtier, er bløde litografi blevet brugt flittigt som en fabrikation teknik til at støtte videnskabelig forskning, især inden for områderne mikrofluidik, materialeforskning og tissue engineering1,2, 3. Replika molding, hvor et objekt med en ønskede figur er oprettet ud fra en negativ master mold, tilbyder en bekvem og billig metode til fremstilling af positive PDMS replikater der kan bruges til støbning formet hydrogels. Dog kræves negative master formene er typisk produceret ved hjælp af microfabrication teknikker, som er dyrt og tidskrævende, begrænset størrelse, og kræver rene rum plads og avanceret udstyr. Mens 3D udskrivning tilbyder en potentiel alternativ, er dens nytte noget begrænset på grund af resolution begrænsninger af lavere omkostninger printere og de kemiske interaktioner mellem fælles 3D printer polymerer og PDMS, der kan hæmme hærdning.
Laser cutter systemer kan både skære og ætsning af materialer såsom plast, træ, glas og metal er for nylig blevet drastisk billigere og derfor mere tilgængelige for opdigte forskningsværktøjer. Handelsklasse laser kuttere er i stand til at opdigte objekter på centimeter skala med minimumskrav, som er mindre end 25 µm, og yderligere kræve minimal træning, ekspertise og tid til at bruge. Mens laser ablation af PDMS har tidligere været brugt i fabrikation af enheder, mikrofluidik, har ingen manuskript til vores viden beskrevet en proces, hvorved millimeter og centimeter skala forme kan være fremstillet af laserskåret negative master forme4 .
Vi har brugt denne teknik primært til at manipulere form af manipuleret væv for at forbedre næringsstof diffusion, cellulære justering og mekaniske egenskaber5,6,7. Men alsidighed af denne teknik giver mulighed for udnyttelse i ethvert felt hvor støbte hydrogels er af interesse, såsom drug delivery og materiale videnskab forskning8. Med adgang til en laser cutter, PDMS skimmel replikater kan laves til næsten enhver geometri uden udhæng (det ville hæmme fjernelse uden en multi-del mug, som ligger uden for rammerne af dette manuskript) og der passer inden for dimensionerne af laser seng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opret vektor Format Master Mold Design
- Saml den ønskede skimmel geometri i vektor-format ved hjælp af en vektor grafikprogram (Se materialer, udstyr og Software tabel). Vælg fil | Nye og skabe et lærred af passende dimensioner med RGB-farveformat. Oprette den ønskede geometri ved hjælp af formværktøjerne i panelet til venstre: Indtast de ønskede dimensioner i toppen af vinduet (Klik på knappen transformering i toppen hvis ikke i første omgang synlig) at definere helt præcis form størrelser.
Bemærk: Skimmel geometrier bør tillade mindst en 6-mm grænsen mellem kant af de yderste funktioner og skære linjen til at tillade trimning af PDMS menisk efter mug støbning. Dette vil tillade den færdige skimmel at lægge flugter med bunden af en kultur parabol. Yderligere, skimmel geometrier bør tage i betragtning begrænsninger i forbindelse med laser cutter modellen, der vil blive anvendt, herunder kerf bredde og minimum funktion størrelse. Laseren anvendes til arbejdet beskrevet heri (Se materialer, udstyr og Software tabel) featured en 0.2 mm kerf bredde og en minimum ætset funktion størrelse på 25 µm (maksimum DPI på 1.000). Skimmel dimensioner kan vælges til at rumme en ønskede kultur fartøj, som en 10 cm parabol eller 6 - eller 24-godt plader. - Åbner farvevælgeren i det øverste venstre hjørne af vinduet og definere nye farveprøver forenelig med laser cutter software.
Bemærk: Vi bruger rød (RGB-255, 0, 0) til at skære og blå (RGB 0, 0, 255) til ætsning. Yderligere farveprøver kan defineret afhængigt af krav til design, (for eksempel, hvis mere end én ætsning dybde ønskes).- Tildele disse farveprøve farver til opskæring kurver ved at vælge stien og derefter vælge klip farveprøven for farven, sti og [ingen] til fyldfarven fra farvevælgeren.
- På samme måde, tildele farveprøve farver til ætsning stier ved at vælge objektet og derefter vælge ætsning stien til fyldfarven og [ingen] for sti farve fra farvevælgeren.
- Gemme designs som either.ai or.pdf filformater, afhængigt af vektor grafik program og laser cutter kompatibiliteten (figur 1A og Supplerende fil).
2. laserskåret akryl Master forme
- Vælg en negativ master mold materiale.
Bemærk: Fjerdedel-tommer tyk akryl er velegnet til dette program på grund af dens forenelighed med laserskæring, relativt lave omkostninger, og tykkelse, som giver mulighed for funktioner op til ~ 5,5 mm i højden. Men andre materialer, der opfylder følgende krav kan bruges som godt: (i) ikke-reaktiv med PDMS hærdning; (ii) ikke-porøs/kraftigt klæbende til hærdede PDMS; (iii) skærer og ætser rent med en laser cutter; (iv) fastholder en glasagtig state op til 60 ° C; (v) af tykkelse kompatibel med den ønskede maksimale funktion højde. - Forberede laser cutter til at skære efter fabrikantens specifikationer. Sikre, at tilstrækkelig ventilation er brugt og at sengen højde er korrekt kalibreret til det valgte negative master mold materiale tykkelse.
- Åbn filen design i en vektorer grafikprogram på computeren tilsluttet laser cutter og klik på fil | Udskriv. Sikre, at laser cutter ligger som printeren og at "Gøre ikke skala" er valgt i skalering drop down menuen til at undgå forvridning af designet før du klikker på knappen Udskriv nederst i dialogen udskrivning.
- I laser cutter udskrivning værktøj, skal du klikke på Indstillinger -knappen i nederste højre hjørne. Tildele kraft, hurtighed og impulser pr. tomme (PPI) indstillinger til hver af de tidligere valgte farver at indstille cut/etch parametre for alle designfunktioner.
Bemærk: Her, laser cutter udstyret med en 75 W laser (Se materialer, udstyr og Software tabel), anvendes indstillingerne for følgende: 100% strøm, 1% hastighed og 1.000 PPI skærer rent igennem ¼" akryl; 100% strøm, 8% hastighed og 500 PPI ætser til en dybde på 2,75 mm i akryl; og 100% strøm, 5% hastighed, 500 PPI ætser til en dybde af 3,50 mm i akryl. Hvis ukendt for en laser cutter konfiguration eller materiale, kan disse parametre bestemmes empirisk gennem trial and error med et prøveemne. - Klik på den store grønne knap i laser cutter software til laser etch og skære de negative master forme.
- Forberede de negative master forme til PDMS støbning ved at fjerne eventuelle resterende skæring rester med små pensler og/eller trykluft (figur 1B).
3. Forbered PDMS forme til celler eller væv kultur
- Forberede en PDMS støbning mix efter sin fabrikantens specifikationer. Forberede 0,35 mL/cm2 af master mold; Dette vil variere baseret på mug funktioner og højde.
- Degas den forberedte PDMS i en vakuumkammer tilsluttet en standard lab vakuum linje (< 500 mmHg) for 1 time, eller indtil alle bobler er ryddet.
- Tape den ydre kant af mold med vinyl eller malertape (farvede etiket tape fungerer godt), således at båndet udvider > 3 mm over den ætsede ansigt af den negative master mold. Tryk på tape fast mod siden af formen til at forhindre lækager senere.
Bemærk: Hvis den akryl master mold funktioner gennem huller, kan det være nødvendigt at anvende tape på bunden af mug samt (figur 1 c). - Hæld den afgassede PDMS over den ætsede ansigt af den negative master mold.
Bemærk: Målet PDMS tykkelse afhænger anvendelsen, selvom tyk PDMS skimmel bunde kan gøre imaging udfordrende. En minimums tykkelse på ~ 1,5 mm skaber en god balance mellem imaging overvejelser og lethed af skimmel fjernelse. - Placere den PDMS-belagt negative master skimmel i en vakuumkammer og degas igen i 1 time, eller indtil alle bobler er ryddet.
- Placere den afgassede PDMS-belagt negative master skimmel i en 60 ° C ovn hærde i mindst 6 h. sikre at ovnen hylde er niveau. Alternativt, tillade PDMS at helbrede ved 37 ° C natten over eller ved stuetemperatur for ~ 72 h.
- Hvis flere forme blev kastet på den samme negative master skimmel, skal du bruge en razorblade for at skære disse forme apart, mens de er stadig på den negative master mold. Så skræl hver PDMS mug ud af den negative master mold. Sikre at PDMS forme er indsamlet langsomt og omhyggeligt at forhindre mug funktion rive under indsamlingen.
- Bruge et barberblad, trim off regioner med menisk fra støbning, som vil forhindre mug fra liggende fladt, samt alle overskydende materiale eller vragrester (fig. 1 d).
- Eventuelt forberede forme til celle/væv støbning ved autoklavering.
4. støbt kollagen og Fibrin Hydrogel væv
Bemærk: Brug en ordentlig aseptisk procedure for at opretholde sterilitet.
- Overholde formene til bunden af det ønskede skib. Overholde nye forme til bunden af en væv kultur behandlede plade af fast trykke formen mod den ubehandlet plast (på grund af hydrophobicity af PDMS).
Bemærk: Men hvis vævskultur behandlet polycarbonat der skal bruges, eller for genbruges forme, som har tendens til at overholde mindre fast, en naturlig eller syntetisk lim (såsom fibrin eller silikone fugemasse hærdet natten over) kan bruges til at sikre vedhæftet fil. - Forbered fibrinogen, thrombin og neutraliseret kollagen casting løsninger, således at den ønskede koncentration af hver vil blive nået i støbt væv. Holde kollagen på is indtil støbning.
Bemærk: Fibrinogen og thrombin bør ikke være tilladt at blande indtil umiddelbart før støbning. Hvis det er nødvendigt, kan fibrinogen og thrombin løsningerne også nedkøles for at øge tid, polymerisering. Vi har brugt en endelige fibrinogen koncentration mellem 0-8 mg/mL, en endelige thrombin koncentration mellem 10-100 U/mL, og et afsluttende kollagen koncentration mellem 0,8 - 2,0 mg/mL (figur 2). For manipuleret hjerte væv, bruger vi ofte cardiomyocytes på 12 x 106 celler/mL med 1,6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinogen og 20 U/mL thrombin (thrombin indsættes umiddelbart før støbning). Optimal koncentrationer (selv uden for disse foreslåede områder) bør bestemmes empirisk. - Høste celler efter standardprotokoller og resuspend på en koncentration, der er egnede til at opnå den ønskede oprindelige celle tæthed i støbt væv.
Bemærk: Menneskelige inducerede pluripotente stamceller-afledt cardiomyocytes blev høstet som beskrevet i Lian et al. 9 opbevare de høstede celler på is. Cellevolumen bør regnskabsføres ved udarbejdelsen af cellesuspension. Vi har brugte celle koncentrationer spænder fra 9-18 x 106 celler/mL, selvom optimal intervaller forventes at variere med celle befolkning (figur 2). - Kombiner fibrinogen, neutraliseret kollagen og cellesuspension, (Se trin 4.2 for eksempel) for at oprette en casting mix. Holde casting mix på is.
Bemærk: Fibrinogen og thrombin temperaturer og koncentrationer vil bestemme polymerisering kinetik; for at undgå polymerisering under støbning, kan det være nødvendigt at udarbejde særskilte partier af støbning mix afhængigt af antallet og omfanget af de konstruktioner, der vil blive kastet. - Behandle overflader af mug, der vil blive udsat til støbning mix at afbøde PDMS hydrophobicity (PDMS hydrophobicity vil øge protein adsorption og vanskeliggør støbning).
- Opnå hydrofile overflade ændring ved at behandle med ilt plasma, som med en håndholdt høj frekvens generator (f.eksBD-20A fra Litton Engineering). Afsløre alle overflader af formen, kontakt celle/gel blandingen til plasma behandling for 3-5 s, ca 5 min før støbning.
- Alternativt behandling med et overfladeaktivt stof, som Pluronic F-127 (1% w/v)10. Udføre overfladebehandling som tæt på støbning tid som muligt, som ændringen i polaritet vil forværres over tid.
- Umiddelbart før støbning, tilføje thrombin til støbning blanding og bland grundigt af pipettering op og ned uden at indføre bobler.
- Arbejder hurtigt, afpipetteres støbning blandingen i forme, ved hjælp af pleje til at deponere mix i alle hjørner og ujævnheder i formen. Undgå pipette udslyngning ud over den første stop til at forhindre boble dannelse inde i konstruktioner.
- Gentag trin 4.6 og 4.7 som nødvendigt for enhver yderligere partier af støbning mix.
- Placer vævskultur fartøj i et 37 ° C inkubator for 45 min. Hvis rugemaskine ikke er godt fugtet, depositum celle medier omkring formene før inkubation at undgå konstruere dehydrering.
Bemærk: Typen celle medie vil afhænge celletype, men til manipuleret hjerte væv konstruktioner bruger vi RPMI 1640 + B27 supplement. - Efter 45 min, vende tilbage til konstruktioner til hætte og dække med celle media før han vendte tilbage til rugemaskine.
- Ændre celle medierne hver 48-72 h som nødvendige for celle og konstruere type.
Bemærk: Medier ændring bør planlægges efter de anbefalede vejledningen fra leverandøren til at sikre maksimal celle sundhed. Vær forsigtig, når det medieskift for at undgå at forstyrre konstruktioner. Vi har ikke oplevet problemer med konstruktioner flydende, men hvis det sker, det kan forebygges ved at tilføje høje stillinger til skimmel design, der rækker ud over media niveau. - Efter brug, vaske forme sekventielt med 10% blegemiddel, 70% ethanol, og destilleret vand. Derefter luft tørre, og autoklave for videreanvendelse op til ~ 10 gange.
5. analyse teknikker: Væv jordpakning
Bemærk: Jordpakning som følge af matrix remodellering er en indikator for væv levedygtighed og udvikling, der kan måles let gennem Optisk mikroskopi og billede analyse.
- Indsamle Optisk mikroskopi billeder af konstruktioner i forme på tidsintervallerne spænder fra 2 h til 96 timer efter støbning.
Bemærk: Den lave grad af forstørrelse kræves, en dissektion mikroskop med et kamera mount er velegnet til denne ansøgning. - Trace området synlig konstruktion i et billede analyse suite som ImageJ (open source, imagej.nih.gov/ij/).
- Analysere den sats og afsluttende graden af komprimering (figur 2).
6. analyse teknikker: Trækstyrke test
Bemærk: Begge aktive mekanik (styrker eller stammer, der er genereret af en manipuleret væv på grund af celleaktivitet) og passiv mekanik (styrker eller stammer, der er genereret som reaktion på anvendt stammer eller styrker) er kritiske funktionelle egenskaber af mange manipuleret væv, og dette gælder især for manipuleret hjerte væv. Micromechanical analyzer anvendes til analyserne er beskrevet i Tabel af materialer. Andre mekaniske test apparater kunne være tilsvarende gælde, forudsat at de giver mulighed for hydreret test og er i stand til at længden og tvinge målinger over intervaller og resolutioner relevante for væv. For væv med tværsnitsareal på rækkefølgen af enkelt kvadrat millimeter og stiffnesses om snese kPa er en 5 mN vejecelle en god pasform. Større og stivere materialer ville kræve en større vejecelle. Inden prøvningen, sikre at både krafttransducer og længde controller kalibreret korrekt.
- Tænde længde controller, tvinge transducer, pulse generator og temperatur controller.
- Fyld det mekaniske test truget med Tyrodes løsning (1,8 mM calciumchlorid, 1.0 mM magnesiumchlorid, 5,4 mM kaliumchlorid, 140 mM natriumchlorid, 0,33 mM natriumfosfat, 10 mM HEPES og 5 mM glukose i ddH2O, pH justeret til 7.4) for manipuleret hjerte væv. Justere termoelement, således at en bad temperatur på 37 ° C opnås.
- Indlæse en mekanisk prøvningsprotokol for aktive sammentrækning dataindsamling.
Bemærk: Vi har vurderet aktive kontraktile mekanik ved hjælp af en længde trin protokol i hvilken længde trin i 5% stamme forøges op til 30% besiddes der 120 s at evaluere virkningen af pres på sammentrækning kraft (figur 3A). Derudover har vi evalueret passiv mekaniske egenskaber gennem et pull-til-break protokol med en konstant belastning sats på 10% stamme/min (figur 3B). Begge af disse protokoller kan tjene som gode udgangspunkter for aktive og passive mekanisk analyse. - Omfattet en dissektion frigøre omhyggeligt manipuleret væv konstruktion fra PDMS mold, sådan at det flyder frit.
Bemærk: Cellularized konstruktioner, der har undergået væv jordpakning vil sandsynligvis allerede være løsrevet fra indvendige skimmel overflader, og i disse tilfælde minimal manipulation er påkrævet.- Hvis komprimering ikke har medført konstruktion til at frigive, bruge tang til at forsigtigt adskille konstruktionen fra siderne og bunden af formen til at undgå at beskadige vævet.
- Bruge pincet, forsigtigt afhente konstruktionen og overføre det til den mekaniske test bad.
- Se konstruktionen gennem en dissektion mikroskop, montere begge ender af konstruktion til at kroge fastgjort til krafttransducer og løftestang arm.
- Justere løftestang arm position ved hjælp af micromanipulator, indtil konstruktionen er placeret uden anvendt stamme. Nul længde controller og tvinge controller.
- Image konstruktion gennem dissektion anvendelsesområde, således at dimensionerne af konstruktionen kan måles via billedanalyse.
- Iværksætte aktive force protokol og gemme de indsamlede data når protokollen er blevet afsluttet (figur 3).
- Hvis passiv mekaniske data der kræves så godt, justere løftestang arm igen indtil der ikke er nul anvendt stamme. Nul længde og tvinge controllere og billed konstruere et sekund tid før indlæsning og indlede passive mekanik protokollen (figur 3). Gemme de indsamlede data.
7. analyse teknik: Paraffin histologi og Immunhistokemi
Bemærk: Vi har haft den største succes i imaging manipuleret væv sektioner ved hjælp af paraffinblokke, således at væv morfologi er bedst bevaret. Alle trin i processen skal være omhyggeligt overvejet og skræddersyet til den manipuleret væv, herunder behandling af prøver uden vakuum eller tryk, empirisk fastlæggelse af passende antigen hentning metoder, og tilsætningen af primære antistof koncentration. Andre teknikker, såsom benytter frosne blokke for at udarbejde dias, kan kræve mindre tid og bekostning, mens giver tilstrækkelige resultater afhængigt af den tilsigtede anvendelse.
- Under en dissektion anvendelsesområde, forsigtigt frigøre manipuleret væv konstruktion fra PDMS formen ved hjælp af pincet gled mellem konstruktion og PDMS forsigtigt adskille det fra PDMS, sådan at det flyder frit. Overføre disse konstruktioner til et microcentrifuge rør til fiksering.
Bemærk: Skrøbelige konstruktioner eller dem, der fastsættes under statisk stress tilstand leveres af mold, selv måtte være fastsat i formen ved at ændre løsninger i kultur godt og at fjerne konstruktionen fra formen efter fiksering. - Umiddelbart løse manipuleret væv ved nedsænkning i 4% PARAFORMALDEHYD (PF) i 10 min ved stuetemperatur. Skøn ikke mere end 1 time pr. 1 mm tykkelse på væv; lave ikke over lave.
- Skyl væv med fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- At holde væv våd, sted en dråbe af eosin på det til at plette den lyserøde for 10-30 s, og skyl derefter med 70% ethanol.
Bemærk: Den lyserøde farve hjælper med at identificere det i paraffin blok for skæring senere og vil vaskes væk under deparaffinization. - Wrap væv i linse papir og sted i en histologi kassette. Bruge skum puder i kassetten efter behov for at holde væv flade.
- Dykke kassette i 70% EtOH og opbevares ved 4 ° C indtil klar til paraffin behandling.
- Behandle væv ved tørring det i stigende koncentrationer ethanol (2 x 30 min hver 70, 95 og 100%). Derefter bade prøver i tre sekventielle xylen bade i 30 min.
- Dykke prøver i tre sekventielle paraffin bade i 30 min.
- Varme op til kassetter, omhyggeligt udfolde og fjerne eosin-farvede væv fra linse papir, og integrere den paraffin-infiltreret væv i en paraffin blok. Vær omhyggelig med at lægge prøven fladt på bunden af formen til at aktiverer lettere skæring.
- Afsnit væv ved hjælp af en mikrotom som ønskes (5-8 µm tykt) og plet ved hjælp af standard procedurer optimeret til de manipuleret væv (figur 4).
Bemærk: Et alternativ til paraffinsnit er at bruge frosne blokke, selvom morfologi af prøven kan være kompromitteret. Placer de faste konstruktioner i 30% saccharose i PBS for 3 timer, eller indtil prøven er afbalancerede (f.eks.natten). Udveksle løsning med 50/50 v/v 30% saccharose og optimal opskæring temperatur (OCT) frysning medium for 1 h. placere konstruktioner i frosne blokke med OCT frysning medium ved hjælp af en 70% EtOH med tøris gylle for hurtigt blok frysning i plastik bakker. Afsnit blokke med en kryostaterne til 10-50 µm tykt sektioner.
8. analyse teknik: Cellejustering
Bemærk: Manipulere væv form og indre stress felter kan modulere cellejustering, et definerende træk ved mange indfødte væv.
- Forberede manipuleret væv konstruktioner i PDMS forme med geometrier af interesse.
- I slutningen af perioden kultur, vask af konstruktioner i PBS, fix i 4% PF (Se trin 7.2) og høste konstruktioner at forberede billeddannelse ved skæring og histologi (Se afsnit 7) eller hele montere farvning.
Bemærk: Hele mount farvning følger lignende trin til histologi/Immunhistokemi men kræver længere inkubation, og indtrængningsdybde farvestoffer, antistoffer og billedbehandling teknikker (såsom lys indtrængningsdybde i konstruktioner) vil skal fastsættes empirisk for konstruere sammensætning. - Orientere afsnittene væv i det vandrette plan (parallelt med af mug nederst) og plet for en markør for celle af interesse. Bruge en f-actin etiket, f.eks phalloidin, markere actin stress fibre af de fleste celletyper. Alternativt kan du bruge en celle specifikke markør.
Bemærk: I tilfælde af manipuleret hjerte væv, orientering, blev fastsat ved sarcomeres farves med α-actinin. - Vurdere den største akse for alle celler eller kerner i det pågældende område, manuelt eller ved hjælp af en analyse værktøj (f.eks.ImageJ, MATLAB).
Bemærk: Det kan være nyttigt at kategorisere forskellige regioner af den samme konstruktion, afhængigt af geometri ("node" og "bundle" regioner i en mesh-lignende geometri, eller "kerne") og "kant" i en cirkulær geometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optikken i laser cutter vil forårsage ætset områder til faldet meget lidt dimensioner som ætsning dybde stigninger, og resultaterne i støber vægge med en meget subtil facet, grund til skrå af laserstrålen. Dette vil bidrage til at lette fjernelsen af støbt PDMS forme, men bør overvejes nøje, hvis meget dybt ætset negative master forme (> 6 mm) er påkrævet (figur 1).
Tidens kultur, vil cellularized konstruktioner kompakt på grund af matrix remodeling, selv om hastigheden og omfanget som dette sker, vil afhænge af stillads sammensætning, celle belastning, og dyrkning af betingelser.
Matrix remodeling kan opstå gennem både reorganisering og nedbrydning af de omkringliggende matrix (såvel som deposition af nye matrix), men er typisk forbundet med en stigning i mekaniske stivhed på grund af faldet i tværsnitsareal. Med kun kollagen-konstruktioner består af 1,6 mg/mL kollagen og 12 x 106 cardiomyocytes/mL, ser vi konstruerer kompakt 19,7 ± 2,8% af deres oprindelige bredde i de fire dage efter støbning (figur 2) via jordpakning assay. Mens denne analyse giver et repræsentativt 2D tilnærmelse af en 3D proces, lethed af dataindsamling og ikke-destruktiv natur gør det et stærkt værktøj til at studere udviklingsprocessen konstruktion. Bemærk at på celle kultur betingelser, selv i mangel af celler, kollagen mekanik kan ændre sig over tid på grund af både samlesæt og tværbindingsmidler11. Fibrin kan hurtigt nedbrudt af fibrinolyse både i vivo og in vitro- hvis ikke i en antifibrinolytic, såsom aprotinin eller aminokapronsyre syre12. Virkningen af stillads komponenter på lang sigt væv udvikling, og ikke bare væv dannelse, bør derfor betragtes som når du vælger en konstruktion formulering. Hvis endelige væv størrelse er vigtigt for et bestemt program, jordpakning skal også betragtes i mug design og empirisk bestemmes baseret på celle type(r) og matrix sammensætning. Bemærk, at væv komprimering kan også fremkalde stress felter inden for det væv, der kan manipuleres i cellularized konstruerer at tilskynde cellejustering (figur 4).
En bred vifte af stillads polymer koncentrationer og første celle såning tætheder har været brugt til at oprette manipuleret væv i litteraturen, og dette kan tilskrives primært forskellige krav for forskellige celletyper, cellelinjer og applikationer. Baseret på vores eget arbejde med hiPSC-afledte cardiomyocytes, mener vi, at en kollagen koncentration af 1,25 mg/mL og en seeding tæthed af ~ 15 millioner celler/mL er en god start punkt13. Alternativt, fibrin er udbredt som en hjerte væv stillads materiale, typisk i rækken af 3-4 mg/mL14. Celle såning tæthed kan vælges baseret på en række faktorer afhængigt af programmet, men de celle tætheder af indfødte væv giver et godt referencepunkt. Også overveje at stærkt koncentreret celle løsninger kan blive udfordrende at arbejde med, især for små mængder. For en given celle population, kan stillads formulering indstilles; generelt ved stigende polymer koncentration når væv er for skrøbelige eller bryde ved kompaktering, og øger polymer koncentrationen når væv er for stiv eller undlader at kompakt15.
Inden du udfører passiv mekanisk analyse når som helst pege under kultur, kan det være hensigtsmæssigt at mekanisk forudsætning konstruere prøven. Forkonditionering af naturlige polymer hydrogels og manipuleret væv vil øge reproducerbarhed af test resultatet på grund af materielle viscoelasticity og giver en bedre indikation egenskaber, som konstruktionen vil udstille i en klinisk ansøgning. Vi bruger 8 cyklusser af 10% stamme i en trekantet bølgeform med en sats på 10% stamme/min. før du starter mekanisk vurdering (figur 3).
Væv og celletype specifikke morfologi kan vurderes gennem histologi og Immunhistokemi med traditionelle metoder. Vi har dog konstateret at optimering af næsten alle trin af den paraffin behandling, indlejring, skæring, antigen hentning, og farvning har været nødvendigt for de manipuleret hjerte væv sammenlignet med forgyldt celler eller sectioned indfødte væv (figur 4).
Figur 1 : Beskrivelse af processen for at designe og forberede PDMS forme fra laser cut akryl masters. (A) skimmel design forberedt i vektor grafikformat. (B) rengjort laser ætset akryl negative master. (C) PDMS støbt på overfladen af den tapede akryl master mold. (D) resulterende PDMS skimmel klar til sterilisering før vævskultur. Indsatser: ovenfra, samme skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Konstruere jordpakning tidens kultur. (A) billeder af rektangulære konstruktioner udarbejdet i tredobbelt komprimering over tid i kultur. Grøn overlays repræsenterer masker bruges til at beregne synlig konstruktion området til billedanalyse. (B) Plot af construct område (en todimensional metrisk af construct jordpakning) over tid. Vandrette linjer repræsenterer de gennemsnitlige værdier og fejllinjer angiver standardafvigelsen. For alle grupper, n = 3 og * angiver p < 0,05 som vurderet af ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Rå spor for mekaniske karakterisering af manipuleret hjerte væv. Mellemværker vise en enkelt repræsentant spjæt sammentrækning trace (samme akse som hovedhandlingen). (A) aktiv mekanisk reaktion som følge af hurtige skridt efterfulgt af ventepositioner på 5% stamme intervaller. (B) passiv mekanisk reaktion som følge af et pull-til-break test med en sats på 10% stamme/min. Alle prøver blev analyseret i et 37 ° C bad i Tyrodes løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Paraffin blokere histologi billeder for manipuleret hjerte væv konstruktioner af forskellige designs. Paraffin blok histologi billeder for manipuleret hjerte væv konstruktioner af forskellige designs farves med (A) hæmatoxylin og eosin, (B) diaminobenzidine (anti-hjerte troponin T, brun) og hæmatoxylin nukleare kontrastfarve, (C ) picrosirius røde pletter for kollagen med hurtigt grøn cytoplasmatisk kontrastfarve, og (D) musen anti-α-actinin antistof (grøn) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nukleare kontrastfarve (blå). Cellejustering adskiller sig som følge af konstruktion design og væv jordpakning. Skalalinjen i A gælder for B og C samt. Indsatser i D viser tværstribede cardiomyocytes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilpassede PDMS skimmel geometrier, der er kompatible med vævskultur har stor nytte i tuning vigtigt manipuleret væv egenskaber, såsom cellejustering, diffusion rente og effektiv stivhed. Derudover er disse forme meget nyttigt for at forberede analyseprogrammer hvor geometri er vigtig, som mekanisk test16,17væv. Forberede disse enheder fra laser cut negative master forme tilbyder en hurtig, letkøbt og billig metode at udnytte disse redskaber, navnlig i forhold til tiden og omkostningerne forbundet med traditionelle microfabrication. Laserskæring tillader også en større maksimal skimmel størrelse, begrænses kun af sengens størrelse af kutteren. Vi har med held brugt disse alsidige forme til at udføre en lang række undersøgelser med manipuleret hjerte væv, herunder optiske kortlægning af aktionspotentialet formering, vurdering af force produktion og passiv mekaniske egenskaber og implantation i en rotte model af myokardieinfarkt13,18. Vi erkender, at ud over forskning niche af hjerte-kar-regenerativ engineering, ansøgninger om felter vævsmanipulering, medicinafgivelse og materialeforskning er enorme.
Mens der er få teknisk udfordrende skridt i fabrikation af formene, selv, er der en række kritiske trin involveret i at skabe funktionelle væv. Hvis konstruktioner ikke komprimere den omkringliggende matrix efter 24 h, først bekræfte cellernes levedygtighed gennem levedygtighed farvning af manipuleret væv. Hvis cellernes levedygtighed er høj, overveje at ændre konstruktionen sammensætning for det næste sæt af væv. Mens resultater vil variere meget afhængigt af cellen befolkningen, har vi observeret øget komprimering er forbundet med højere seeding tætheder og lavere kollagen koncentrationer. Endelig kan det også være nyttigt at supplere befolkningens seedede celle med en celletype velegnet til matrix remodeling, såsom fibroblaster, tilskynde jordpakning.
En begrænsning af disse forme er potentialet for PDMS til adsorberes små hydrofobe molekyler. Mens dette ikke har været problematisk for vores programmer, kan det af bekymring i assays meget følsomme over for tabet af disse molekyler. I disse tilfælde, kan PDMS protein adsorption afbødes gennem behandling med en bundmaling agent såsom polyhydrophilic eller polyzwitterionic materialer19. Alternativt kunne en steriliseret PDMS skimmel udarbejdes som en negativ master (fra en laser-ætset positive mug) for en kultur skimmel at blive kastet i en anden, ikke-adsorbent materiale, såsom agarosegelelektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender midler fra NIH R00 HL115123 og Brown University School of Engineering. De er også brun Design Workshop og Chris Bull taknemmelig for uddannelse og støtte med laser cutter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
