Summary
Synergistisk rusmiddelkombinasjoner er vanskelig og tidkrevende å identifisere empirisk. Her beskriver vi en metode for å identifisere og validere synergistisk små molekyler.
Abstract
Selv om antimikrobielle narkotika har dramatisk økt levetid og livskvalitet i20 århundre , truer resistensutvikling vår hele samfunnets evne til å behandle systemisk infeksjoner. I USA alene drepe antibiotika-resistente infeksjoner ca 23 000 ansatte et år og koster rundt 20 milliarder USD i flere helsevesenet. En tilnærming til å bekjempe resistensutvikling er Kombinasjonsbehandling, som er spesielt nyttig i kritiske tidlig stadium av infeksjon, før infisere organismen og sine narkotika motstand profil har blitt identifisert. Mange antimikrobielle behandlinger bruke kombinasjonen terapier. Men de fleste av disse kombinasjonene er additiv, betyr at den kombinerte effekten er den samme som summen av enkelte antibiotika effekten. Noen kombinasjon terapi er gjensidig forsterkende: kombinerte effekten er mye større enn additiv. Synergistisk kombinasjoner er spesielt nyttige fordi de kan hemme veksten av antimikrobielle-resistente bakteriestammer. Men er disse kombinasjonene å identifisere. Dette er på grunn av det store antallet molekyler måtte bli testet på en parvis måte: et bibliotek av 1000 molekyler har 1 millioner mulige kombinasjoner. Dermed har innsats blitt gjort å forutsi molekyler for synergi. Denne artikkelen beskriver vår høy gjennomstrømming metode for å forutsi synergistisk små molekyl par kjent som overlapper2 metoden (O2M). O2M bruker mønstre fra kjemisk-genetiske datasett for å identifisere mutanter som er overfølsom til hvert molekyl i en synergistisk par men ikke til andre molekyler. Brun laboratoriet utnytter denne veksten forskjellen ved å utføre en høy gjennomstrømming skjerm for molekyler som hemmer veksten av mutant men ikke vill-type celler. Lab arbeidet tidligere identifisert molekyler som synergize med antibiotika trimethoprim og soppdrepende narkotikabruk fluconazole bruker denne strategien. Her, presenterer forfatterne en metode til skjermen for romanen synergistisk kombinasjoner, som kan endres for flere mikroorganismer.
Introduction
Antibiotika-resistente bakterier forårsaker mer enn 2 millioner infeksjoner og 23 000 dødsfall årlig i USA i henhold til CDC1. Nye behandlinger for å overvinne disse infeksjonene. Strategier for å identifisere disse nye behandlinger inkluderer utvikling av nye antimikrobielle stoffer eller gjenbruk av små molekyler godkjent for andre betingelser for å behandle mikrobielle infeksjoner2,3,4. Men er nye stoffet funnet svært kostbare og tidkrevende. Gjenbruk narkotika kan ikke identifisere romanen narkotika eller narkotika mål5,6. Våre lab fokuserer på en tredje strategi kjent som synergistisk kombinasjon terapier. Synergistisk kombinasjoner oppstår når to små molekyler sammen har en effekt som er større enn den additiv effekten av deres personlige efficacies7. I tillegg kan synergistisk kombinasjoner være effektiv mot en patogen motstandsdyktig mot en av de små molekylene i paret i tillegg til mindre uønskede off-målet effekter, gjør dem stor potensiell8,9, 10.
Synergistisk par er sjeldne, forekommer i ca 4-10% av narkotika kombinasjoner11,12,13. Dermed er tradisjonelle teknikker som parvis skjermer utfordrende og tidkrevende, med tusenvis av mulige kombinasjoner fra et lite bibliotek av hundre molekyler. Videre kan synergistisk interaksjoner vanligvis ikke forutses fra aktiviteten av forbindelser14. Imidlertid utviklet forfatterne en høy gjennomstrømming tilnærming til skjermen for synergistiske par, kalt overlapping2 metoden (O2M)12. Denne metoden beskrevet her, gir raskere, mer effektiv identifikasjon av disse synergistisk parene. O2M krever bruk av en kjent synergistisk par og kjemisk-genetikk dataset. Kjemisk-genetikk datasett genereres når et bibliotek med knockout mutanter er dyrket i nærvær av mange forskjellige små molekyler. Hvis ett molekyl i et kjent synergistisk par induserer samme fenotypen fra en bestemt knockout mutant som andre synergistisk molekylet, bør noen andre små molekyl som utløser fenotypen fra som samme mutant også synergize med hvert medlem av kjente synergistisk par. Denne begrunnelsen er brukt i brun lab for å identifisere synergistisk antibiotika par aktiv mot Escherichia coli (E. coli) og synergistiske soppdrepende narkotika par aktiv mot sykdomsfremkallende soppen Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M er ikke bare tilpasses ulike patogener, men gir screening av store biblioteker av molekyler å identifisere synergistisk par enkelt og raskt. Screening med genetisk mutant identifisert av O2M tillater oss å validere bare disse små molekyler forutsett synergi. Dermed ville testing et 2000-molekylet bibliotek parvis ta måneder, mens hvis det var bare 20 molekyler i biblioteket spådd for å synergize, tester for synergi nå tar dager. O2M krever ikke programmeringskunnskaper, og de nødvendige utstyret er tilgjengelig i de fleste labs eller core fasiliteter. Forskere interessert i rusmiddelkombinasjoner er O2M analyse av interesse for alle som har fullført en narkotika-skjerm og ønsker å utvide deres treff ved å identifisere viktige narkotika-interaksjoner. Nedenfor er protokollen for identifisere synergistisk små molekyler i bakterier, i tillegg til å validere spådd synergistisk samhandlinger i kjente analyser15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. identifisere synergi prediksjon mutanter fra kjemisk-genetikk datasett ved metoden for overlapping2 (O2M)
Merk: Dette er metoden for å identifisere synergi prediksjon mutanter bruker publiserte datasettet fra Nichols et al. 17 i E. coli. Men kan dette gjøres på en kjemisk-genetikk datasett og mikroorganismen. Disse datasettene inneholder et bibliotek med knockout mutanter vokst i nærvær av mer enn 100 små molekyler, gir en kvantitativ vekst score for hver mutant i hver lite molekyl. En synergistisk par må være kjent, og det bør være vekst score for både små molekyler i datasettet.
-
Beregn gjennomsnittlig vekst score og standardavvik for alle mutanter vokst i nærvær av en enkelt konsentrasjon av hver lite molekyl.
Merk: Dette kan gjøres ved hjelp av et regnearkprogram. Brun laboratoriet bruker Excel og funksjonene =AVERAGE(B3:B3981) og =STDEV(B3:B3981) for beregningene av hver kolonne for små molekyl.- Beregne midler og standard avvik fra hver kolonne for små molekyl, selv om denne retningen kan variere hvis du bruker et annet dataset.
- Beregne Z score for hver konsentrasjon av små molekyl med samme datasettet fra Nichols et al. 17 i et regnearkprogram. For dette, blir negativ z score Z(2.5) = mener - 2.5 * standardavvik, og positiv z score vil bli Z(2.5) = betyr + 2,5 * standardavvik.
- Avgjøre hvilket gen mutanter inneholder betydelige Z score i de små molekylene som utgjør kjent synergistisk paret, husk å betrakte alle konsentrasjoner av disse molekyler. Hvis veksten av en mutant er mindre enn negative Z (2,5) score eller er større enn positive Z (2,5) poengsummen for at små molekyl, anses betydelig.
- Avgjøre hvis noen av betydelig genet mutanter tilhører en operon.
Merk: For E. coli, forfatterne anbefaler sjekke "Ecoli wiki" for informasjon om hvis gener er transkribert som en del av en polycistronic RNA. - Identifisere genet/operon mutanter som er felles for fleste av de små molekylene av interesse i ulike konsentrasjoner (f.eks. når jakt etter molekyler som synergize med det antibiotikumet trimethoprim, identifisere mutanter som viser en betydelig Z resultat når dyrket i nærvær av trimethoprim og kjente synergistisk partnere som sulfamethizole eller sulfamethoxazole). Dette er antatte synergi prediksjon mutanter.
2. over Synergizers i kjemisk-genetikk datasettet av O2M
- Tilbake til dataset17, identifisere hver konsentrasjon av små molekyl som utløser en betydelig vekst poengsum fra synergi prediksjon mutant. Dette gjøres ved å se på Z poengene beregnes for hver konsentrasjon av små molekyler. Igjen, en betydelig vekst score er mindre enn den negative Z score eller større enn positive Z poengsummen for at konsentrasjonen av små molekyl.
Merk: Hvis et molekyl vises med en av sine konsentrasjoner, molekylet regnes med en anslått synergizer. Et molekyl som ikke framprovosere en betydelig vekst score er en forventet ikke-synergizer.
3. validering av spådd synergistisk interaksjoner
- Finne minimal inhibitoriske konsentrasjon (MIC) av forventet synergizers.
- Vokse en overnatting kultur av E. coli i M9 minimal medier på 37 ° C.
Merk: Noen overnatting kultur kan dyrkes i riktig definert medium for organismen rundt. Brun laboratoriet anbefaler ikke rik media som LB eller YPD. M9 minimal media består av 10,5 finans M9 kjøttkraft, 0,2% casamino syrer, 0.1 M CaCl2, 0,4% glukose, 1 M MgSO4, 0,25% nikotinsyre og 0,33% Thiamin i H2O. - Hvis ingen MIC data for patogen rundt er funnet i litteraturen ved mottak av små molekyler, løses i dimethyl sulfoxide (DMSO) på en høy konsentrasjon (> 10 mg/mL).
- Bruker en 96-brønns tallerken, Legg 100 µL av M9 media i hver brønn. Legge til en ekstra 100 µL av M9 media i kolonne 1 slik at det inneholder totalt 200 µL.
- Legge til en vilkårlig mengde (~ 10 µL) konsentrert små molekyl løsning i kolonne 1. Ett lite molekyl per brønn i kolonne 1 (8 små molekyler per plate).
Merk: Dette er små molekyler av interesse, som er spådd for å synergize. Brun laboratoriet vanligvis legger 10 µL av svært konsentrert små molekyl løsning, som er under mengden av 100% DMSO som kan hemme E. coli. - Når de små molekylene har lagt, fortynne de små molekylene over x-aksen av platen. Ta 100 µL av løsning fra kolonne 1, plasser i kolonne 2 og bland. Ta 100 µL fra kolonne 2, plasser i kolonne 3 og blande. Fortsett denne prosessen inntil 100 µL plasseres i kolonnen 11. Bland kolonnen 11, deretter ta 100 µL fra kolonnen og kast. La kolonnen 12 med bare media til å normalisere dataene.
- Vaksinere platen. Få optisk densitet (OD600) fra en over natten kultur. Forberede en løsning med kultur og M9 media en OD600 av 0,002 (eller passende konsentrasjon som representerer 500 celler/µL for ønsket organismen av interesse). Pipetter 2 µL av kultur løsning i hver brønn av platen så det er 1000 celler per brønn.
- Forsiktig riste platen og få OD600 for 0 h lesing. La platen vokse ved 37 ° C i 24 h. motta OD600 for 24 h lesing.
Merk: Bruk passende vokser betingelser for andre organismer rundt. - Beregne netto vekst for hver godt med et regnearkprogram.
- Gjennomsnittlig netto veksten av kolonnen 12 å få gjennomsnittet ingen vekst. Normalisere andre brønnene til gjennomsnittet av ingen vekst ved hjelp av et regnearkprogram. Se etter noen godt med mindre enn 10% vekst å identifisere MIC90. Noen bra med mindre enn 50% vekst angir MIC50. Beregn konsentrasjonen av små molekyl i disse brønner.
- Vokse en overnatting kultur av E. coli i M9 minimal medier på 37 ° C.
- Sjakkbrett analyser for synergistiske interaksjoner
- Vokse en overnatting kultur av E. coli i M9 minimal medier som før.
Merk: Bruk passende vokser betingelser for andre organismer. - Tilsett 100 µL av M9 media hver brønn en 96 godt plate og en ekstra 100 µL i kolonne 1.
- Legge til test små molekyl (~ 8 x MIC) til hver bra i kolonne 1 og legge til dobbel konsentrasjonen (~ 16 x MIC) til godt A1 (ett lite molekyl testet per plate).
Merk: Dette beløpet bestemmes fra mikrofon test gjennomført forutgående og er forskjellig for hver potensielle synergizer. - Opprette en gradient fortynning på x-aksen ved tar 100 µL fra kolonne 1 og overføre til kolonne 2. Fortsett denne prosessen inntil 100 µL legges til kolonnen 11. Bland, så ta 100 µL fra kolonnen 11 og kast. Ikke Legg noen narkotika kolonne 12 (figur 1A).
- Angi andre narkotika graderingen over y-aksen for input medikament. Legg 100 µL av mediet som inneholder 2 x MIC av input molekylet i raden A. Mix og fortynnet som før, tar 100 µL fra rad A og plassere i B. Fortsett til 100 µL er plassert i raden G. Mix, ta 100 µL og kast, sikre ikke for å legge til alle innspill narkotika i raden H. Dette gjør rad H- og 12 inneholder enkelte mikrofoner av narkotika par testet (figur 1B).
- Vaksinere platen. Tilsett 2 µL av en E. coli kultur OD600 0,002 hver brønn (1000 celler per brønn).
- Måle OD600 av hver brønn i platen for 0t lesing.
- Inkuber platen i 24 timer på 37 ° C.
- Måle OD600 av hver brønn på 24 h.
- Vokse en overnatting kultur av E. coli i M9 minimal medier som før.
- Beregner brøkdelen inhibitoriske konsentrasjon indeksen (FICI) fra sjakkbrett
- Beregne netto vekst for hver brønn av platen ved å trekke i OD600 på 0t OD600 på 24 h i et regnearkprogram.
- Normalisere veksten i programvaren ved å dele hver bra ved brønnen H12, som inneholder ingen små molekyl.
- Finne MIC90 av input molekyl i kolonnen 12 og MIC90 av den potensielle synergist i raden H.
- Se alle brønner som hemmer 90% av vekst.
- Beregne FICI90 for brønnen som enten det laveste nedenfor (synergistisk) eller over (antagonistisk) to MIC90 verdier, ved hjelp av formelen:
- Vurdere noen FICI ≤ 0,5 som synergistiske og FICI ≥ 4 som antagonistiske (figur 2).
Merk: Dette kan også gjøres med MIC50 (50% hemming av vekst) å få en FICI50 basert på verdiene MIC.
- Bliss uavhengighet analysen
Merk: Bliss uavhengighet drives med alle mulige synergist som ikke hadde en mikrofon på egen hånd.- Vokse en overnatting kultur av E. coli i M9 media ved 37 ° C, som før.
Merk: Igjen, aktuelle forholdene for andre organismer rundt kan brukes i dette trinnet. - Forberede 96-brønns plater potensielle synergistisk molekylet, input molekylet, kombinasjonen og en ikke-behandlet kontroll.
- Opprette potensielle synergist platen ved å legge til 50 µL av M9 media i hver brønn. Legge til 50 µL av mediet som inneholder et sett konsentrasjon (10 µM eller 100 µM) av den potensielle synergist i hver brønn en rad. Teste 8 molekyler per plate.
- Opprette input molekyl platen ved å legge til 50 µL av media i hver brønn. Legge til 50 µL inneholder 4 x MIC input stoffer i hver brønn i kolonne 1. Opprett en gradient fortynning langs x-aksen ligner på MIC plater, tar 50 µL fra kolonne 1, spre og blande i kolonne 2. Fortsett denne prosessen inntil kolonnen 12, kaster 50 µL fra kolonnen 12. Legge til en ekstra 50 µL av media i hver brønn slik sum for hver brønn er 100 µL.
- Oppretter kombinasjon platen ved hjelp av en 96 godt tallerken, Legg 50 µL av media i hver brønn. Legge til 50 µL inneholder 4 x MIC input stoffer i hver brønn i kolonne 1. Fortynne langs x-aksen ligner på MIC plater, tar 50 µL fra kolonne 1, spre og blande i kolonne 2. Fortsett dette hele veien til kolonnen 12, kaster 50 µL fra kolonnen 12. Legge til 50 µL av mediet som inneholder den potensielle synergist på 10 µM eller 100 µM hver brønn en rad. Igjen, bør det være en konsentrasjon eller narkotika per rad.
- Opprette ikke-behandlet kontrollen ved å legge til 100 µL av M9 media alle brønnene av platen.
- Vaksinere alle platene ved å legge 2 µL av bakteriell kultur med et OD600 0,002 eller 1000 celler i hver brønn som før.
- Måle OD600 av hver brønn på 0 og 24 timer.
- Vokse en overnatting kultur av E. coli i M9 media ved 37 ° C, som før.
- Beregne Bliss uavhengighet Score
- Beregne netto vekst for hver brønn av platen ved å trekke i OD600 på 0t fra vekst på 24 h bruke regnearkprogrammer.
- Normalisere brønnene til gjennomsnittlig vekst fra ingen narkotika platen i et regnearkprogram.
- Bruke regneark, beregne hemming ved å trekke netto vekst fra 1.
- Gjennomsnittlig kolonnene i kontroll platen inneholder bare input forløpningen i regneark programvaren.
- Beregne bliss score for hver brønn ved ligningen:
Bliss poeng = (godt X + input kolonnen X) -kombinert godt X - Se etter negativ score i brønner under MIC90 av input.
Merk: Negativ score på tvers av flere konsentrasjoner skulle tilsi en synergistisk interaksjon.
4. høy gjennomstrømming skjermen med synergi prediksjon mutanter å identifisere romanen synergistisk par
-
Identifisere synergi prediksjon mutanter
Merk: Trinn 1.5 identifisert antatte synergi prediksjon mutanter. Her vi finne ut hvilke av disse mutanter vil fungere best i høy gjennomstrømming skjermen for synergistiske narkotika. Vi utførte denne analysen i en Bioscreen maskin, men 96 godt plate lesere bør også være akseptabelt.- Vokse hver antatte synergi prediksjon mutanter og vill-type celler i M9 minimal media.
- Sett opp 100 honeycomb godt plate (eller 96 godt plate) med riktige oppblomstringen medium, oppblomstringen medium + input narkotika, oppblomstringen medium + kjent synergistisk partner av input stoffet, og oppblomstringen medium + kjent ikke-synergistisk narkotika. Sørg for å inkludere bilen kontroller.
Merk: Vi anbefaler fire gjenskape brønner for hver stamme/stoffet/konsentrasjon. - Vaksinere 1000 celler per brønn, inkludert tomme kontroll brønner.
- Vokse 48t ved 37 ° C, med risting, og lese OD600 hvert 20 min.
- Bestemme narkotika konsentrasjon og tid punkt som viser største vekst forskjellen mellom vill-type og synergi prediksjon mutant celler i nærvær av input stoffet og kjente synergistisk partnere. På optimale tidspunkt og konsentrasjon, bør det ikke være mye vekst forskjellen mellom vill-type og synergi prediksjon mutant celler når dyrket i nærvær av medikamenter kjent ikke handle synergi med input stoffet (Figur 3).
-
Høy gjennomstrømming skjermen for synergistiske narkotika
- Vokse vill-type celler og synergi prediksjon mutant celler i M9 minimal medier.
Merk: Bruk passende oppblomstringen medium for organisme rundt. - Legge narkotika fra biblioteket til media så hver godt som inneholder 100 µL media med små molekyler på Angi konsentrasjon som ble fastsatt i forrige trinn. Inkluderer tom (uten celler) og førte med bilen kontroller (e.g., DMSO) å ta hensyn til eventuelle vekst hemming av narkotika fortynning kjøretøyet.
- Forbered minst fire kjøretøy kontroll brønner per plate, ideelt spredt over platen til kontoen for godt posisjon effekter. Hvis analyser er variabel, deretter ta minst ett kjøretøy kontroll per rad/kolonne og bruke hver rad/kolonne-kontroll samt kontrollen til å beregne Z score for hver rad/kolonne i stedet for for en hel tallerken (trinn 4.2.5).
- Tilsett 2 µL av kultur hver brønn som før. (En plate for vill type bakterier og en plate for spådd synergi mutant bakterier).
- Vurdere OD600 på 0 og 18 h E. coli eller 48t for C. neoformans.
- Bruke regneark, beregne netto veksten ved å trekke i OD600 tom brønner fra kjøretøy kontroll brønnene. Identifisere brønner med Z-score på-2.5 (Z score = bety - 2.5 * standardavvik). Disse brønnene inneholder en potensiell synergist små molekyl.
- Validere skjermen treff ved hjelp av metodene beskrevet i trinn 3.
- Vokse vill-type celler og synergi prediksjon mutant celler i M9 minimal medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sjakkbrett analyser er en semi kvantitativ metode for å måle synergistisk interaksjoner. Sluttresultatet utgang, FICI, bestemmer hvis et medikament kombinasjon anses synergistisk (FICI ≤0.5), ikke-samspill (0,5 < FICI < 4), eller antagonistiske (FICI ≥4.0). Figur 1 illustrerer hvordan du setter opp stoffet graderingene i en dambrett analysen. Figur 2 viser felles resultater. Vurdere vekst (lilla wells) som viser mindre enn 90% vekst hemming. Etter måling OD600 av hver brønn i en plate, normalisere vi alt til ingen stoffet kontrollen godt. Noe med en normalisert verdi > 0,1 (10% av de OD600 i kontrollen godt) er scoret som "vekst". FICI resultater kan variere avhengig av som godt er plukket; Vi velger brønnen som gir den laveste FICI for hver plate. I figur 2A, det ville være godt F9 (kolonner er nummerert, rader lettered), = med en FICI 0,07. I figur 2B, beregnes FICI fra godt C3 (FICI = 1.0). Hvis antagonistiske interaksjoner, se etter høyest FICI mulig poengsum. I figur 2Cberegnes FICI fra godt A1, som gir en FICI av 8.0.
Optimal screening betingelser vil hindre et høyt antall falske positiver fra skjermen, som sparer tid og penger. Når vi optimalisert synergi prediksjon mutanter for sopp Cryptococcus neoformans, testet vi input stoffet (fluconazole), fire kjent ikke-synergistisk narkotika (koffein, climbazole, trimethoprim og brefeldin A), og fem av fluconazole's synergistisk partnere (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin og FK506, alle i Chandrasekaran, S. et al. 18). siden vi oppdaget disse molekylene gjennom O2M analyse (delene 1 og 2), vi forventet de kjente synergizers til selektivt hemmer veksten av synergi prediksjon mutant celler men ikke vill-type celler. For å maksimere den forventede vekst forskjellen, testet vi en rekke konsentrasjoner for hver lite molekyl, hvorav de fleste var sub-inhibitory.
Eksempel resultatene vises i Figur 3. Et molekyl som ikke handler synergi med flukonazol, brefeldin A, hemmet vill-type og synergi prediksjon mutant vekst bare litt, og omtrent like mye. Rifamycin (figur 3B), veksten av synergi prediksjon mutant (cnag_03917Δ) var hemmet, men vill-type cellevekst var ikke. Det var størst vekst forskjellen mellom 32 og 49 h etter vaksinasjon, så timepoint for screening er i dette området. Vekst kurver av andre synergistiske og ikke-synergistisk molekyler lignet rifamycin og brefeldin A, henholdsvis.
Figur 1 : Skildring av sjakkbrett analysen fra trinn 3. Test narkotika og innspill narkotika graderingene er illustrert i A og B, henholdsvis. Den endelige analyse platen skal vises som C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Grafisk resultatene av sjakkbrett analysen. Illustrasjoner av synergistisk, ingen, og antagonistiske interaksjoner er avbildet i A, B og C, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksempeldata for å identifisere screening tid. (A) vill-type (grønn) og synergi prediksjon mutant (blå) av C. neoformans vokst i nærvær av en brefeldin A, et lite molekyl kjent for ikke synergize med fluconazole. Vill-type kontroll (mørk grønn) og narkotika behandlet (lys grønn) har en tilsvarende forskjell i vekst synergi prediksjon mutant kontroll (mørk blå) og narkotika behandlet (lys blå). (B) vill-type og synergi prediksjon mutant vokst i nærvær av rifamycin, et lite molekyl kjent for synergize med fluconazole. Vill-type kontroll (mørk grønn) og narkotika behandlet (lys grønn) har mindre vekst forskjell enn synergi prediksjon mutant kontroll (mørk blå) og narkotika behandlet (lys blå). Den største forskjellen er observert på 48 timer for kjente synergistisk molekylet og forskjellen ligner på det tidspunktet for kjent ikke-synergistisk molekylet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Synergistisk små molekyl parene kan være et kraftig verktøy i behandling av mikrobielle infeksjoner, men de har ikke nådd full kliniske potensialet fordi synergistisk par utfordrende å identifisere. Denne artikkelen beskriver en metode for å identifisere synergistisk par mye raskere enn enkel parvis kombinasjoner. Ved å bruke kjemiske-genetikk datasett, identifiserer O2M mutanter med gene fortrenging som kan brukes som en presentasjon til skjermen store biblioteker av små molekyler slik synergistisk par. Muligheten til å forutsi små molekyler gir høy skalerbarhet av skjermer, som igjen gjør for storskala identifikasjon av synergistisk partnere. Etter identifisere synergistisk par, kan en belyse molekylær mekanisme underliggende synergistisk interaksjoner og rasjonelt designe flere synergistisk par11.
O2M krever en kjemisk-genetiske datasett og et kjent synergistisk par. Heldigvis er kjemisk-genetikk datasett vanlig for en rekke mikrober19,20,21. Brun laboratoriet viste tidligere at O2M finner vellykket synergistisk par i både C. neoformans og E. coli11,12. Dette viser at den bred innflytelse O2M har som en skalerbar metode som generelt gjelder for en rekke organismer. Alle stegene kan endres for veksten av et annet microorganism med relativt lik resultater, dermed O2M et verdifullt verktøy for generell identifikasjons synergistisk par. Flere andre grupper identifiserer synergistisk kombinasjoner fra kjemisk-genetikk datasett ved forskjellige analytiske metoder, selv om O2M krever minst programmering kunnskap om noen av disse metodene. Hver metode identifiserer ulike typer synergistisk antibiotika eller antifungals 18,22,23,24, antyder at mange synergistiske par fortsatt. O2M og andre synergi prognosen metoder er også potensielt gjelder pattedyr systemer, inkludert identifisere kreft rusmiddelkombinasjoner.
I sum beskriver denne metoden en rask måte å skjermen for synergistiske par fra en kjemisk-genetikk datasett. Denne metoden og andre hjelpe synergistisk par blir mer gjennomførbart behandlingsalternativ i klinikker. I tillegg beviser O2M's rask og generalisert metode det et verdifullt verktøy når søker ut synergistisk små molekyl par.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en oppstart stipend fra avdeling for patologi, Universitetet i Utah til J.C.S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al.
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
