Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

Connaissances sur le développement du cerveau et les maladies du cerveau a considérablement amélioré depuis la première quantification de cerveau de souris transcriptomes¹ces dix dernières années. En effet, analyse du génome de l’expression génique large nous donne accès à l’information génétique détaillée sur les tissus du cerveau et des cellules qui peuvent compléter et améliorer les observations faites avec d’autres techniques et outils.

Le poisson-zèbre est un modèle biologique puissant, facile à reproduire et à modifier génétiquement ; sa transparence optique à l’état larvaire permet aux vivants d’observations d’imagerie². Malheureusement, par rapport aux humains et de souris, le nombre d’anticorps disponibles pour effectuer l’immunomarquage est plutôt faible. Pour remédier à cela, lignes de poissons transgéniques zebrafish se font facilement en modifiant génétiquement des poissons pour exprimer les protéines fluorescentes sous promoteurs spécifiques de type cellulaire. Lignes de poissons zèbres transgéniques ont été utilisés dans le passé pour étudier le rôle des macrophages et des cellules microgliales pendant le développement du système nerveux central (SNC) et la maladie^3,4,5,6. Cependant, pour acquérir une compréhension détaillée de ces processus, nous avons besoin de comprendre les changements dans l’expression des gènes dans les types cellulaires respectives. Dans ce but, nous avons développé une méthode expérimentale pour isoler spécifiquement des cellules, comme les neurones, les macrophages et les cellules microgliales de 3 à 8 jours cerveaux de larves de poisson zèbre après fécondation (dpf). Pour la mise en place du protocole, nous avons travaillé avec des lignées de poissons transgéniques qui expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans les macrophages/la microglie dans le promoteur du gène exprimés par les macrophages (mpeg1:eGFP) et la DsRed dans les neurones en vertu de la ß-tubuline neurale promoteur (NBT:DsRed)^7,8,9. En outre, nous avons effectué immunomarquage des microglies utilisant 4 4, un anticorps monoclonal de souris qui taches spécifiquement zebrafish microglie^10,11. Par la suite, l’acide ribonucléique (ARN) est extraite de ces cellules d’autres réaction en chaîne de polymérase quantitative (qPCR) ou analyse du transcriptome. Ce protocole a été conçu pour homogénéiser efficacement les tissus cérébraux des larves de poisson zèbre ; recueillir des neurones, des macrophages/microglie et des microglies sans altération de leur intégrité de la membrane plasmique et enfin extraire RNA de ces cellules en haute qualité (RIN > 7) et la quantité à effectuer des analyses génomiques. Contrairement aux études déjà publiées qui utilisent le traitement par la trypsine à 37 ° C à digérer le tissu de cerveau^12,13, ce protocole favorise le travail à 4 ° C jusqu'à l’étape d’extraction RNA pour réduire les modifications du profil de l’expression génique. Cette étape est cruciale comme la microglie et les macrophages sont des cellules très sensibles qui réagissent aux changements de leur microenvironnement immédiatement en altérant leur gene expression profil et polarisation^{14,15, 16}.

Le protocole, décrit ici en détail, montre que l’isolement des neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau larves de poisson zèbre, mais pratiquement, il peut être adapté à n’importe quelle autre cellule présente dans le cerveau - à l’aide de lignes de poissons transgéniques ou étiquetés au moyen anticorps spécifiques. Cette méthode permettra une meilleure caractérisation des cellules de la CNS à travers leurs analyses d’expression de gène large du génome et aidera à comprendre leur rôle lors du développement et de maladies du cerveau.

1. échantillonnage et préparation des médias

1. Préparer les moyennes de l’embryon (E3) en dissolvant 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl₂ 2 H₂O, 0,33 mM MgSO₄ 7 H₂O H₂O.
2. Recueillir des embryons de poisson-zèbre immédiatement après la fécondation (0 dpf).
   1. Diviser des embryons de poisson-zèbre en 50 par 90 mm boîte de Pétri. Soulever les embryons à 28,5 ° C dans 50 mL de milieu de l’embryon (E3) traité avec 200 µM 1-phényl 2-thiourée (PTU), de la fin de la première journée du développement (0 dpf) pendant la durée de l’expérience pour inhiber la pigmentation.
   2. Changement l’E3 + PTU moyennes par jour pendant la durée de l’expérience.
   3. Mpeg1:eGFP d’écran et des larves de NBT:DsRed à 2 dpf utilisant un stéréomicroscope fluorescent d’expression du transgène positive, GFP⁺ macrophages/microglie et DsRed⁺ neurones.
3. Préparez tous les médias le jour avant l’expérience sous une hotte de culture de tissus pour éviter la contamination, puis les stocker à 4 ° C.
   1. Préparer les médias A en dissolvant 15 Hepes et 25 mM D-Glucose en HBSS 1 x.
   2. Préparer le milieu de gradient de densité (100 %) en mélangeant 9 volumes du milieu de gradient de densité 1 volume de HBSS 10 x.
   3. Préparer le milieu de gradient de densité (22 %), en diluant 22 mL de milieu de gradient de densité (100 %) à 88 mL de SPD 1 x.
   4. Préparer le SPD 1 x.
   5. Préparer des E3 moyen + tricaïne en mélangeant E3 moyen avec 450 μM tricaïne.

2. homogénéisation

Remarque : Toutes les étapes sont exécutées 4 ° C.

1. Ajouter 1,5 mL de tricaïne (15 mM) à 90 mm de Pétri contenant 50 larves dans 50 mL de milieu d’embryon E3 traité avec 200µm PTU à anesthésier en phase terminale eux.
   1. Aspirer 10 larves anesthésiés depuis les boîtes de Pétri avec une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 mL.
   2. Larves de transfert anesthésié 10 par 10 dans une boîte de Pétri 55 mm rempli de glacee moyen d’embryon E3 + tricaïne.
   3. Sous un stéréomicroscope, aligner 10 larves dans le centre de la boîte de Pétri. Puis transect larves tête hors du sac vitellin à l’aide de micro-ciseaux chirurgicaux (exclure la vessie natatoire pour éviter flottant têtes).
   4. Aspirer les chefs des boîtes de Pétri avec une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 mL. Attendez que toutes les têtes se rassemblent au sein de l’embout de la pipette et puis de les transférer dans un homogénéisateur de verre contenant 1 mL glacee Media A (transfert dans un volume minimal pour réduire les médias une dilution par E3 + tricaïne). Garder l’homogénéisateur de verre sur la glace. Utilisez un homogénéisateur par condition expérimentale.
   5. Remplacer chaque petite boîte de Pétri contenant de glace froide E3 + tricaïne avec un nouveau toutes les 30 minutes afin d’assurer que la résection est effectuée en froid E3 + tricaïne moyen.
   6. Remplacer le glacé A de médias de l’homogénéisateur de verre fondu au démarrage la couleur.
      Remarque : Dilution A Media peut altérer le tissu de siège en raison de changements de température.
   7. Une fois que tous les chefs ont été collectées (600 têtes/État), supprimer le volume maximum de médias A de l’homogénéisateur de verre et la remplacer par 1 mL frais glacé Media a
   8. Perturber le tissu de cerveau avec un homogénéisateur verre serré sur la glace. Effectuer 40 tours de broyage et de tours pour 3-5 larves de dpf et 50 pour les larves de dpf 7 et 8.
2. Ajouter 2 mL de médias A suspension cellulaire (1 mL médias / 200 têtes), qui va diluer les cellules et réduire leur agglomération avec la myéline pour faciliter leur séparation pendant la centrifugation dans milieu de gradient de densité.
   1. Pour éliminer l’agglomération de cellule, exécutez la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm placé au dessus d’un tube de faucon de froid 50 mL maintenu sur la glace. Répéter cette opération 3 fois.
   2. Transférer 1 mL de suspension cellulaire dans des tubes à froid 1,5 mL et leur filer à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
   3. Retirez le surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL + aiguille 23 x 1''.
3. Resuspendre le culot cellulaire avec 1 mL de milieu dégradé de glacee 22 % densité délicatement recouvert par 0,5 mL de SPD glacée 1 x (do mélangez pas à eux, une interphase entre les deux solutions on le verra).
   1. Faites tourner les tubes à 950 g sans frein et d’accélération lente pendant 30 min à 4 ° C.
      Remarque : Cette étape sépare de la myéline des autres cellules par séquestration il à l’interphase de SPD 1 x et milieu gradient de densité de 22 %, alors que les cellules seront granulé au fond du tube. Enlèvement de la myéline est plus efficace quand la concentration cellulaire n’est pas trop élevée.
   2. En utilisant une seringue de 10 mL + aiguille 23 x 1'' jeter le maximum de SPD, milieu de gradient de densité et la myéline piégé à leur interphase.
   3. Laver les cellules avec 0,5 mL de médias A + 2 % de sérum de chèvre normal (NGS), puis faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
   4. Jeter le surnageant au maximum, puis mettre en commun toutes les boulettes de cellule de la même condition expérimentale ensemble dans 1 mL de médias + 2 % NGS.
4. Si les cellules d’intérêt expriment une protéine fluorescente comme macrophages/microglie de mpeg1:eGFP ou les neurones des NBT:DsRed poissons transgéniques (dépistage des poissons transgéniques voir 1.1.3), exécutez la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 35 µm cap et transférez-les dans un tubes froid 5 mL FACS sur ice, abri de la lumière.
   Remarque : Par ailleurs, immunomarquage des microglies peut être effectuée.

3. la microglie Immuno-coloration

Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à 4 ° C.

1. Resuspendre le culot cellulaire avec 0,3 mL de médias + 2 % NGS. Divisez-les en tubes de 3 x 1,5 mL : un pour les cellules incolores sur mesure auto-fluorescence des cellules d’intérêt, deuxième pour l’anticorps secondaire (1/200) mesurer la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire dans la microglie et troisième comme un test (4 4 souris monoclonal anticorps (microglies spécifique) (1/20) + anticorps secondaire (1/200)).
   1. Ajouter faible endotoxine, exempte d’azoture (feuille) à 1 % pour les cellules (tous les tubes) pour bloquer les interactions CD16/CD32 avec le domaine Fc des immunoglobulines. Incuber les cellules pendant 10 min avec agitation douce toutes les 5 min.
   2. Ajouter les 4 4 anticorps (1/20) aux cellules (tube 3) et incuber pendant 30 minutes avec agitation douce toutes les 10 min.
   3. Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.
   4. Laver une fois avec 0,5 mL de médias A + 2 % NGS, puis essorer tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
   5. Une nouvelle suspension du culot avec 0,5 ml de médias + 2 % NGS et incuber les cellules avec des feuilles à 1 % pendant 10 min avec agitation douce toutes les 5 min.
   6. Ajoutez l’anticorps secondaire (1/200) aux cellules (tube 2 et 3). Incuber les cellules pendant 30 min avec agitation douce toutes les 10 min et protection contre la lumière.
   7. Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.
   8. Laver deux fois avec 0,5 mL de médias + 2 % NGS, puis remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 mL de médias + 2 % NGS.
2. Exécuter la suspension cellulaire en établissant un plafond de crépine 35 µm cellulaire et de les transférer dans des tubes à froid 5 mL FACS sur ice, abri de la lumière.

4. cellule triant (FACS)

Remarque : Effectuez toutes les opérations à 4 ° C.

1. Trier les neurones, macrophages/microglie et la microglie en utilisant un FACS.
   Remarque : Cette étape est généralement effectuée par un membre du personnel de l’installation de FACS et paramètres dépendent du type de matériel utilisé.
   1. Ajouter DAPI à une concentration de 1 µg/mL dans chaque tube de FACS d’étiqueter les cellules mortes.
   2. Définir les neurones FACS et tri, macrophages/microglie ou microglie de toutes les cellules du cerveau. Séparer les cellules des débris en fonction de leur taille et la granularité, puis single-cellules de forward scatter et diffusion latérale de la porte. Exclure les cellules mortes par DAPI marquage de cellules vivantes. Identifier les neurones, les macrophages/microglie ou microglie par leur coloration positive respectifs.
2. Prélever des cellules dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de glacé de médias A + de 2 % end sur la glace. Utilisez des tubes différents pour chaque type de cellule.
   1. Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite jeter le surnageant.
   2. Laver une fois avec 0,5 mL de médias A puis jeter le liquide surnageant au maximum.

5. Extraction de l’ARN

1. Extrait les différents types de cellules séparées par des FACS de RNA. Pour extraire l’ARN utilise un kit spécifique et suivre les directives du fabricant. Vérifier que vous travaillez dans un environnement libre de RNase par espace de travail de nettoyage et des pipettes avec un produit de décontamination de RNase et utiliser des pointes à filtre.
   1. Fraîchement préparer 1 mL de tampon de lyse additionné de 50 µM de β-mercaptoéthanol.
      Remarque : Ici, les β-mercaptoéthanol est ajouté pour réduire la dégradation de l’ARN.
   2. Préparer de solution d’éthanol à 70 % et 80 % à l’aide de RNase eau gratuite.
   3. Lyse des cellules avec 75 µL de tampon de lyse additionné de 50 µM de β-mercaptoéthanol. Puis utilisez un broyeur pour améliorer la désorganisation de la cellule.
   4. Continuer le Guide de l’extraction de l’ARN selon le fabricant.
   5. À la fin du protocole, éluer l’ARN avec 14 µL d’eau libre de RNase pour obtenir une concentration suffisante d’ARN.

Le protocole décrit est une approche simple d’isoler les neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau larves de poisson zèbre. Ces isolé des cellules, des quantités importantes de haute qualité (RIN > 7) RNA ont été extraites. Le but du présent protocole est d’isoler les différents types de cellules du SNC, avec une modification minime de leur profil d’expression génique d’analyser et de caractériser les fonctions et les propriétés de cellule. Par conséquent, l’ensemble du protocole est effectué à 4 ° C avec une homogénéisation de tissu de cerveau mécanique. Cette méthode a été utilisée avec succès pour les deux études réalisées en laboratoire. Dans la première étude, les neurones et les macrophages/microglie ont été isolées 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larves (Figure 1). FACS permis la séparation des cellules des débris en fonction de leur taille (FSC-A) et la granularité (SSC-A) (Figure 1A). Cellules individuelles ont ensuite été séparés de doublets ou agglomérés (Figure 1B) de la cellule. De la population de cellule unique, une porte a été dessinée pour éliminer les cellules mortes (DAPI+). L’intrigue de point correspondant a révélé que ce protocole expérimental préserve l’intégrité cellulaire membrane plasmique, le taux de cellules mortes est seulement 26,7 % (Figure 1C). Enfin, les neurones (DsRed+) et les macrophages/cellules microgliales (GFP+) étaient facilement séparés depuis les portes de la population de cellules vivantes. La population de neurones (23,1 %) semble être plus important que la population de macrophages/cellules microgliales (1,56 %) dans le cerveau (Figure 1D). Ce protocole a permis d’isoler l’ARN à partir de ces cellules pour effectuer des analyses ultérieures de qPCR pour comparer l’expression des gènes spécifiques entre les neurones et les macrophages/microglie. La figure 2 illustre neuronale et macrophages/microglie niveaux d’expression de gène de l' antigène nucléaire de prolifération cellulaire (pcna)en regard du gène β-actine de ménager à titre d’exemple.

Pour la seconde étude cette méthode axée sur la microglie isolement de 3, 5 et 7 dpf cerveau larvaire. Contrairement à l’expérience décrite ci-dessus, les cellules ont été isolées par immunomarquage à l’aide de 4 4, un anticorps qui étiquète spécifiquement la microglie (Figure 3 A-D). Comme décrit précédemment, la microglie (4 4+) ont été sélectionnés dans des cellules vivantes et recueillies (Figure 3D). Les nombres de la microglie dans les cerveaux larves de poisson zèbre sont variables (tableau 1) et très bas à 3 dpf (∼ 25 par poisson). Qualité et la quantité d’ARN extrait de ces cellules ont été mesurées à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire-micro basé. Résultats obtenus de l’ARN extrait des cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre dpf 5 ont été fournis pour illustrer un exemple d’analyse de RNA (tableau 1 (dpf 5 ; expérience 4)). La figure 4 montre la trace de l’électrophorèse et de sa représentation graphique obtenue pour cet exemple avec une visualisation claire de l’ARN ribosomique (28 s et 18 s). Ces données sont nécessaires pour calculer l’échantillon RIN et déterminer la concentration en ARN. Le tableau 1 résume le nombre de microglie isolé par les poissons, la quantité d’ARN par la microglie et la note de RIN obtenue pour chacune des expériences différentes à 3, 5 et 7 dpf. La quantité et la qualité de l’ARN extrait de microglie isolée à l’aide de cette méthode nous a permis d’amplifier l’ARN en ADNc à l’aide d’un kit. Des tests qualité et la quantité fournies par Édimbourg génomique confirment que l’ADNc amplifié est d’une qualité suffisante pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage subséquent. La figure 5 montre la distribution de taille des fragments d’ADNc et leur hauteur d’eau mesurée à l’aide d’un système d’électrophorèse. Dans cet exemple, l’ADNc affichait une taille moyenne de 299bp à une concentration de 36100 pmol/l. le tableau 2 illustre respectivement qualitativement et quantitativement les essais effectués sur ADNc amplifié des échantillons d’ARN (tableau 1 (dpf 5 ; expérience 4)). L’ADNc amplifié a été utilisée avec succès pour le séquençage.

Plusieurs études menées en laboratoire ont confirmé que la qualité et la quantité de l’ARN extrait des neurones, les macrophages et les cellules microgliales utilisable pour qPCR ultérieur et les analyses d’expression de gène large du génome. Par conséquent, ce protocole expérimental peut servir à isoler efficacement différents types de cellules de CNS sans altérer leur intégrité membranaire et limiter la modification de leur profil d’expression génique.

Figure 1 : FACS trier des neurones et des macrophages/microglie de /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ 8 larves de poisson zèbre dpf. (A-C) Gating successives montre une sélection séquentielle de tous les cerveau des cellules (A), dispersent de cellules individuelles de dispersion vers l’avant et de côté (B). Les cellules mortes (C) ont été exclus par marquage au DAPI. (D) les neurones et les macrophages/microglie ont été identifiés respectivement par une coloration positive DsRed et GFP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse de l’expression génique pour pcna et β-actine dans les neurones et les macrophages/microglie. ARN de neurones isolés et macrophages/microglies peut être transcrit en ADNc devant servir à une analyse par PCR quantitative. niveaux d’expression de mRNA de pcna contre β-actine -gène dans les neurones isolés et macrophages/microglie déterminé par qPCR (N = 3). Changement de pli a été mesuré à l’aide de la méthode comparative (ΔΔCT). Erreur bar représentent moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : FACS trier des microglies 3 larves de poisson zèbre dpf. (A-C) Gating successifs voir la sélection séquentielle du cerveau toutes les cellules (A), dispersent de cellules individuelles de dispersion vers l’avant et de côté (B). Les cellules mortes (C) ont été exclus par marquage au DAPI. (D) la microglie ont été identifiés par 4 4 coloration positive. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats de l’électrophorèse micro-capillaire de l’ARN extrait des microglies de poisson-zèbre dpf 5. Les deux pics de hautes sont l’ARN ribosomique 18 s et 28. Nombre d’intégrité RNA (RIN) a été calculé automatiquement par le logiciel bioanalyzer en utilisant le rapport généré entre les 18 et 28 sous-unités ribosomiques et l’analyse du tracé électrophorétique ensemble. La microglie ARN a une 8.6 RIN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Tests de qualité et la quantité du cDNA amplifié de l’échantillon de RNA de dpf 5 poisson zèbre la microglie. L’image montre la distribution de taille de fragment de cDNA de l’échantillon analysé avec une taille moyenne de 299 BP. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Sommaire des microglies isolement et données d’extraction d’ARN de larves de poisson zèbre dpf 3, 5 et 7.

Tableau 2 : Tests de quantité d’ADNc amplifié d’échantillon de RNA de dpf 5 poisson zèbre la microglie.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.