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Article de méthode

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

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DOI :

10.3791/57474

⸱

18 juin 2018

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole illustre une procédure sûre et efficace pour modifier CD133+ des cellules souches hématopoïétiques. Présenté non-virale, magnétique polyplex approche fondée sur le peut fournir une base pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches, aussi bien en ce qui concerne le suivi du produit cellule administré par imagerie par résonance magnétique.

Résumé

Tandis que CD133+ de cellules souches hématopoïétiques (SCs) ont fait leurs preuves à fournir à fort potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, leur taux de rétention faible après une injection à l’endommagement des tissus ainsi que les taux de mortalité cellulaire massive observée conduire à très effet thérapeutique limité. Pour surmonter ces limitations, nous avons cherché à établir un protocole de base non viraux d’ingénierie cellulaire appropriée avant leur administration. La modification des CD133 humaine+ exprimant SCs à l’aide de microARN (miR) chargé polyplexes magnétique a été adressée en ce qui concerne l’efficacité d’absorption et de sécurité, mais aussi le potentiel de ciblage des cellules. S’appuyant sur notre protocole, nous pouvons atteindre les vitesses d’absorption miR haute de 80 à 90 %, tandis que le CD133+ propriétés de cellules souches ne sont pas affectées. En outre, ces cellules modifiées offrent l’option de ciblage magnétique. Nous décrivons ici une procédure sûre et très efficace pour la modification des CD133+ SCs. Nous espérons que cette approche visant à fournir une technologie standard pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches ainsi que la surveillance du produit administré cellulaire par l’intermédiaire de l’imagerie par résonance magnétique (IRM).

Introduction

CD133+ SCs représentent une population de cellules souches et progénitrices hétérogène avec promettant potentiel pour la médecine régénérative. Leur différenciation hématopoïétique et endothéliales myogène potentiels1,2,3 permet le CD133+ cellules, par exemple, de contribuer au processus de néovascularisation par différenciation dans nouvellement formant des navires et l’activation de pro-angiogénique signalisation paracrine mécanismes4,5,6,7.

Malgré leur fort potentiel démontré dans plus de 30 essais cliniques approuvés (ClinicalTrails.gov), leur résultat thérapeutique est encore en discussion controversée4. En effet, une application clinique des SCs est entravée par la faible rétention dans l’organe d’intérêt et de la cellule initiale massif mort5,8,9. Supplémentaires d’ingénierie de CD133+ SCs avant transplantation pourrait aider à surmonter ces défis.

Une condition sine qua non pour une thérapie cellulaire efficace serait la réduction de la mort massive de cellules initiales afin d’améliorer la prise de greffe de cellules pertinentes thérapeutique10. Les études en cours ont démontré une perte immense cellule de 90 à 99 % dans fortement perfusés organes comme le cerveau et le coeur pendant les premières heures de 1 – 2, indépendamment du type de cellules transplantées ou application itinéraire11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC étiquetage utilisant des nanoparticules magnétiques (MNPs) permet une stratégie novatrice et non invasif pour cibler les cellules sur le site d’intérêt22,23,24,25,26 et permet simultanément de cellule de surveillance à l’aide de MRI27 et des particules magnétiques d’imagerie (MPI). Le plus efficace in vivo études appliquant cellule aimantée ciblant la rétention de la cellule utilisée après administration locale plutôt que de l’orientation de la cellule après injection intraveineuse23,24,28 . Par conséquent, notre groupe a conçu un système de livraison consistant de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique29. Avec cette technique, CD133+ SCs et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) pourraient être efficacement ciblées, comme l’a montré in vitro tente30,31.

Un autre obstacle pour les thérapies de SC est l’environnement hostile inflammatoire des tissus touchés après la transplantation, qui contribue à la cellule initiale mort32. En plus de plusieurs études de préconditionnement, l’application des thérapeutiques pertinentes miRs était testé33; Il a été démontré avec succès qu’anti-apoptotique miRs inhibent l’apoptose in vitro et d’améliorent la prise de greffe cellulaire in vivo33. Ces petites molécules, composés de 20 à 25 nucléotides, jouent un rôle crucial en tant que modulateurs post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm) et affectent donc cellules souches sort et le comportement34. En outre, l’introduction exogène de miRs éviter l’intégration stable indésirable dans le génome de hôte34.

Les tentatives actuelles pour la mise en place efficace des acides nucléiques (NAs) dans SCs primaires reposent principalement sur des virus recombinants8,35. Malgré l’efficacité de transfection haute, manipulation virus recombinant présente un obstacle majeur pour un chevet à traduction, par exemple, l’expression des gènes incontrôlable, pathogénicité, immunogénicité et mutagenèse insertionnelle35 ,,36. Par conséquent, les vecteurs non viraux tels que les constructions à base de polymères sont essentiels d’élaborer. Parmi ceux-ci, polyéthylènimine (PEI) représente un véhicule de livraison valide offrant des avantages pour miRs tels que de la condensation de NA à protéger d’une dégradation, assimilation, et intracellulaire par endosomale échapper37,38. En outre, des complexes de miR-PEI a démontré une biocompatibilité élevée dans les essais cliniques39. Par conséquent, notre système de livraison comprend une biotinylé ramifiés 25 kDa PEI lié à une streptavidine MNP-core30,31,40.

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet décrivant (i) l’isolement manuelle des CD133+ SC de don de moelle osseuse humaine (BM) avec une caractérisation détaillée du produit SC et (ii) une stratégie de transfection efficace et doux d’une système de livraison magnétiquement non-virales base de polymères pour le génie génétique de CD133+ SCs à l’aide de miRs. CD133+ SCs sont isolées et magnétiquement enrichi de humaine ponction sternale de BM en utilisant une surface axée sur les anticorps magnétique-lancée de cellules (MACS) système de tri. Par la suite, la viabilité des cellules ainsi que la pureté de la cellule est analysée à l’aide de cytométrie en flux. Par la suite, miR/PEI/MNP complexes sont préparés et CD133+ SCs sont transfectées. 18 h après la transfection, l’efficacité de l’absorption et l’impact de la transfection sur SC marqueur expression et cellule de viabilité sont analysés. En outre, l’évaluation de la distribution intracellulaire des composés complexes transfection est effectuée illumination structurée microscopes (SIM) et de quatre couleurs d’étiquetage.

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Protocole

Sternal BM humaine pour l’isolement des cellules proviennent de donateurs informés, qui ont donné leur consentement écrit à utiliser leurs échantillons pour la recherche conformément à la déclaration d’Helsinki. Le Comité d’éthique de l’Université de Rostock a approuvé l’étude présentée (Règl. n° A 23 2010, prolongée en 2015).

1. préparation de la cellule

Remarque : Utilisez Héparine sodique (250 UI/mL BM) pour éviter la coagulation pour l’examen de la BM.

  1. CD133+ SC isolement
    1. Préparation de solutions requises
      1. Préparer en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) / acide tétraacétique (EDTA) stock solution (2 mM) en mélangeant 996 mL de PBS 1 x avec 4 mL d’EDTA (0,5 M). Vigoureusement mélanger la solution et le filtrat à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Conserver à température ambiante (RT).
      2. Préparer le tampon de MACS en mélangeant 995 mL de PBS/EDTA 2 mM avec 5 g de l’albumine sérique bovine (BSA). Vigoureusement mélanger la solution et le filtrat à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Conserver à 4 ° C.
      3. Préparer la solution mère de collagénase B (40 mg/mL) en diluant 500 mg de collagénase B (à partir de Clostridium histolyticum) à 12,5 mL de PBS. Mélanger la solution vigoureusement, faire des parties aliquotes de 350 µL et conserver à-20 ° C.
      4. Préparer la désoxyribonucléase (DNAse) je stock solution (10 mg/mL) en diluant 100 mg de DNase I (à partir de pancréas de boeuf) dans 10 mL de PBS. Mélanger la solution vigoureusement, faire des parties aliquotes de 350 µL et conserver à-20 ° C.
    2. Digestion enzymatique de BM humaine
      1. Préchauffer le moyen de lymphocytes humains a RT et décongeler les enzymes (1 partie aliquote de chaque de collagénase B et DNAse / 20 mL BM).
      2. Recueillir la BM de seringues dans un tube conique de 50 mL et mélanger doucement. Jeter les caillots existants.
        NOTE : Transférer 200 µL de BM non dilué dans un tube de 1,5 mL pour cytométrie ultérieures. Conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
      3. Dans un nouveau tube conique de 50 mL, transférer 10 mL BM, ajouter 6 mL de PBS/EDTA (2 mM), 20 mL de milieu de lymphocytes humains, 175 µL de collagénase B (40 mg/mL) et 175 µL de DNAse I (10 mg/mL). Doucement mélanger la solution et laisser incuber 30 min à ta sur un agitateur. Répétez pour l’échantillon restant de la BM.
    3. Centrifugation en gradient de densité
      1. Amorcer un tube de centrifugation en gradient de densité 50 mL en appliquant 15 mL de lymphocytes humains, séparant le milieu dans un tube de 50 mL. Centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s.
      2. Soigneusement la couche 35 mL de BM dilué sur le dessus du filtre à densité centrifugation en gradient tube et centrifuger à 445 x g pendant 35 min à température ambiante.
        Remarque : Les paramètres de centrifugeuse sont faible accélération (3) et pas de frein (1).
      3. Retirer délicatement le tube de la centrifugeuse sans agitation. Soigneusement jeter environ 20 mL de la solution claire supérieure sans toucher la couche nuageuse directement sur le dessus du filtre.
      4. Soigneusement, transférer la couche nuageuse (qui est directement sur le dessus du filtre et contient les cellules mononucléées (PTM)) dans un nouveau tube conique de 50 mL et remplir avec PBS/EDTA pour un volume final de 50 mL.
        NOTE : Combiner toutes les multinationales dans un échantillon de patients BM dans un nouveau tube.
      5. Compter les multinationales de transférer 10 µL de la suspension cellulaire de 50 mL dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 10 µL d’acide acétique 3 % avec le bleu de méthylène. Doucement, mélanger et appliquer 10 µL dans une chambre de comptage. Calculer le nombre de multinationales.
      6. Centrifuger la suspension RNM à 300 x g pendant 10 min. éliminer le surnageant.
        ATTENTION : Lors de la centrifugation, refroidir la centrifugeuse du RT à 4 ° C.
    4. Sélection magnétique de CD133+ SCs utilisant des humains CD133 anticorps-lié superparamagnetic iron dextran particules
      Remarque : Au cours de cette étape, travailler sur la glace. Solutions de magasin jusqu'à l’utilisation à 4 ° C. Stocker des MACS à un aimant permanent, colonnes de séparation et avant la séparation filtre à 4 ° C.
      1. Choisissez la taille de la colonne. Pour < 1.2 x 108 MNCs, colonnes d’utilisation de MS et pour les > 1,2 x 108 MNCs, utiliser des colonnes de LS (voir Table des matières).
      2. Pour préparer de sélection magnétique pour le nombre total de cellules de 1 x 108 , soigneusement resuspendre multinationales dans 300 µL de tampon de MACS (4 ° C). Ajouter 100 µL de réactif blocage de FcR (4 ° C) et 100 µL CD133 anticorps-lié superparamagnetic iron dextran particules (4 ° C).
      3. Doucement, mélanger la suspension cellulaire et incuber 30 min à 4 ° C. Secouez légèrement la suspension cellulaire pendant l’incubation (2 à 3 x).
      4. Ajouter 2 mL de tampon de MACS (4 ° C) 1 x 108 totales Qu'emns. Mélanger doucement la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
      5. Mettre en place le porte-aimant de MACS et fixer l’aimant permanent de MACS. Installer la colonne MACS et appliquer le filtre avant la séparation sur le dessus.
      6. Equilibrer la première colonne de MACS MS/LS et le filtre avant la séparation avec 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C).
        Remarque : Ne laissez jamais les colonnes MACS se dessécher après équilibration.
      7. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu en 500 µL de tampon de MACS (4 ° C) par quantité de 1 x 108 total de cellules. Appliquer la suspension cellulaire dans le filtre avant la séparation.
      8. Laver le filtre de colonne et de pré-séparation Mac trois fois, avec, pour chaque lavage, 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de Mac de secours (4 ° C).
        Remarque : Au cours de la troisième étape de lavage, installer une seconde colonne de MACS dans les aimants permanents de MACS et équilibrer la deuxième colonne de MACS MS/LS avec 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C).
      9. Jetez le filtre avant la séparation.
      10. Éluer la fraction cellulaire directement sur la deuxième colonne de MACS : ajouter 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C) sur la première colonne de MACS et supprimer la colonne de MACS de l’aimant permanent de MACS. Immédiatement transférer la première colonne de MACS au-dessus de la deuxième colonne de MACS et pousser la suspension cellulaire par le biais de la colonne Mac utilisant le piston fourni.
      11. Laver la colonne Mac trois fois, en utilisant pour chaque lavage 0,5 mL (MS) ou Mac 3 mL (LS) de secours (4 ° C).
      12. Éluer la fraction de la cellule de la colonne en ajoutant 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) de tampon de MACS (4 ° C) sur la deuxième colonne de MACS et supprimant la colonne Mac depuis le Mac à un aimant permanent. Immédiatement transférer la deuxième colonne de MACS au-dessus d’un tube de 1,5 mL (MS) ou un tube conique de 15 mL (LS) et pousser la suspension cellulaire par le biais de la colonne Mac utilisant le piston fourni.
      13. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Soigneusement, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de tampon de MACS (4 ° C).
      14. Compter les CD133+ cellules : transfert 6 µL de la suspension de cellules dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 6 µL de solution de bleu de trypan (0,4 %). Doucement, mélanger et appliquer 10 µL dans une chambre de comptage. Calculer le nombre de CD133+ cellules.
      15. Stocker le CD133+ des cellules sur la glace jusqu’au semis.
  2. Caractérisation des CD133 fraîchement isolées+ SCs
    NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement). Garder les tubes, les tampons et les anticorps sur glace sauf indication contraire.
    1. Préparation des SCs pour cytométrie
      1. Utilisez les deux échantillons (chaque 10 µL) d’aliquotes de BM et un échantillon de CD133 fraîchement isolées+ SCs (minimum, 1 x 104 cellules) pour analyse. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 10 µL de RCF réactif de blocage et remplir avec du tampon de MACS (4 ° C) pour un volume de 33 µL.
      2. Ajouter les anticorps suivants sur la face interne des tubes (voir tableau 1) : anti-CD34-fluorescéine isothiocyanate (FITC) (clone : AC136), anti-CD133/2-phycoérythrine (PE) (clone : 3 293), isotype IgG de souris 2 b-PE, de contrôle Anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (clone : 2D 1) et 7-aminoactinomycine (AAD). Après que tous les anticorps ont été ajoutés, secouer du côté de l’anticorps du tube. Doucement, mélanger la solution (volume final 50 µL) et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
      3. Ajouter 1 mL de tampon de lyse 1 x globule rouge (RBC), mélanger la suspension doucement et incuber sur glace 10 min. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
      4. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de PBS (4 ° C). Conserver sur la glace jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.
    2. Analyse d’écoulement par cytométrie en flux de CD133+ SCs
      1. D’examiner la viabilité cellulaire et la pureté des CD133+ SC, utiliser un adapté International société de Hematotherapy et le greffon Engineering (ISHAGE) écoulement cytometry gating stratégie41 (voir le déscriptif représentatif dans la Figure 1). Utilisez la commande suivante :
        Étape 1 : sélection de la population de cellules (Figure 1 a)
        Étape 2 : sélection du CD45+ cellules (Figure 1 b)
        Étape 3 : sélection du CD45 viable+ cellules (Figure 1)
        Étape 4 : sélection de CD45 viable+/CD34+ cellules (Figure 1)
        Étape 5 : sélection de CD45 viable+/CD34+/CD133+ cellules (Figure 1E)
        Exécutez le cytomètre en flux (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant.
      2. Calculer la viabilité cellulaire et la pureté à l’aide des équations suivantes :

figure-protocol-1   Équation 1

figure-protocol-2   Équation 2

  1. La culture de CD133 fraîchement isolées de cellules+ SCs
    1. Aliquote 100 x cytokine humaine recombinante supplément dans 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C. Dégel un aliquote de 100 x avant la préparation moyenne.
    2. Préparer le CD133+ SC milieu de culture, les cellules hématopoïétiques sans sérum expansion additionné avec supplément de cytokine humaine recombinante (final 1 x) et 1 % la pénicilline/streptomycine.
    3. Graines de 5 x 104 fraîchement isolées CD133+ SCs pour la transfection dans une plaque 24 puits avec 500 µL de milieu de culture. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 et 20 % O2.
      NOTE : Semences 5 x 104 fraîchement isolées CD133+ SCs comme un contrôle pour analyse en cytométrie en flux.

2. préparation des Complexes de Transfection

NOTE : Au cours de cette étape, gardez la ribonucléase d’espace de travail entier (RNAse)-libérer à l’aide de la solution de décontamination de RNAse et utilisons uniquement des matières consommables RNAse-libre.

  1. Préparation de miR
    NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
    Remarque : pour le miR-spécimen : utilisation Cyanine 3 colorant étiquetés miR précurseur et miR précurseur sans étiquette.
    1. Pour préparer la solution mère de miR (50 µM), diluer la quantité désirée de miR dans le volume approprié d’eau exempte de nucléase (par exemple, diluée 5 nmol de miR dans 100 µL d’eau). Mélanger la solution, aliquote le stock de miR (5 µL) doucement et stocker au-dessous de-20 ° C.
  2. Préparation de l’Î.-P.-É.
    1. Préparer le PEI suite de protocoles standard et remarque la PEI concentration stock31,,42 .
  3. Préparation du MNP
    1. Préparer les MNPs suite de protocoles standard et notez la MNP concentration stock31,42.
  4. Préparation de miR/PEI complexes
    1. Préparer une solution de glucose 5 % en diluant D-(+)-glucose dans de l’eau exempte de nucléase. Doucement mélanger la solution, aliquote du stock (1,5 mL) et conserver à 4 ° C.
      NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
    2. Utilisez 20 miR pmol / puits d’une plaque 24 puits30. Diluer à miR dans la solution de glucose 5 % pour une concentration finale de 0,25 pmol miR/µL.
    3. Calculer le montant de PEI requis basé sur le montant de miR (20 pmol, étape 2.3.1) et l’azote optimal (de l’Î.-P.-É.) en phosphate (de miR) ratio (N/P) basée sur la concentration de stock de PEI (étape 2.2.1 ; ici, un ratio de 7,5 a été utilisé)30. Diluer le PEI dans une quantité égale de solution de glucose 5 %, selon l’équation :
      figure-protocol-3
      qui se réarrange en
      figure-protocol-4    Équation 3
      où le volume de PEI est en µL et [PEI] est en mM et N/P (optimisé pour ce protocole) est de 0,75. 0,12 est un facteur de conversion spécifique à la station miR.
    4. Ajouter le PEI préalablement dilué dans le miR préalablement dilué et vortexer pendant 30 s.
    5. Incuber le miR/PEI complexe pendant 30 min à température ambiante.
  5. Préparation des complexes miR/PEI/MNP
    NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
    1. Tout en incubant les complexes de miR/PEI, préparer les MNPs par sonification les MNPs pendant 20 min à 35 kHz dans le bain d’eau sonicating à RT pour s’assurer que les particules sont en suspension et ne pas agréger.
    2. Calculer le nombre de députés nationaux requis (fer de 3 µg/mL) basé sur la solution stock de MNP (point 2.3.1).
    3. Ajouter les MNPs aux ultrasons dans les complexes de miR/PEI et le vortex pour 30 s. Incuber les complexes de miR/PEI/MNP pendant 30 min à température ambiante.
  6. Préparation des complexes de transfection pour les quatre couleurs de marquage à l’aide de la carte SIM
    Remarque : Utilisez miR précurseur sans étiquette.
    1. Étiqueter le miR avec l’aide de colorant Cyanine 5 un étiquetage de miR colorant Cyanine 5 kit (voir Table des matières) suivant les instructions du fabricant. Mesurer la concentration finale de miR à l’aide du spectrophotomètre cotée (voir Table des matières) en accord avec le pré-réglage fourni par le fabricant (acides nucléiques, RNA-40). Aliquoter que le miR (5 µL) et les conserver à-80 ° C abri de la lumière.
    2. Étiqueter le PEI avec un colorant de fluorescence vert vif à l’aide un étiquetage approprié protéine nécessaire (voir Table des matières) suivant les instructions du fabricant. Définir la concentration finale de PEI utilisant l’analyse de la ninhydrine (étape 2.2.1). Aliquote du PEI (dans le volume calculé sur la base de l’équation 3) et conserver à 4 ° C, abri de la lumière.
    3. Étiqueter les MNPs avec colorants rhodamine, conjugué à la biotine en utilisant un ratio de 1 : 1 000 w/w, teindre à MNP. Mélanger les colorants rhodamine et MNPs en même temps que la préparation de la formation du complexe miR/PEI et incuber la solution pendant 30 min à l’obscurité. Utilisation marquée directement MNPs.

3. la transfection de CD133+ SCs

NOTE : Au cours de cette étape, gardez la ribonucléase d’espace de travail entier (RNAse)-libérer à l’aide de la solution de décontamination de RNAse et utilisons uniquement des matières consommables RNAse-libre
NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).

  1. Le complexe de miRNA/PEI/MNP préparé, ajouter quelques gouttes directement dans le puits correspondant contenant le CD133 fraîchement isolées+ SCs dans le milieu de culture.
  2. Mélanger doucement en balançant la plaque avant et en arrière. Incuber les cellules pendant 18 h à 37 ° C, 5 % de CO2 et 20 % O2.

4. analyse de la Transfection de miR

  1. Examen de l’efficacité de l’absorption de miR et la cytotoxicité des complexes de transfection
    Remarque : pour le miR-spécimen : utiliser le colorant Cyanine 3 étiqueté miR précurseur pour l’évaluation de l’absorption et la non transfectées CD133+ SCs pour les portes de contrôle de cytométrie en flux.
    NOTE : Les travaux suivants doivent être effectué dans une pièce à l’abri de la lumière lumineuse (éclairage dim uniquement).
    Remarque : Conservez les tubes, les tampons et anticorps sur la glace, sauf indication contraire.
    1. Préparer la solution mère de paraformaldéhyde (PFA, 4 %) par dilution 4 g PFA dans 100 mL de PBS et chauffer la solution à 80 ° C. Vigoureusement, mélanger la solution et ajuster le pH de 7,3. Aliquote de la PFA (1,5 mL) en stock et conserver à-20 ° C.
    2. 18 h après la transfection, recueillir chaque puits dans un séparé 1,5 mL tube. Laver chaque bien une fois avec 500 µL de PBS et transférer cette suspension cellulaire dans le même tube.
    3. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de tampon de MACS de 4 ° C.
    4. Ajouter 0,5 µL d’un colorant réactif amine pour distinguer les cellules vivantes et mortes, délicatement mélanger la suspension et incuber pendant 10 min à 4 ° C. Ajouter 1 mL de PBS (4 ° C) et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    5. Jeter le surnageant, resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de PBS, ajouter 33 µL PFA (4 %) et conserver sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.
    6. Organiser la stratégie de blocage selon la représentation représentative dans la Figure 2. Exécuter les exemples sur le cytomètre en flux (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant.
  2. Caractérisation de la CD133 transfectées miR+ SCs
    Remarque : Utiliser miR précurseur non étiquetés comme non transfectées CD133+ SCs pour portes de contrôle de cytométrie en flux.
    1. Recueillent chacun bien dans un tube séparé de 1,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    2. Utilisez la stratégie de blocage comme indiqué au point 1.2.
  3. Examen de la distribution intracellulaire des complexes de transfection par SIM
    1. Préparer les complexes et transfecter les cellules tel que décrit dans les sections 2 et 3 de l’article.
    2. 18 h après la transfection, recueillir chaque puits dans un séparé 1,5 mL tube. Laver chaque bien une fois avec 500 µL de PBS et transférer le lavage dans tube respectifs du puits. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 1 mL de sérum bovin fœtal (SVF) de 2 % dans du PBS, délicatement mélanger la suspension et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    4. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu dans 100 µL de PBS Ajouter 33 µL PFA (4 %) pendant 20 min.
    5. Transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de 24-culture contenant des lamelles de verre stériles et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    6. Jeter le surnageant et ajouter 500 µL de PBS. Agiter la plaque doucement et jeter les PBS.
    7. Placer les lamelles disposée sur les lames microscopiques à l’aide de milieu de montage aqueux pour préserver la fluorescence et séchez-les à ta pendant au moins 1 h.
    8. Acquisition d’images à l’aide d’un objectif 100 X à immersion d’huile. Paramètres de la carte SIM : 405, 488, 561 et lignes de laser 633 nm pour l’excitation et z-piles avec une profondeur de 16 bits à 3 angles, 3 phases, avec une moyenne de 4, grilles par faisceau laser : 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.

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Résultats

Le protocole présenté décrit un isolement manuel et magnétique enrichissement humain CD133 dérivé de BM+ SCs avec une cellule indépendante virus ultérieures ingénierie de stratégie, comme une technologie non invasive pour la manipulation de cellules in vitro et en vivo outil de surveillance.

Cette technologie triple isolation permet une séparation des multinationales de la BM sternal prédigéré par ce...

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Discussion

Ces dernières années, CD133+ SCs sont apparus comme une population de cellules prometteuses pour thérapies à base de SC, comme en témoignent plusieurs phases I, II et III des essais cliniques43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 ,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le ministère fédéral de l’éducation et recherche Allemagne (FKZ 0312138A et FKZ 316159), l’État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les fonds structurels européens (FSE/IVWM-B34-0030/10 et du FSE/IVBM-B35-0010/12) et le DFG (DA1296/2-1), le Fondation de cardiologie allemand (F/01/12), le BMBF (VIP + 00240) et la Fondation humide. En outre, F.H. et h sont pris en charge par le FORUN programme de Rostock University Medical Centre (889001).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
7-AADBD Biosciences559925
Acide acétique avec bleu de méthylèneStemcell Technologies70603
 %anti-CD133/2-PE (clone : 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (clone : AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone : 2D1)BD Biosciences
colorant à la rhodamine ; Colorant Atto 565 conjugué à la biotineATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII Cytomètre en fluxBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 particules de fer dextran superparamagnétiques liées aux anticorps ; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
collagénase BRoche Diagnostics GmbH11088831001
chambre de comptagePaul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 colorant précurseur marqué miR ; Cy3 Colorant pré-miR Contrôle négatif #1AmbionAM17120
Cyanine 5 colorant miR ; Colorant Cy5 Label IT Kit de marquage miARNMirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 microscope confocalCarl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, humainMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
kit de marquage de protéines vert vif ; Oregon Green 488 Kit d’étiquetage des protéinesThermo Fisher ScientificO10241
milieu de montage aqueux ; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
Tube de centrifugation à gradient de densité ; Leukosep Tube à centrifugerGreiner Bio-One89048-932
Porte-aimant MACS ; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
Filtre de pré-séparation MACSMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µ ; m
Colonne de séparation MACS (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
Aimant permanent MACS ; Séparateur MACSMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Filtre PVDF Millex-HVMerckSLHV013SL0.45 &mu ; m
souris IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
colorant réactif à l’amine ; Near-IR LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes fixableThermo Fisher ScientificL10119
milieu de séparation des lymphocytes humains ; PancollPan Biotech GmbHP04-60500Densité : 1,077 g/mL
PBSPan Biotech GmbHP04-53500sans Ca et Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727 ramifié; 25 kDa
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 &mu ; g/mL
de PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
précurseur non marqué miR ; Précurseur de miARN précurseur précurseur précurseur #1AmbionAM17110
Tampon de lyse des globules rougeseBioscience00-4333-57
Solution de décontamination de l’ARNase ; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
milieu lymphocytaire humain ; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyenPan Biotech GmbHP04-16500
supplément de cytokines humaines recombinantes ; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
milieu d’expansion cellulaire hématopoïétique sans sérum ; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptavidin MagneSphere Particules paramagnétiquesPromega CorporationZ5481
Trypan Blue solutionSigma-Aldrich GmbHT81540,4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200,5 M ; pH 8,0
ZEN2011 logicielCarl Zeiss Jena GmbH
Spectrophotomètre NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH bain-marie soniqueBandelin electronicPuissance nominale ultrasonique : 80 W ; Fréquence ultrasonique : 35 kHz
560178

Références

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