Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

Résumé

Ici, nous utilisons bidimensionnelle semi dénaturation gel d’agarose pour confirmer la présence de fibres amyloïdes semblables de taille hétérogène et exclure la possibilité que l’hétérogénéité de taille est due à la dissociation des fibres amyloïdes durant le gel processus en cours d’exécution.

Résumé

Des fibres amyloïdes ou type amyloïde ont été associés à plusieurs maladies humaines et sont maintenant découverts importante pour nombreuses voies de signalisation. La capacité de facilement détecter la formation de ces fibres dans différentes conditions expérimentales est essentielle pour comprendre leur fonction potentielle. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter les fibres, mais pas sans quelques inconvénients. Par exemple, la microscopie électronique (me), ou coloration au rouge Congo ou thioflavine T souvent nécessite purification des fibres. En revanche, semi-dénaturation détergent gel d’agarose (SDD-AGE) permet de détecter des fibres amyloïdes semblables SDS-résistants dans les extraits de cellules sans purification. En outre, il permet la comparaison de la différence de taille des fibres. Plus important encore, il peut être utilisé pour identifier des protéines spécifiques dans les fibres par Western Blot. C’est moins fastidieux et plus facilement accessibles à un plus grand nombre de laboratoires. Résultats de la SDD-âge présentent souvent un degré variable d’hétérogénéité. Cela soulève la question de savoir si la partie de l’hétérogénéité résulte de la dissociation de la protéine complexe lors de l’électrophorèse en présence de SDS. Pour cette raison, nous avons utilisé une deuxième dimension du SDD-âge pour déterminer si l’hétérogénéité de taille vue dans SDD-âge est vraiment un résultat de fibre hétérogénéité en vivo et non le résultat de dégradation ou de dissociation de certains des protéines au cours de électrophorèse. Cette méthode permet la confirmation rapide et qualitative que les fibres amyloïdes ou type amyloïde ne sont pas partiellement dissociant au cours du processus de la SDD-âge.

Introduction

La formation de fibres amyloïdes due à un mauvais repliement des protéines a longtemps à jouer un rôle dans des conditions pathologiques comme la maladie d’Alzheimer, de Parkinson et la maladie de Huntington¹. Plus récemment, la formation des fibres amyloïdes ou type amyloïde s’est avérée être une partie des voies de signalisation chez les humains, y compris lors des anti-viraux réponse immunitaire innée² et necroptosis^3,4et chez les organismes inférieurs comme la levure^5,6. Par conséquent, la capacité à détecter ces fibres dans le laboratoire est importante. Actuellement, il existe trois manières de détecter amyloïde et les fibres de type amyloïde : l’utilisation de colorants, EM et SDD-âge.

L’utilisation de colorants, comme le rouge Congo ou thioflavine T, offre l’avantage d’être rapide et facilement détectables à l’aide de la microscopie ou spectroscopie⁷. Toutefois, la détection au microscope, dans le cas du rouge Congo, ne fournit aucune spécificité dont les protéines forment les fibres ou la taille des fibres. De même, l’utilisation de la spectroscopie pour détecter le rouge Congo ou thioflavine T contraignant pour des complexes de protéine fournit seulement un résultat positif ou négatif.

EM fournit une preuve concluante de la présence de fibres ainsi que des informations quantitatives sur la longueur et le diamètre de fibre⁸. Toutefois, cette méthode nécessite une purification très stricte. En outre, l’EM est une technique spécialisée qui utilise des équipements coûteux.

DDD-AGE a été utilisé pour déceler les SDS résistant mega Dalton protéines complexes incluant des fibres amyloïdes ou type amyloïde. Il offre de nombreux avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas la purification des fibres et est facile à réaliser⁹. Deuxièmement, il fournit des informations qualitatives sur la taille des fibres, y compris la taille relative et la quantité de heterogenicity de la fibre. Enfin, parce que le Western blot peut être réalisée après électrophorèse, il est facile de détecter la présence d’une protéine pour laquelle il y a un anticorps, bien qu’il est à noter que DDD-âge étant semi dénaturation, certains épitopes peuvent rester cachés qui complique la détection de l’anticorps.

Récemment, interaction protéine kinase du récepteur de 1 (RIPK1) et 3 (RIPK3) ont été signalés à fibres amyloïdes forme pour servir de plates-formes de signalisation au cours de la necroptosis, une forme programmée de nécrose³. Alors qu’ils étudiaient ces fibres, notre laboratoire a montré qu’une autre protéine associée à la necroptosis, mélangé de kinase de lignée domaine ressemblant (MLKL), a également formé des fibres de type amyloïde⁴. Toutefois, suite à l’examen avec SDD-âge, la taille des fibres MLKL semblait distingue les fibres RIPK1 et RIPK3, qui est apparu identiques les uns aux autres (Figure 1). C’était inattendu, parce qu’il est bien connu que les MLKL se lie à RIPK1/RIPK3 pour former la necroptosis signalisation complexe appelé le necrosome¹⁰.

Il y a au moins deux explications. Tout d’abord, deux fibres de type amyloïde totalement distincts peuvent se former lors de necroptosis, un contenant RIPK1/RIPK3 et autre MLKL le contenant. En second lieu, qu’un seul type de fibres de type amyloïde que contenant RIPK1/RIPK3/MLKL peut se former pendant la necroptosis, mais l’association des MLKL avec les autres protéines est suffisamment faible pour qu’il se dissocie au cours de la SDD-âge.

Pour y remédier, nous vous proposons effectuant un bidimensionnel (2D) DDD-âge. DDD-âge-stable amyloïde ou des fibres de type amyloïde aura le même schéma de migration lors de l’électrophorèse de la première et la deuxième dimension. Ce sera détectable après transfert des protéines à une membrane et de réaliser un Western blot. Fibres stables exposera un motif diagonale forte. Tout écart par rapport à cela suggère que les fibres subissent des changements en raison de l’électrophorèse SDS.

Protocole

1. préparer les échantillons

1. Amyloïde de⁶ culture 2 x 10 produisant des cellules de cancer du côlon HT-29 dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans 10 mL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) contenant 10 % sérum de veau fœtal et la pénicilline-streptomycine. Cellules en culture pour la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO₂.
   1. Après que les cellules se développent à la confluence de 80 %, laver les cellules avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 3 mL de solution de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
   2. Après que les cellules sont totalement dissociés du plat, ajouter 10 mL de milieu de culture et transférer les cellules avec une pipette de 10 mL dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le milieu, remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu de culture et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Plaque de 2 x 10⁶ cellules dans chacune des deux plats de 10 cm.
   3. Permettre aux cellules d’adhérer et de récupérer toute la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO₂. Appliquer le traitement à une seule soucoupe pour induire la formation d’amyloïdes avec 20 ng/mL de facteur de nécrose tumorale-Alpha (TNF-α), 100 inhibiteur nM Smac-mimétiques et 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK¹¹. La combinaison est abrégée comme zone de sécurité temporaire. Traiter l’autre plat avec le véhicule comme un contrôle.
2. Après la durée appropriée, habituellement de 6 h, récolter le lysat cellulaire.
   1. Gratter les cellules de la plaque avec une spatule en plastique et une pipette de 10 mL permet de transférer dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.
   2. Laver les cellules 2 fois par resuspendant dans 10 mL de PBS froid glace et centrifugation à 1 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. Aspirer la solution de PBS.
      Remarque : Le processus peut être interrompu ici par le culot de congélation dans l’azote liquide et le stockage à ˗80 ° C pendant environ 1 mois.
   3. Transférer le culot cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL et incuber dans 0,3 mL de tampon de lyse pendant 30 minutes sur la glace. Centrifuger à 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant est le lysat de cellules entières.
      Remarque : Le processus peut être interrompu ici en stockant l’échantillon à-20 ° C pendant plusieurs mois.
   4. Mesurer la concentration en protéine par une analyse de Bradford, selon le protocole du fabricant. Ajouter 4 x tampon de charge SDD-âge pour préparer 20 µL de 3 µg/µL d’échantillon et incuber à température ambiante pendant 10 min.

2. préparer et exécuter les Gels

1. Ajouter 2 g d’agarose dans 200 mL de tampon Tris-acétate de 1 x (TAE) dans un bécher en verre et chauffer au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Ajouter 1 mL de la SDD de 20 % pour une concentration finale de 0,1 % SDS. Bien agiter pour mélanger. Prendre soin de ne pas pour générer des bulles après l’ajout de SDS.
2. Verser la solution de gel d’agarose dans une plaque de gel de 15 cm x 14 cm. Utiliser une pipette 1 mL d’éliminer toutes les bulles. Placer un peigne de 20 puits au sommet.
3. Première dimension : Pipette 60 µg de germes entiers lysat dans la voie de l’extrême-droite. Exécutez le gel à 60 V pendant 4 h environ (jusqu'à ce que le front de colorant est environ ¾ à travers le gel) en utilisant de la TAE contenant du SDS 0,1 % comme le tampon en cours d’exécution.
4. Deuxième dimension : tourner soigneusement le gel de 90° dans le sens antihoraire (Figure 2A). Exécutez le gel à 60 V pendant environ 4 h.
   Remarque : L’état général de fonctionnement est de 4 V/cm de longueur de gel. Il est important que les conditions de marche ne sont exactement les mêmes pour les dimensions de la premières et la deuxième.

3. transfert

1. La méthode de transfert capillaire permet de transférer les protéines à une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane (Figure 2B).
   1. Ajouter 500 mL de tampon de transfert à un conteneur de 20 x 20 cm environ. Faire une pile haute de 5 cm de serviettes en papier à côté du conteneur. La superficie de la partie supérieure de la pile doit être supérieure aux dimensions de gel.
   2. Tremper un papier-filtre 14 x 15 cm dans le tampon de transfert et les placer sur le dessus de la pile de serviettes de papier. Prenez soin de placer sur le papier sans rides ni bulles. Répéter l’opération avec un autre morceau de papier filtre.
   3. Activer une membrane PVDF 14 x 15 cm dans le méthanol pendant 30 s puis il couche sur le papier filtre en prenant soin d’utiliser un rouleau pour enlever toutes les bulles. Rincer le gel avec tampon de transfert et il couche sur le dessus de la membrane, à nouveau dérouler toutes les bulles.
   4. Couvrir le bord des plus proche sur le conteneur de tampon de transfert d’une pellicule plastique serviettes en papier. Il est important que le pont de papier construit à l’étape suivante n’entre pas en contact direct avec la pile de serviettes de papier.
   5. Tremper un morceau de papier filtre 15 x 35 cm dans le tampon de transfert et placez-le donc une extrémité couvre le haut du gel et l’autre extrémité est dans le conteneur de tampon de transfert. Répéter l’opération avec un autre pont.
   6. Couvrir le récipient d’une pellicule plastique et laisser une nuit à température ambiante.

4. Western Blotting détection

1. Rincer la membrane avec 50 mL de PBS contenant 0,05 % de Tween-20 (PBST) dans un récipient de 20 × 20 cm. Ajouter 20 mL de lait 5 % dans du PBST. Roche à température ambiante pendant 30 min à bloquer.
2. Déposer 10µl d’anticorps de lapin anti-MLKL dans 20 mL de lait 5 % dans du PBST et ajouter au conteneur. Incuber le rocker durant la nuit à 4 ° C.
3. Laver la membrane dans 20 mL de PBST pendant 5 min. Répétez 5 fois.
4. Déposer 4 µL d’anti-rabbit-HRP à 20 mL de lait 5 % dans du PBST et ajouter au conteneur. Incuber le rocker à température ambiante pendant 2 h.
5. Laver la membrane dans 20 mL de PBST pendant 5 min. Répétez 5 fois.
6. Ajoutez le substrat chimiluminescence améliorée (ECL) et exposer aux films radiographiques selon le protocole du fabricant.

Résultats

Après l’induction de la necroptosis, RIPK1 et RIPK3 ont montré des patrons de type amyloïde presque identiques (pistes 2 et 4, Figure 1). Cependant, les fibres MLKL sont plus hétérogènes et semblaient être plus petites que les fibres de RIPK1/RIPK3 (voie 6, Figure 1). Qui nous a amenés à développer la méthode 2D de SDD-âge pour aborder la possibilité MLKL forme des fibres RIPK1/RIPK3-indépendant ou MLKL se dissocie simplement des...

Discussion

L’aspect le plus important de la SDD 2D-âge, c’est que les conditions de l’électrophorèse sont les mêmes pour la première et la deuxième dimension. La capacité à détecter une forte diagonale à 45° (ce qui indique qu’aucune dissociation ou la dégradation ne s’est produite) dépend des fibres de migration de manière identique pendant les deux electrophoreses. À l’aide de conditions différentes, par exemple changer la tension ou la longueur du moment de l’exécution, masquera ces résultats. En outre, comme c’est le cas pour t...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Unité d’électrophorèse	sur gel Fisher	HE99XPRO	appratus pour la course sur gel.
agrose	VWR	97062-250	Pour gel d’agarose.
tour en papier	Fisher	19-120-2484	pour le transfert du
papier filtre	VWR	21427-386	pour le transfert
la membrane PVDF	Bio-Rad	162-0177	pour le transfert du
lait en poudre bloquant	Bio-Rad	1706404XTU	pour le blocage en Western blot
Anticorps MLKL Genetex		GTX107538	anticorps anti-MLKL pour lapin
Anticorps RIPK1	BD Biosciences	610459	anticorps anti-RIPK1 de souris
Anticorps RIPK3	cadeau du Dr Xiaodong Wang		lapin anti-RIPK3. Voir la référence 11.
anticorps secondaire anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154
ECL		Substrat HRP chimiluminescent Fisher	WBKLS0500
Western film radiographique	Fisher	F-BX810	pour Western blot résultat
DMEM	Sigma	D6429	pour la culture cellulaire
sérum fœtal bovin	Sigma	F4135	pour la culture cellulaire
péniciline-streptomycine	Sigma	P4333	pour la culture cellulaire
Solution de trypsine	Sigma	T4049	pour la culture cellulaire
PBS pour la culture tissulaire	Sigma	D8662	pour la culture cellulaire
TNF recombinant	fabriqué dans notre laboratoire		pour induire la nécroptose. Voir référence 11.
Don smac-mimétique	du Dr Xiaodong Wang		pour avoir induit la nécroptose. Voir référence 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	pour induire la nécroptose. Voir référence 11.
Compteur de cellules	Bio-Rad	1450102	modèle TC20 ; pour le comptage des cellules
Pierce&trade ; Kit de dosage des protéines BCA	Thermo Scientific	23225	pour mesurer la concentration en protéines dans les lysats cellulaires
Élévateur de cellules	Fisher	07-200-364	pour retirer les cellules de la boîte
Tampon de lyse (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL glycérol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibiteurs de protéase et de phosphates au choix)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris base 11,42 mL d’acide acétique glacial 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 à 1 L
4X tampon de charge SDD-AGE (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL de glycérol 4 mL 20 % SDS 0,5 mL 10 % de bleu de bromophénol 31 mL ddH2O
Tampon de transfert TBS (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
Tampon de lavage PBST (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· ; 2H2O 24 g KH2PO4 ajouter ddH2O à 10 L