Name: Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel d'agarose semi-dénaturant pour confirmer l'hétérogénéité de taille des fibres amyloïdes. Cette méthode simple permet d'étudier l'agrégation protéique sans équipement spécialisé.

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Ce travail est soutenu par une bourse de recherche pour S.H..-a. du NIH/NCATS (TL1TR001104), une fondation de Welch accorder (I-1827) et une bourse de R01 de NIGM (RGM120502A) au Z.W. Z.W. est le savant de Linthicum Virginie Murchison en recherche médicale et de prévention du Cancer Research Institute of Texas Scholar (R1222).

1. préparer les échantillons
<ol><li>Amyloïde de6 culture 2 x 10 produisant des cellules de cancer du côlon HT-29 dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans 10 mL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) contenant 10 % sérum de veau fœtal et la pénicilline-streptomycine. Cellules en culture pour la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.<ol>
<li>Après que les cellules se développent à la confluence de 80 %, laver les cellules avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 3 mL de solution de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 3 min.</li>
		<li>Après que les cellules sont totalement dissociés du plat, ajouter 10 mL de milieu de culture et transférer les cellules avec une pipette de 10 mL dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le milieu, remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu de culture et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Plaque de 2 x 106 cellules dans chacune des deux plats de 10 cm.</li>
		<li>Permettre aux cellules d’adhérer et de récupérer toute la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2. Appliquer le traitement à une seule soucoupe pour induire la formation d’amyloïdes avec 20 ng/mL de facteur de nécrose tumorale-Alpha (TNF-α), 100 inhibiteur nM Smac-mimétiques et 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK11. La combinaison est abrégée comme zone de sécurité temporaire. Traiter l’autre plat avec le véhicule comme un contrôle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après la durée appropriée, habituellement de 6 h, récolter le lysat cellulaire.<ol>
<li>Gratter les cellules de la plaque avec une spatule en plastique et une pipette de 10 mL permet de transférer dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.</li>
		<li>Laver les cellules 2 fois par resuspendant dans 10 mL de PBS froid glace et centrifugation à 1 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. Aspirer la solution de PBS. Remarque : Le processus peut être interrompu ici par le culot de congélation dans l’azote liquide et le stockage à ˗80 ° C pendant environ 1 mois.</li>
		<li>Transférer le culot cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL et incuber dans 0,3 mL de tampon de lyse pendant 30 minutes sur la glace. Centrifuger à 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant est le lysat de cellules entières. Remarque : Le processus peut être interrompu ici en stockant l’échantillon à-20 ° C pendant plusieurs mois.</li>
		<li>Mesurer la concentration en protéine par une analyse de Bradford, selon le protocole du fabricant. Ajouter 4 x tampon de charge SDD-âge pour préparer 20 µL de 3 µg/µL d’échantillon et incuber à température ambiante pendant 10 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparer et exécuter les Gels
<ol><li>Ajouter 2 g d’agarose dans 200 mL de tampon Tris-acétate de 1 x (TAE) dans un bécher en verre et chauffer au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Ajouter 1 mL de la SDD de 20 % pour une concentration finale de 0,1 % SDS. Bien agiter pour mélanger. Prendre soin de ne pas pour générer des bulles après l’ajout de SDS.</li>
	<li>Verser la solution de gel d’agarose dans une plaque de gel de 15 cm x 14 cm. Utiliser une pipette 1 mL d’éliminer toutes les bulles. Placer un peigne de 20 puits au sommet.</li>
	<li>Première dimension : Pipette 60 µg de germes entiers lysat dans la voie de l’extrême-droite. Exécutez le gel à 60 V pendant 4 h environ (jusqu'à ce que le front de colorant est environ ¾ à travers le gel) en utilisant de la TAE contenant du SDS 0,1 % comme le tampon en cours d’exécution.</li>
	<li>Deuxième dimension : tourner soigneusement le gel de 90° dans le sens antihoraire (Figure 2A). Exécutez le gel à 60 V pendant environ 4 h. Remarque : L’état général de fonctionnement est de 4 V/cm de longueur de gel. Il est important que les conditions de marche ne sont exactement les mêmes pour les dimensions de la premières et la deuxième.</li>
</ol>3. transfert
<ol><li>La méthode de transfert capillaire permet de transférer les protéines à une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane (Figure 2B).<ol>
<li>Ajouter 500 mL de tampon de transfert à un conteneur de 20 x 20 cm environ. Faire une pile haute de 5 cm de serviettes en papier à côté du conteneur. La superficie de la partie supérieure de la pile doit être supérieure aux dimensions de gel.</li>
		<li>Tremper un papier-filtre 14 x 15 cm dans le tampon de transfert et les placer sur le dessus de la pile de serviettes de papier. Prenez soin de placer sur le papier sans rides ni bulles. Répéter l’opération avec un autre morceau de papier filtre.</li>
		<li>Activer une membrane PVDF 14 x 15 cm dans le méthanol pendant 30 s puis il couche sur le papier filtre en prenant soin d’utiliser un rouleau pour enlever toutes les bulles. Rincer le gel avec tampon de transfert et il couche sur le dessus de la membrane, à nouveau dérouler toutes les bulles.</li>
		<li>Couvrir le bord des plus proche sur le conteneur de tampon de transfert d’une pellicule plastique serviettes en papier. Il est important que le pont de papier construit à l’étape suivante n’entre pas en contact direct avec la pile de serviettes de papier.</li>
		<li>Tremper un morceau de papier filtre 15 x 35 cm dans le tampon de transfert et placez-le donc une extrémité couvre le haut du gel et l’autre extrémité est dans le conteneur de tampon de transfert. Répéter l’opération avec un autre pont.</li>
		<li>Couvrir le récipient d’une pellicule plastique et laisser une nuit à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blotting détection
<ol><li>Rincer la membrane avec 50 mL de PBS contenant 0,05 % de Tween-20 (PBST) dans un récipient de 20 × 20 cm. Ajouter 20 mL de lait 5 % dans du PBST. Roche à température ambiante pendant 30 min à bloquer.</li>
	<li>Déposer 10µl d’anticorps de lapin anti-MLKL dans 20 mL de lait 5 % dans du PBST et ajouter au conteneur. Incuber le rocker durant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver la membrane dans 20 mL de PBST pendant 5 min. Répétez 5 fois.</li>
	<li>Déposer 4 µL d’anti-rabbit-HRP à 20 mL de lait 5 % dans du PBST et ajouter au conteneur. Incuber le rocker à température ambiante pendant 2 h.</li>
	<li>Laver la membrane dans 20 mL de PBST pendant 5 min. Répétez 5 fois.</li>
	<li>Ajoutez le substrat chimiluminescence améliorée (ECL) et exposer aux films radiographiques selon le protocole du fabricant.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’aspect le plus important de la SDD 2D-âge, c’est que les conditions de l’électrophorèse sont les mêmes pour la première et la deuxième dimension. La capacité à détecter une forte diagonale à 45° (ce qui indique qu’aucune dissociation ou la dégradation ne s’est produite) dépend des fibres de migration de manière identique pendant les deux electrophoreses. À l’aide de conditions différentes, par exemple changer la tension ou la longueur du moment de l’exécution, masquera ces résultats. En outre, comme c’est le cas pour t...

La formation de fibres amyloïdes due à un mauvais repliement des protéines a longtemps à jouer un rôle dans des conditions pathologiques comme la maladie d’Alzheimer, de Parkinson et la maladie de Huntington1. Plus récemment, la formation des fibres amyloïdes ou type amyloïde s’est avérée être une partie des voies de signalisation chez les humains, y compris lors des anti-viraux réponse immunitaire innée2 et necroptosis3,4et chez les organismes inférieurs comme la levure5,6. Par conséquent, la capacité à détecter ces fibres dans le laboratoire est importante. Actuellement, il existe trois manières de détecter amyloïde et les fibres de type amyloïde : l’utilisation de colorants, EM et SDD-âge.
L’utilisation de colorants, comme le rouge Congo ou thioflavine T, offre l’avantage d’être rapide et facilement détectables à l’aide de la microscopie ou spectroscopie7. Toutefois, la détection au microscope, dans le cas du rouge Congo, ne fournit aucune spécificité dont les protéines forment les fibres ou la taille des fibres. De même, l’utilisation de la spectroscopie pour détecter le rouge Congo ou thioflavine T contraignant pour des complexes de protéine fournit seulement un résultat positif ou négatif.
EM fournit une preuve concluante de la présence de fibres ainsi que des informations quantitatives sur la longueur et le diamètre de fibre8. Toutefois, cette méthode nécessite une purification très stricte. En outre, l’EM est une technique spécialisée qui utilise des équipements coûteux.
DDD-AGE a été utilisé pour déceler les SDS résistant mega Dalton protéines complexes incluant des fibres amyloïdes ou type amyloïde. Il offre de nombreux avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas la purification des fibres et est facile à réaliser9. Deuxièmement, il fournit des informations qualitatives sur la taille des fibres, y compris la taille relative et la quantité de heterogenicity de la fibre. Enfin, parce que le Western blot peut être réalisée après électrophorèse, il est facile de détecter la présence d’une protéine pour laquelle il y a un anticorps, bien qu’il est à noter que DDD-âge étant semi dénaturation, certains épitopes peuvent rester cachés qui complique la détection de l’anticorps.
Récemment, interaction protéine kinase du récepteur de 1 (RIPK1) et 3 (RIPK3) ont été signalés à fibres amyloïdes forme pour servir de plates-formes de signalisation au cours de la necroptosis, une forme programmée de nécrose3. Alors qu’ils étudiaient ces fibres, notre laboratoire a montré qu’une autre protéine associée à la necroptosis, mélangé de kinase de lignée domaine ressemblant (MLKL), a également formé des fibres de type amyloïde4. Toutefois, suite à l’examen avec SDD-âge, la taille des fibres MLKL semblait distingue les fibres RIPK1 et RIPK3, qui est apparu identiques les uns aux autres (Figure 1). C’était inattendu, parce qu’il est bien connu que les MLKL se lie à RIPK1/RIPK3 pour former la necroptosis signalisation complexe appelé le necrosome10.
Il y a au moins deux explications. Tout d’abord, deux fibres de type amyloïde totalement distincts peuvent se former lors de necroptosis, un contenant RIPK1/RIPK3 et autre MLKL le contenant. En second lieu, qu’un seul type de fibres de type amyloïde que contenant RIPK1/RIPK3/MLKL peut se former pendant la necroptosis, mais l’association des MLKL avec les autres protéines est suffisamment faible pour qu’il se dissocie au cours de la SDD-âge.
Pour y remédier, nous vous proposons effectuant un bidimensionnel (2D) DDD-âge. DDD-âge-stable amyloïde ou des fibres de type amyloïde aura le même schéma de migration lors de l’électrophorèse de la première et la deuxième dimension. Ce sera détectable après transfert des protéines à une membrane et de réaliser un Western blot. Fibres stables exposera un motif diagonale forte. Tout écart par rapport à cela suggère que les fibres subissent des changements en raison de l’électrophorèse SDS.

<table><tbody><tr><td>Unité d’électrophorèse</td><td>sur gel Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus pour la course sur gel.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Pour gel d’agarose.</td></tr><tr><td>tour en papier</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>pour le transfert du</td></tr><tr><td>papier filtre</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>pour le transfert</td></tr> de <tr><td>la membrane PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>pour le transfert du</td></tr><tr><td>lait en poudre bloquant</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>pour le blocage en Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps MLKL Genetex</td><td></td><td>GTX107538</td><td>anticorps anti-MLKL pour lapin</td></tr><tr><td>Anticorps RIPK1</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>anticorps anti-RIPK1 de souris</td></tr><tr><td>Anticorps RIPK3</td><td>cadeau du Dr Xiaodong Wang</td><td></td><td>lapin anti-RIPK3. Voir la référence 11.</td></tr><tr><td>anticorps secondaire anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td></td><td>Substrat HRP chimiluminescent Fisher</td><td>WBKLS0500</td></tr><tr><td>Western film radiographique</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>pour Western blot résultat</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>péniciline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Solution de trypsine</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>PBS pour la culture tissulaire</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>TNF recombinant</td><td>fabriqué dans notre laboratoire</td><td></td><td>pour induire la nécroptose. Voir référence 11.</td></tr><tr><td>Don smac-mimétique</td><td>du Dr Xiaodong Wang</td><td></td><td>pour avoir induit la nécroptose. Voir référence 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>pour induire la nécroptose. Voir référence 11.</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>modèle TC20 ; pour le comptage des cellules</td></tr><tr><td>Pierce&trade ; Kit de dosage des protéines BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>pour mesurer la concentration en protéines dans les lysats cellulaires</td></tr><tr><td>Élévateur de cellules</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>pour retirer les cellules de la boîte</td></tr><tr><td>Tampon de lyse (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL glycérol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibiteurs de protéase et de phosphates au choix)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48,4 g Tris base 11,42 mL d’acide acétique glacial 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 à 1 L</td></tr><tr><td>4X tampon de charge SDD-AGE (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL de glycérol 4 mL 20 % SDS 0,5 mL 10 % de bleu de bromophénol 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>Tampon de transfert TBS (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>Tampon de lavage PBST (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot ; 2H2O 24 g KH2PO4 ajouter ddH2O à 10 L</td></tr></tbody></table>

utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Des fibres amyloïdes ou type amyloïde ont été associés à plusieurs maladies humaines et sont maintenant découverts importante pour nombreuses voies de signalisation. La capacité de facilement détecter la formation de ces fibres dans différentes conditions expérimentales est essentielle pour comprendre leur fonction potentielle. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter les fibres, mais pas sans quelques inconvénients. Par exemple, la microscopie électronique (me), ou coloration au rouge Congo ou thioflavine T souvent nécessite purification des fibres. En revanche, semi-dénaturation détergent gel d’agarose (SDD-AGE) permet de détecter des fibres amyloïdes semblables SDS-résistants dans les extraits de cellules sans purification. En outre, il permet la comparaison de la différence de taille des fibres. Plus important encore, il peut être utilisé pour identifier des protéines spécifiques dans les fibres par Western Blot. C’est moins fastidieux et plus facilement accessibles à un plus grand nombre de laboratoires. Résultats de la SDD-âge présentent souvent un degré variable d’hétérogénéité. Cela soulève la question de savoir si la partie de l’hétérogénéité résulte de la dissociation de la protéine complexe lors de l’électrophorèse en présence de SDS. Pour cette raison, nous avons utilisé une deuxième dimension du SDD-âge pour déterminer si l’hétérogénéité de taille vue dans SDD-âge est vraiment un résultat de fibre hétérogénéité en vivo et non le résultat de dégradation ou de dissociation de certains des protéines au cours de électrophorèse. Cette méthode permet la confirmation rapide et qualitative que les fibres amyloïdes ou type amyloïde ne sont pas partiellement dissociant au cours du processus de la SDD-âge.

Après l’induction de la necroptosis, RIPK1 et RIPK3 ont montré des patrons de type amyloïde presque identiques (pistes 2 et 4, Figure 1). Cependant, les fibres MLKL sont plus hétérogènes et semblaient être plus petites que les fibres de RIPK1/RIPK3 (voie 6, Figure 1). Qui nous a amenés à développer la méthode 2D de SDD-âge pour aborder la possibilité MLKL forme des fibres RIPK1/RIPK3-indépendant ou MLKL se dissocie simplement des...

Ici, nous utilisons bidimensionnelle semi dénaturation gel d’agarose pour confirmer la présence de fibres amyloïdes semblables de taille hétérogène et exclure la possibilité que l’hétérogénéité de taille est due à la dissociation des fibres amyloïdes durant le gel processus en cours d’exécution.

Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

L’objectif global de cette électrophorèse bidimensionnelle semi-dénaturante sur gel d’agarose est de confirmer l’hétérogénéité de taille des fibres amyloïdes ou amyloïdes observées lors du SDD-AGE traditionnel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’agrégation de l’amyloïde ou des protéines, par exemple si l’hétérogénéité de taille observée lors du SDD-AGE traditionnel est l’état natif des fibres in vivo ou le résultat de la dégradation ou de la dissociation des protéines lors de l’électrophorèse sur gel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée facilement en laboratoire sans équipement spécialisé.Aucun équipement supplémentaire n’est requis au-delà de ce qui est utilisé dans le SDD-AGE traditionnel. Tout d’abord, ensemencez les cellules cancéreuses du côlon HT-29 productrices d’amyloïde dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate pour laver les cellules. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine dans les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Une fois que les cellules se sont détachées de la boîte de culture, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture dans la plaque.Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 1 000 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu de culture.Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Ensuite, laissez deux plaques de culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, ajoutez des réactifs TSZ dans l’une des boîtes de culture en guise de traitement.Après environ six heures, récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir en plastique. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 1 000 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez deux fois la pastille cellulaire avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacée et répétez le processus de centrifugation.Ensuite, aspirez la solution PBS et transférez la pastille de cellule dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 0,3 millilitre de tampon de lyse à la pastille cellulaire et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Encore une fois, centrifugez à 20 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Le surnageant obtenu est le lysat cellulaire entier. Au surnageant, ajoutez 4X SDD-AGE tampon pour préparer 20 microlitres de trois microgrammes par microlitre d’échantillon. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes.Pour préparer le gel, ajoutez deux grammes de poudre d’agarose à 200 millilitres de tampon TAE dans un bécher en verre. Ensuite, faites chauffer le bécher au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Ensuite, ajoutez un millilitre de 20 % de SDS à une concentration finale de 0,1 % Agitez doucement le bécher.Ensuite, versez l’agarose liquide sur une plaque de gel de 15 x 14 centimètres. Pour éliminer les bulles d’air, utilisez une pipette d’un millilitre. Ensuite, placez un peigne de 20 puits sur le gel.Ensuite, ajoutez environ 60 microgrammes de lysat de cellules entières dans la voie la plus à droite du gel. Faites fonctionner le gel à 60 volts pendant environ quatre heures en utilisant le tampon TAE contenant 0,1 % de SDS comme tampon de fonctionnement. Pour faire fonctionner le gel dans la deuxième dimension, faites pivoter soigneusement le gel de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.Ensuite, faites fonctionner le gel à 60 volts pendant environ quatre heures. Dans un récipient de 20 x 20 centimètres, ajoutez 500 millilitres de tampon de transfert. Juste à côté du récipient, préparez une pile de cinq centimètres de haut d’essuie-tout.Ensuite, trempez deux papiers filtres, chacun de 14 x 15 centimètres, dans un tampon de transfert et placez-les sur la pile d’essuie-tout. Activez une membrane PVDF de 14 x 15 centimètres dans du méthanol pendant 30 secondes. Après l’activation, placez la membrane sur les papiers filtres et utilisez un rouleau pour éliminer toutes les bulles.La partie la plus importante du transfert est de s’assurer qu’aucune bulle d’air ne se forme entre le gel et la membrane. Rincez le gel avec un tampon de transfert et superposez-le sur la membrane. Déroulez toutes les bulles formées.Ensuite, utilisez une pellicule plastique pour couvrir le bord des serviettes en papier le plus proche du récipient tampon de transfert. Ensuite, trempez un morceau de papier filtre de 15 x 35 centimètres dans le tampon de transfert. Placez le papier filtre de manière à ce qu’une extrémité recouvre le haut du gel et que l’autre extrémité se trouve dans le récipient tampon de transfert.Couvrez le récipient d’une pellicule plastique et laissez reposer toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, rincez la membrane avec 50 millilitres de PBST dans un récipient de 20 x 20 centimètres. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de lait à 5 % de PBST sur la membrane.Ensuite, laissez la membrane sur la bascule à température ambiante pendant 30 minutes pour bloquer. Pipeter 10 microlitres d’anticorps anti-MLKL de lapin dans 20 millilitres de lait à 5 % dans PBST. Ensuite, ajoutez le mélange d’anticorps sur la membrane.Incuber la membrane sur un rocker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez la membrane avec 20 millilitres de PBST pendant cinq minutes. Ce lavage est répété cinq fois.Ensuite, pipetez quatre microlitres d’anticorps anti-HRP de lapin à 20 millilitres de lait à 5 % dans PBST. Ajoutez l’anticorps sur la membrane. Laissez le récipient avec la membrane sur la bascule à température ambiante pendant deux heures.Après deux heures, lavez la membrane cinq fois dans 20 millilitres de PBST pendant cinq minutes chacune. Enfin, ajoutez un substrat de chimiluminescence amélioré sur la membrane. Ensuite, exposez la membrane à un film radiographique selon les instructions du fabricant.Cette étude est réalisée pour démontrer la présence de fibres amyloïdes résistantes au SDS dans les lysats de cellules entières obtenus à partir de cellules traitées au facteur de nécrose tumorale alpha. Il montre ici que RIPK1 et RIPK3 présentent des motifs similaires similaires à ceux de l’amyloïde. Il est intéressant de noter que les fibres MLKL semblent hétérogènes avec un schéma de migration différent des autres.Cette image montre le schéma de migration possible des fibres amyloïdes ou de type amyloïde. Dans la première dimension SDD-AGE, les fibres amyloïdes ou de type amyloïde présentent un frottis caractéristique. Sur cette image, les fibres migrent à l’identique lors de la deuxième course et présentent un motif diagonal de migration sur la membrane à 45 degrés.Cela montre que les fibres ne subissent pas de dégradation ou de dissociation pendant le processus de fonctionnement du gel. Au contraire, si les fibres se dissocient, il y a des traînées verticales sous la ligne diagonale, indiquant une migration plus rapide des fibres plus petites lors de la deuxième électrophorèse. Ces deux premières et deuxièmes dimensions SDD-AGE montrent que les fibres MLKL ne se dissocient pas pendant le processus SDD-AGE et sont effectivement distinctes des fibres RIPK1 et RIPK3.Sur cette image, les fibres MLKL présentent un frottis caractéristique lors de la première dimension. Cependant, les mêmes fibres présentent une ligne diagonale nette sans traînées verticales dans la deuxième dimension SDD-AGE. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que toutes les conditions, telles que la tension et la durée du parcours, restent les mêmes entre la première et la deuxième dimension pour assurer une ligne nette à un angle de 45 degrés.Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que le décapage de la membrane et le ré-sondage avec d’autres anticorps, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, par exemple si la fibre contient d’autres protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de confirmer qu’aucune dégradation ou dissociation des fibres amyloïdes ou de type amyloïde n’a lieu pendant le SDD-AGE traditionnel.

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DDS-AGE est une technique utile pour la détection et la caractérisation de l'amyloïde comme les polymères dans les cellules. Ici nous démontrons une adaptation qui rend cette technique prêtent à grande échelle des applications.

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