Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

L’objectif global de cette électrophorèse bidimensionnelle semi-dénaturante sur gel d’agarose est de confirmer l’hétérogénéité de taille des fibres amyloïdes ou amyloïdes observées lors du SDD-AGE traditionnel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’agrégation de l’amyloïde ou des protéines, par exemple si l’hétérogénéité de taille observée lors du SDD-AGE traditionnel est l’état natif des fibres in vivo ou le résultat de la dégradation ou de la dissociation des protéines lors de l’électrophorèse sur gel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée facilement en laboratoire sans équipement spécialisé.

Aucun équipement supplémentaire n’est requis au-delà de ce qui est utilisé dans le SDD-AGE traditionnel. Tout d’abord, ensemencez les cellules cancéreuses du côlon HT-29 productrices d’amyloïde dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate pour laver les cellules. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine dans les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Une fois que les cellules se sont détachées de la boîte de culture, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture dans la plaque.

Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 1 000 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu de culture.

Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Ensuite, laissez deux plaques de culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, ajoutez des réactifs TSZ dans l’une des boîtes de culture en guise de traitement.

Après environ six heures, récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir en plastique. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 1 000 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez deux fois la pastille cellulaire avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacée et répétez le processus de centrifugation.

Ensuite, aspirez la solution PBS et transférez la pastille de cellule dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 0,3 millilitre de tampon de lyse à la pastille cellulaire et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Encore une fois, centrifugez à 20 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Le surnageant obtenu est le lysat cellulaire entier. Au surnageant, ajoutez 4X SDD-AGE tampon pour préparer 20 microlitres de trois microgrammes par microlitre d’échantillon. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes.

Pour préparer le gel, ajoutez deux grammes de poudre d’agarose à 200 millilitres de tampon TAE dans un bécher en verre. Ensuite, faites chauffer le bécher au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Ensuite, ajoutez un millilitre de 20 % de SDS à une concentration finale de 0,1 % Agitez doucement le bécher.

Ensuite, versez l’agarose liquide sur une plaque de gel de 15 x 14 centimètres. Pour éliminer les bulles d’air, utilisez une pipette d’un millilitre. Ensuite, placez un peigne de 20 puits sur le gel.

Ensuite, ajoutez environ 60 microgrammes de lysat de cellules entières dans la voie la plus à droite du gel. Faites fonctionner le gel à 60 volts pendant environ quatre heures en utilisant le tampon TAE contenant 0,1 % de SDS comme tampon de fonctionnement. Pour faire fonctionner le gel dans la deuxième dimension, faites pivoter soigneusement le gel de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.

Ensuite, faites fonctionner le gel à 60 volts pendant environ quatre heures. Dans un récipient de 20 x 20 centimètres, ajoutez 500 millilitres de tampon de transfert. Juste à côté du récipient, préparez une pile de cinq centimètres de haut d’essuie-tout.

Ensuite, trempez deux papiers filtres, chacun de 14 x 15 centimètres, dans un tampon de transfert et placez-les sur la pile d’essuie-tout. Activez une membrane PVDF de 14 x 15 centimètres dans du méthanol pendant 30 secondes. Après l’activation, placez la membrane sur les papiers filtres et utilisez un rouleau pour éliminer toutes les bulles.

La partie la plus importante du transfert est de s’assurer qu’aucune bulle d’air ne se forme entre le gel et la membrane. Rincez le gel avec un tampon de transfert et superposez-le sur la membrane. Déroulez toutes les bulles formées.

Ensuite, utilisez une pellicule plastique pour couvrir le bord des serviettes en papier le plus proche du récipient tampon de transfert. Ensuite, trempez un morceau de papier filtre de 15 x 35 centimètres dans le tampon de transfert. Placez le papier filtre de manière à ce qu’une extrémité recouvre le haut du gel et que l’autre extrémité se trouve dans le récipient tampon de transfert.

Couvrez le récipient d’une pellicule plastique et laissez reposer toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, rincez la membrane avec 50 millilitres de PBST dans un récipient de 20 x 20 centimètres. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de lait à 5 % de PBST sur la membrane.

Ensuite, laissez la membrane sur la bascule à température ambiante pendant 30 minutes pour bloquer. Pipeter 10 microlitres d’anticorps anti-MLKL de lapin dans 20 millilitres de lait à 5 % dans PBST. Ensuite, ajoutez le mélange d’anticorps sur la membrane.

Incuber la membrane sur un rocker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez la membrane avec 20 millilitres de PBST pendant cinq minutes. Ce lavage est répété cinq fois.

Ensuite, pipetez quatre microlitres d’anticorps anti-HRP de lapin à 20 millilitres de lait à 5 % dans PBST. Ajoutez l’anticorps sur la membrane. Laissez le récipient avec la membrane sur la bascule à température ambiante pendant deux heures.

Après deux heures, lavez la membrane cinq fois dans 20 millilitres de PBST pendant cinq minutes chacune. Enfin, ajoutez un substrat de chimiluminescence amélioré sur la membrane. Ensuite, exposez la membrane à un film radiographique selon les instructions du fabricant.

Cette étude est réalisée pour démontrer la présence de fibres amyloïdes résistantes au SDS dans les lysats de cellules entières obtenus à partir de cellules traitées au facteur de nécrose tumorale alpha. Il montre ici que RIPK1 et RIPK3 présentent des motifs similaires similaires à ceux de l’amyloïde. Il est intéressant de noter que les fibres MLKL semblent hétérogènes avec un schéma de migration différent des autres.

Cette image montre le schéma de migration possible des fibres amyloïdes ou de type amyloïde. Dans la première dimension SDD-AGE, les fibres amyloïdes ou de type amyloïde présentent un frottis caractéristique. Sur cette image, les fibres migrent à l’identique lors de la deuxième course et présentent un motif diagonal de migration sur la membrane à 45 degrés.

Cela montre que les fibres ne subissent pas de dégradation ou de dissociation pendant le processus de fonctionnement du gel. Au contraire, si les fibres se dissocient, il y a des traînées verticales sous la ligne diagonale, indiquant une migration plus rapide des fibres plus petites lors de la deuxième électrophorèse. Ces deux premières et deuxièmes dimensions SDD-AGE montrent que les fibres MLKL ne se dissocient pas pendant le processus SDD-AGE et sont effectivement distinctes des fibres RIPK1 et RIPK3.

Sur cette image, les fibres MLKL présentent un frottis caractéristique lors de la première dimension. Cependant, les mêmes fibres présentent une ligne diagonale nette sans traînées verticales dans la deuxième dimension SDD-AGE. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que toutes les conditions, telles que la tension et la durée du parcours, restent les mêmes entre la première et la deuxième dimension pour assurer une ligne nette à un angle de 45 degrés.

Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que le décapage de la membrane et le ré-sondage avec d’autres anticorps, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, par exemple si la fibre contient d’autres protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de confirmer qu’aucune dégradation ou dissociation des fibres amyloïdes ou de type amyloïde n’a lieu pendant le SDD-AGE traditionnel.