Profonde cutanée Injection comme un modèle d’Infection de la peau de Candida albicans pour les Analyses histologiques

Résumé

Nous décrivons ici un protocole qui permet l’analyse histologique et moléculaire des échantillons de peau après injection intradermique de Candida albicans . Ce protocole permet la localisation des cellules immunitaires tissulaires-résident ou nouvellement recrutés, mais aussi la distribution de l’agent pathogène et maintient l’intégrité structurale de la peau.

Résumé

La peau est un organe extrêmement étendu du corps et, en raison de cette grande surface, elle est exposée en permanence aux micro-organismes. Lésions cutanées peuvent facilement conduire à des infections dans le derme, ce qui peut, à son tour, entraîner la dissémination d’agents pathogènes dans la circulation sanguine. Comprendre comment le système immunitaire combat les infections au stade très précoce et comment l’hôte permet d’éliminer les agents pathogènes est une étape importante pour définir la base pour de futures interventions thérapeutiques. Nous décrivons ici un modèle d’infection de Candida albicans qui permet de visualiser les processus qui se produisent au début lors d’une infection, y compris lorsque l’agent pathogène a passé la barrière épithéliale, ainsi que la réponse immunitaire provoquée par le de c. albicans invasion. Nous avons utilisé ce modèle d’infection d’effectuer des analyses histologiques qui montrent les cellules immunitaires qui infiltrent la peau ainsi que la présence et la localisation de l’agent pathogène. Les échantillons prélevés après que l’infection peut être traitée pour l’extraction de l’ARN.

Introduction

Le corps humain est recouvert d’un nombre extrêmement élevé de micro-organismes. La surface de la peau est l’habitat de presque 1 million de bactéries par centimètre carré¹. Sur ce nombre, cependant, ne reflète pas la grande variété de micro-organismes qui colonise la peau. En plus des bactéries, le corps humain est colonisé par plusieurs espèces de champignons dont c. albicans, qui est capable de survivre à la muqueuse et la peau niveau².

Ces dernières années, le pourcentage de personnes atteintes d’infections fongiques a énormément augmenté. Ceci est principalement dû au nombre plus élevé de personnes immunodéprimées, c'est-à-dire, chez les patients VIH-positifs et les patients qui sont passés par une chimiothérapie ou immunosuppresseurs après transplantation³. Dans une étude de surveillance réalisée aux États-Unis, Wisplinghoff et coll. ont montré que 9,5 % des infections nosocomiales circulation sanguine ont été causés par les espèces de Candida ⁴. En raison de la présence accrue d’infections fongiques et notamment en raison du pourcentage élevé des espèces de Candida trouvés au cours de septicémies, comprendre comment ce pathogène échappe au contrôle du système immunitaire est extrêmement important.

C. albicans est un champignon dimorphique qui se développe sous différentes formes morphologiques comme levure, blastospores, pseudohyphes et les hyphes selon les conditions environnementales⁵. Dans sa forme mycélienne, c. albicans montre sa plus grande capacité de pouvoir envahissant et a la capacité de pénétrer l' épithélium⁶.

C. albicans infections ont été étudiées à l’aide de plusieurs approches expérimentales. Le modèle le plus courant d’infection est l’injection intraveineuse de c. albicans levure⁷. Toutefois, ce modèle ne prend pas en considération tous les processus qui se produisent avant que le champignon parvient à se propager dans la circulation sanguine. Un autre modèle tire parti de la capacité de c. albicans à envahir l’épithélium. Cette méthode, également connu sous le nom le papier sablé modèle⁸, a été développée par Gaspari et al. , 1998,⁹et consiste à l’aide de papier sablé frotter sur la peau, ce qui élimine la couche cornée avant l’application de c. albicans. Cette procédure permet au champignon de pénétrer dans l’épithélium, permettant ainsi l’analyse des capacités invasives de cet agent pathogène. Enfin, les autres modèles des infections pour la gastro-intestinal¹⁰ et respiratoires,¹¹ ont été utilisés dans différentes études.

La formation d’une plaie (comme dans le modèle de papier sablé) entraîne l’activation de plusieurs voies, y compris le recrutement de cellules immunitaires et d’activation, afin de favoriser la guérison des processus¹². Cela peut altérer ou masquer la réponse immunitaire provoquée spécifiquement contre l’agent pathogène, ce qui conduit à la confusion des résultats.

Nous décrivons ici une méthode d’infection de la peau qui évite la formation de la blessure initiale et l’induction d’un environnement inflammatoire basale. Pour maintenir la structure épithéliale intacte, on injecte directement c. albicans dans sa forme mycélienne dans le derme profond. Même si une seule injection peut déclencher l’inflammation bénigne, le montant de l’inflammation est limité et restreinte par rapport à la formation d’une plaie ouverte, comme dans le modèle de papier sablé. L’approche que nous décrivons ici permet l’étude de la réponse immunitaire à l’infection fongique et propagation tout en évitant l’environnement inflammatoire excessive et préexistant, causée par des lésions mécaniques.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvés dans le Comité de l’emploi (IACUC) animalier institutionnel et exploités sous la supervision du ministère des ressources animales chez les enfants de l’hôpital (ARC) à l’hôpital pour enfants de Boston ou ont été approuvées par l’italien Ministère de la santé et réalisé par le Comité de protection des animaux institutionnelle à l’Université de Milan-Bicocca.

1. préparation de c. albicans

1. La culture C. albicans, souche CAF3-1¹³, dans des tubes contenant du milieu riche (levure extrait peptone dextrose (YEPD), extrait de levure 1 % (p/v), 2 % (p/v) de Bacto Peptone, 2 % (p/v) de glucose) additionné de l’uridine (50 mg/L) à 25 ° C. Dans ces conditions, c. albicans se développe comme une levure.
   Remarque : Autres souches de c. albicans peuvent être utilisés, comme la clinique isoler la souche SC5314 de c. albicans ¹³. Étant donné que nous avons récemment démontré que le processus ulcéreuse est induit par l’activation du système immunitaire inné¹⁴, théoriquement chaque souche de c. albicans qui maintient ses composants de la paroi cellulaire et de la structure, ainsi que la capacité à l’origine des projections des hyphes, pourrait être utilisé.
2. Surveiller la culture en comptant la concentration cellulaire en utilisant un analyseur de compteur de cellules.
3. Récolter la culture lorsqu’il atteint une concentration d’environ 8 x 10⁶ cellules/mL. Vous pouvez également utiliser un spectrophotomètre pour mesurer l' OD₆₀₀.
   Remarque : Généralement, une valeur de OD₆₀₀ = 1 correspond à une concentration de levure de 3 x 10⁷ cellules/mL, mais le titrage est recommandé.
4. Remettre en suspension de la culture dans un milieu YEPD-uridine, utilisant HEPES (50 mM, pH 7,5) comme un agent tampon et incuber la culture à 37 ° C pour induire la formation d’hyphes. Vérifier la formation des hyphes sous un microscope grossissement X 100. Formation des hyphes est visible 5 h après mise en culture à 37 ° C ; Cependant, utiliser les cellules 16 h après incubation à 37 ° C, lorsque le pourcentage des hyphes atteint près de 95 % de la culture totale.
5. D’enrichir encore la préparation à la concentration des hyphes, centrifugeuse aliquotes de la culture à 3 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans du PBS stérile à une concentration de 1 x 10⁸ hyphes/mL.

2. profondeur dermique Injection

1. 24h avant la procédure de l’infection, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) et ensuite se raser le flanc des souris à l’aide d’une tondeuse électrique.
   Remarque : Après toute procédure impliquant l’anesthésie, placez les souris sous une lampe chauffante jusqu'à ce qu’ils ont récupéré efficacement.
2. Reposer les souris pendant 24 heures afin d’éviter toute inflammation due au processus de rasage.
3. 24h après l’intervention de rasage, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
4. Vérifier le réflexe de la patte pour s’assurer que les souris sont profondément anesthésiés. Évaluer le réflexe de la patte en pinçant fermement la patte. Si l’anesthésie est obtenu, l’animal ne sent pas de douleur et ne bouge pas.
5. Injecter dans le derme profond à l’aide d’une seringue à insuline 0,3 mL avec une aiguille de 30 x 8 mm dans un volume final de 50 µL/injection, correspondant à 5 x 10⁶ hyphes/injection, les hyphes de c. albicans .
   1. Tendre la peau du flanc rasé à l’aide de deux doigts pour injecter le volume directement dans le derme profond. Insérer l’aiguille à un angle de 10-15° avec le biseau de l’aiguille vers le haut.
   2. Avec cet angle, l’agent pathogène sera injecté avec une profondeur d’environ 300 à 500 µm. Afin d’assurer que l’injection est bien effectuée, vérifiez que le volume injecté forme une bosse qui est absorbé quelques minutes après l’injection.
      Remarque : La bosse formée après que l’injection sera d’environ 1 cm². Il s’agit de la zone qui sera supprimée au point de temps désigné pour l’analyse moléculaire ou histologique.
   3. Pour des moments de moins de 24 h (recommandé), délimiter la zone d’infection avec un marqueur, puisque la bosse formée avec l’injection persiste pendant quelques minutes, après quoi il est absorbé. Pour les points de temps de 24h ou plus, cette étape n’est pas nécessaire, car un ulcère ou un kyste sera clairement visible.

3. exemple de prélèvement et la préparation pour la coloration histologique

1. Euthanasier les souris selon les procédures institutionnelles.
2. À l’aide de pinces chirurgicales, tirer la peau à la frontière du site injecté, précédemment marqué par le marqueur. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, l’accise le site infecté en coupant la peau après la ligne tracée.
   Remarque : Veillez à séparer la peau du péritoine à l’aide de ciseaux de pointe ogive.
3. Immerger la peau dans un moule jetable rempli de température de coupe optimale (OCT), composée de la face interne de la peau vers le haut. Congeler l’échantillon dans l’azote liquide jusqu'à ce que le composé devient blanc. Ne pas laisser l’azote liquide couvre l’échantillon avant il est complètement gelée que cela nuirait à l’échantillon.
   Remarque : attention ! Au cours de l’étape 3.3, porter un écran facial de protection à l’azote liquide.
4. Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement pour la préparation de la diapositive, rapidement les stocker à-80 ° C.
   NOTE : Échantillons peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C.

4. préparation des lames

1. Couper l’échantillon en deux pour préparer les tranches pour histologie à partir du centre de l’échantillon.
2. Couper 5 µm tranches épaisses avec un cryostat.
   Remarque : Pour les échantillons de peau, la température du cryostat ne doit pas être supérieure à-25 ° C. Une température plus élevée provoque une fusion partielle de la H-OCT et c’est pourquoi les échantillons ne seraient pas maintenus en bonne position au cours de la procédure de coupe.
3. Lames de microscope chargés positivement permet de recueillir les tranches.
4. Si les tranches collectés ne servent pas peu de temps après la préparation, les stocker à-20 ° C. À ce stade, tranches peuvent être conservés à-20 ° C indéfiniment.

5. hématoxyline et éosine coloration

1. Tacher les diapositives par immersion dans l’hématoxyline Gill pendant 4 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 5 min.
2. Tache de que les diapositives par immersion dans une solution d’éosine Y pendant 1 min. Lavez les diapositives dans la gestion de l’eau du robinet pendant 5 min. Rincer les diapositives à l’aide l’eau distillée avant de continuer le protocole.
3. Déshydrater par immersion dans la série des concentrations croissantes de solutions éthanoliques (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 %). Plonger les lames pendant 15 s dans chaque solution d’éthanol.
4. Désactivez les diapositives pendant au moins 2 min par immersion dans un commissionnaire histologique.
5. Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage et de lamelles.
6. Acquisition d’images des diapositives avec un scanner de diapositives de microscope à un grossissement de X 40.

6. acide périodique-Schiff (PAS) une coloration

1. Fixer les lames avec ≥99. 5 % acétone à température ambiante pendant 1 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 1 min.
2. Tacher les diapositives par immersion dans une solution acide périodique (1 g/dL) pendant 5 min. laver les diapositives de 3 changements d’eau distillée.
3. Tacher les diapositives par immersion dans du réactif de Schiff pendant 15 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 5 min.
4. Tacher les diapositives par immersion dans l’hématoxyline Gill pour 5 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 30 s.
5. Déshydrater les diapositives par immersion dans 3 changements d’éthanol à 100 %. Plonger les lames pendant 15 s chaque fois.
6. Désactivez les diapositives pendant au moins 2 min par immersion dans un commissionnaire histologique.
7. Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage et de lamelles.
8. Acquisition d’images des diapositives avec un scanner de diapositives de microscope.

7. l’échantillon prélèvement et la préparation pour l’Extraction de l’ARN

1. Euthanasier les souris selon les procédures institutionnelles. Enlever les échantillons de peau comme dans l’étape 3.2.
2. Immerger les échantillons dans un tube à bouchon-pression 2 mL avec 1 mL de réactif pour l’extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium acide.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C.
3. Couper l’échantillon en morceaux d’environ 0,2 cm² à l’aide de pinces chirurgicales.
   Remarque : attention ! La plupart des réactifs pour les ARN sont mutagènes et toxiques. Les étapes 7.3 et 7.4 doit se faire sous une hotte aspirante.
4. Briser l’échantillon avec un moulin à billes à une vitesse de 20 oscillations/s pendant 20 min. par ailleurs, un potier mécanique peut être utilisé.
5. Vérifier l’homogénéisation efficace des échantillons en recherchant la présence de pièces intactes de la peau. Répétez cette étape si les échantillons ne sont pas complètement homogénéisées.
6. Centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 1 min. Gardez les surnageants pour extraction de l’ARN et jeter le culot. Cette étape est effectuée pour éliminer les cheveux et les débris qui pourraient bloquer les colonnes d’extraction.
7. Procéder à l’extraction de l’ARN à l’aide de RNA purification colonnes¹⁴.
8. Un spectrophotomètre permet d’évaluer la concentration et la purification de la RNA. Si RNA extraits ne sont pas utilisés immédiatement pour la préparation de la cDNA, stocker les échantillons à-80 ° C.

Résultats

Grâce à l’injection de l’agent pathogène directement dans le derme profond, la morphologie structurale du tissu reste intacte (Figure 1 a).

Le maintien de l’intégrité structurale de la peau permet la détection des cellules immunitaires et leur localisation sur le site de l’infection. Le grossissement supérieur illustré à la Figure 1 b révèle que l’abcès se compose princ...

Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode de l’infection à c. albicans pour étudier le processus inflammatoire qui est ouverte sur l’entrée fongique dans le derme profond.

Même si la formation d’abcès de peau est un événement relativement rare lors d’infection à c. albicans ¹⁵, injection du champignon directement dans le derme profond permet non seulement l’étude de la formation d’abcès axée sur les champignons, mais aussi l’analyse d’immunitaire spécifique c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
s
PBS	Euroclone	ECB4053L	chauds en 37 ° ; C bain avant utilisation
Composé H-OCT	histo-line laboratories	R0030
Gill’s Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution alcoolique	histo-line	laboratories 09-209-05
Éthanol absolu	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, support de montage	bio-optique
Acétone	sigma-aldrich	179124
système de coloration PAS	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydre pour la biologie	moléculaireApplichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Tubes Safe-Lock 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxique, corrosif et mutagène. Prenez toutes les précautions nécessaires
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
azote			Porter une protection oculaire
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
strong>Matériaux
0,3 ml Seringue à insuline avec une aiguille 30G x 8mm  ;	BD	324826
Pince
Ciseaux chirurgicaux Moule
de base jetable	histo-line laboratoires	2781
Lames de biomicroscope à charge positive	bio-optica	09-2000
Lamelles 24 x 50 mm	11911998		thermo scientifique

liquide <chirurgicale