طريقتين ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية لتطبيقات هندسة الأنسجة

Summary

نقدم هنا، واستخدام البروتوكولات التباين اثنين ديسيلولاريزي الأنسجة النباتية: نهج قائم على المنظفات واتباع نهج خالية من المنظفات. كلا الأسلوبين تترك وراءها المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة النباتية المستخدمة، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة.

Abstract

ترقيع ذاتي والاصطناعية، والمستمدة من الحيوانات المستخدمة حاليا السقالات لاستبدال الأنسجة على قيود نظراً لانخفاض توافر وسوء توافق مع الحياة، والتكلفة. الأنسجة النباتية لها الخصائص المواتية التي تجعلها مناسبة بشكل فريد لاستخدامه السقالات، مثل مساحة سطح عالية وممتازة والمياه والنقل والاحتفاظ بها، المسامية المترابطة، preexisting شبكات الأوعية الدموية، ومجموعة واسعة من الميكانيكية خصائص. يتم وصف الأساليب الناجحة اثنين من مصنع ديسيلولاريزيشن لتطبيقات هندسة الأنسجة هنا. وتستند الطريقة الأولى الحمامات المنظفات لإزالة المسألة الخلوية، ومشابهة للطرق المحددة سابقا المستخدمة لمسح أنسجة الثدييات. والثاني هو أسلوب خال من المنظفات مقتبس من بروتوكول أن يعزل المفرج أوراق وينطوي على استخدام التبييض ساخنة وحمام الملح لمسح أوراق الشجر وينبع. كلا الأسلوبين العائد السقالات مع خصائص ميكانيكية قابلة للمقارنة، وانخفاض تأثير الأيض الخلوية، مما يسمح للمستخدم بتحديد البروتوكول الذي يناسب أفضل التطبيق المقصود بهم.

Introduction

هندسة الأنسجة ظهرت في الثمانينات لإنشاء الأنسجة الحية بدائل، ويحتمل أن تكون عنوان كبير والأنسجة النقص¹. وقد استخدمت استراتيجية واحد السقالات لتحفيز وتوجيه الجسم لتجديد أنسجة مفقودة أو الأجهزة. ورغم المتقدمة التصنيع النهج مثل الطباعة ثلاثية الأبعاد قد أنتجت السقالات مع الخصائص الفيزيائية الفريدة، القدرة على تصنيع السقالات مع مجموعة متنوعة من خصائص فيزيائية وبيولوجية قابلة للتحقيق لا يزال تحدي^{2 , 3}-وعلاوة على ذلك، بسبب عدم وجود شبكة الأوعية الدموية الوظيفية، هذه التقنيات كانت محدودة في تجديد أنسجة ثلاثية الأبعاد. وقد ساعد استخدام الأنسجة الحيوانية والبشرية ديسيلولاريزيد السقالات في التحايل على هذه المشكلة^4،5،،من⁶⁷. ولكن التكلفة عالية وتقلب دفعة بدفعه، ومحدودية قد تحد من الاستخدام الواسع النطاق للحيوان ديسيلولاريزيد السقالات⁸. وهناك أيضا مخاوف من احتمال انتقال المرض للمرضى وردود الفعل المناعية لبعض أنسجة الثدييات ديسيلولاريزيد⁹.

السليلوز، المستمدة من النباتات ومصادر البكتيرية، وقد استخدمت على نطاق واسع لتوليد الحيوية لمجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الطب التجديدي. وتشمل بعض الأمثلة: العظام^10،11والغضاريف^12،،من¹³¹⁴ والجرح الشفاء¹⁵. السقالات التي تتكون من السليلوز لديها ميزة إضافية حيث أنها دائمة ومقاومة ليجري تقسيمها بخلايا الثدييات. وهذا يرجع إلى أن خلايا الثدييات لا تنتج الإنزيمات اللازمة لكسر جزيئات السليلوز. وبالمقارنة، السقالات المنتجة باستخدام الجزيئات الكبيرة من المصفوفة خارج الخلية، مثل الكولاجين، وهي سهولة موزعة على¹⁶ وقد لا تكون مناسبة تماما لتطبيقات طويلة الأجل. يمكن أن تستقر السقالات الكولاجين بالمواد الكيميائية العابرة للربط. ومع ذلك، هناك مفاضلة نظراً لسمية كروسلينكيرس التي تؤثر على توافق مع الحياة من السقالات¹⁷المتأصلة. على العكس من ذلك، لقد السليلوز يمكن أن تظل موجودة في موقع غرس لفترات طويلة من الزمن لأنها منيعة للتحلل الأنزيمي بخلايا الثدييات^18،،من¹⁹²⁰. يمكن تغيير هذا بضبط معدل التدهور من خلال المعالجة التحلل المائي وتسليم المشارك من السقالات مع سيلولاسيس²¹. قد تجلى أيضا توافق مع الحياة من السليلوز ديسيلولاريزيد المشتقة من النباتات السقالات في فيفو في دراسة أجريت على الفئران²².

من خلال مئات ملايين السنين من التطور، قد صقل النباتات هيكلها وتكوينها لزيادة كفاءة نقل السوائل والاحتفاظ بها. مصنع السفن الأوعية الدموية تقليل المقاومة الهيدروليكية بالتفريع إلى سفن أصغر حجماً، مماثلة للمفرج الثدييات وفقا للقانون موراي²³. بعد ديسيلولاريزيشن، يتم الاحتفاظ بالمصنّع شبكة معقدة من السفن والمسام مترابطة. ونظرا لعدد كبير من الأنواع النباتية المتميزة المتاحة بسهولة، السقالات المشتقة من النباتات لديها القدرة على التغلب على قيود التصميم التي تؤثر حاليا على السقالات في الأنسجة الهندسة^24،25. على سبيل المثال، أظهر مودوليفسكي et al. أن الهجرة تولد الأوعية وخلية وقع عندما كان مزروع أبل ديسيلولاريزيد النسيج تحت الجلد في الجزء الخلفي من الماوس²². وعلى نحو مماثل، أظهر جيرشلاك et al. أن غشائي الخلايا يمكن أن تزرع داخل المفرج يترك ديسيلولاريزيد²⁴. في تجربة منفصلة، جيرشلاك et al. كانت أيضا قادرة على إظهار أن كارديوميوسيتيس يمكن أن تزرع على سطح الأوراق، وتمكنت من عقد²⁴.

وتشمل النباتات أيضا منظمة معقدة من الخلوية جدول العيانية، وصعب التحقيق حتى مع تقنيات التصنيع الأكثر تقدما التي وضعت حتى الآن. تصميم هيكلية معقدة من الأنسجة النباتية يجعلها أقوى من مجموع بهم المقومات²⁶. تمتلك مجموعة كبيرة خصائص الميكانيكية المختلفة التي تتراوح بين مكونات جامدة وصعبة مثل ينبع النباتات, منها أكثر مرنة وطيعة مثل يترك²⁷. يترك تختلف تبعاً لأنواع من حيث الحجم والشكل، وكسر قوة، الدرجة من الأوعية الدموية، ويمكن أن تحمل درجات مختلفة من هيدروفيليسيتي. عموما، هذه الخصائص النباتية تشير إلى أن النباتات ديسيلولاريزيد يمكن أن تكون أجهزة طبية فريدة من نوعها ودرجة عالية من الفنية، بما في ذلك الأنسجة الهندسة السقالات.

هذا البروتوكول ويركز على طريقتين ديسيلولاريزي الأنسجة النباتية، مثل يترك وينبع، لاستخدامها السقالات في هندسة الأنسجة. الأسلوب الأول هو أسلوب المستندة إلى المنظفات الصناعية التي يستخدم سلسلة من الحمامات لإزالة الحمض النووي والمسألة الخلوية، وقد تم تكييف من تقنية تستخدم على نطاق واسع ديسيلولاريزي الثدييات وزرع الأنسجة^{6،22،25 ،،}من^2829،30. الطريقة الثانية هي خالية من المنظفات ومقتبسة من بروتوكول "سكيليتونيزيشن" يستخدم عموما لإزالة الأنسجة الرخوة ليترك³¹. وأظهر العمل السابقة أن يغلي يترك في حل التبييض وبيكربونات الصوديوم سهل فصل المفرج من الأنسجة اللينة المحيطة بها³¹. هذا الأسلوب يمكن الاستشهاد بالعودة إلى التجارب التي أجريت في 17^عشر والقرون^ال 18، مثل أعمال صبا ألبرتوس³² و³³من باريش إدوارد. هذه التجارب التي تتمحور حول ترك هذه المسألة النباتية، مثل أوراق الشجر والفواكه، مغمورة في الماء لفترات طويلة من الوقت (أسابيع إلى أشهر) والسماح للأنسجة ليونة إلى الاضمحلال بعيداً بطبيعة الحال. هنا هو تكييف النهج "سكيليتونيزاتيون" استخدام شروط أكثر اعتدالا، مثل أوقات أطول في الحضانة عند درجات حرارة منخفضة، لإزالة المخلفات الخلوية وتجنب الإخلال بدرجة كبيرة بنية الأنسجة اللينة. لتجارب هذه الوثيقة بالتفصيل، واستخدمت ثلاثة أنواع النبات: Ficus hispida، اكواتيكا بشيرة ، ونوع من أنواع غاركينيا. ويرد وصف نتائج الحمض النووي الكمي والاختبارات الميكانيكية، وأثر على نشاط الأيض الخلوية من كلتا الطريقتين.

Protocol

1-ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية باستخدام النهج القائم على المنظفات

1. استخدام الطازجة أو المجمدة hispida واو، عينات أوراق. تجميد عينات جديدة غير مستخدمة في الثلاجة-20 درجة مئوية، ومخزن للاستخدام في المستقبل (حتى سنة).
   ملاحظة: استخدام الأنسجة الجذعية أو أوراق تقريبا أي مصنع المرجوة. مرات التخزين الموسعة يمكن أن تسبب ضررا للأنسجة.
   1. تحديد حجم وشكل العينات بحيث تتم معالجتها على أساس الاستخدام المقصود للعينة (أي عينات قطع إلى شرائح مناسبة تماما لتطبيقات اختبار الميكانيكية، وفي الوقت نفسه عينات القرص 8 مم مفيدة في تطبيقات متعددة تثقيف ). قطع الورقة إلى أقراص 8 ملم مع خزعة حادة ونظيفة لكمه حين المغمورة تحت درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) منزوع H₂o.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول على كامل الأوراق والسيقان. ومع ذلك، سوف ديسيلولاريزي عينات أصغر أسرع.
   2. احتضان هذه العينات لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) منزوع ح₂س على مجموعة لوحة يهز إلى إعداد سرعة منخفضة يغسل و/أو ذوبان الجليد لهم. استخدام ما يكفي منزوع ح₂س لضمان أن جميع العينات ترطب جيدا.
2. تعد حلاً من 10% (w/v) الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في منزوع ح₂مكان سين العينات في حاوية مناسبة (الزجاج أو البلاستيك طبق مثالي) وإضافة حل الحزب الديمقراطي الصربي لتغطي كامل العينات. احتضان عينات لمدة 5 أيام في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) على مجموعة لوحة يهز إلى سرعة منخفضة لمنع الأضرار بالعينات.
   ملاحظة: لا أوفيركروود الحاوية كهذا يمكن أن تبطئ عملية ديسيلولاريزيشن ويؤدي إلى تفاوت في المعاملة من جانب الحزب الديمقراطي الصربي. أثناء هذه الخطوة، ينبغي الحصول على عينات صبغة بني.
   1. بعد 5 أيام، يستعاض عن حل الحزب الديمقراطي الصربي بمنزوع ح₂إينكوباتي O. العينات 10-15 دقيقة إضافية على لوحة اهتز دقة شطف أي حل الحزب الديمقراطي الصربي المتبقية.
3. إعداد 1% (v/v) غير الأيونية خافض للتوتر السطحي في حل التبييض 10% (v/v). لجعل حل 500 مل، ومزيج 5 مل السطح غير الأيونية مع 50 مل التبييض ثم إضافة مل 445 منزوع ح₂سوبميرجي O. عينات في حل الطازجة.
   ملاحظة: الحل غير الأيونية الفاعل/التبييض ليس لديها صلاحية طويلة، ولذلك، ينبغي أن تستخدم خلال 48 ساعة التحضير.
4. استبدال الحل الفاعل غير أيونى/التبييض كل 24 ساعة حتى يتم مسح العينات تماما (راجع الشكل 1A للمقارنة البصرية). ثم احتضان العينة في المياه على لوحة الرج ل 2 دقيقة شطف الحل الفاعل غير الأيونية الزائدة/التبييض. تعيين لوحة اهتزاز لإعداد منخفض لمنع إتلاف العينات.
   ملاحظة: يختلف الوقت اللازم لمسح العينات المستخدمة، اعتماداً على نوع وأنواع النبات. التشويه الكامل للعينات إرشادي لكامل ديسيلولاريزيشن (إجراء التقدير الكمي الحمض النووي لضمان تطهير شامل).
   1. ليوفيليزي العينات لتخزينها تصل إلى سنة (فلاش تجميد استخدام النتروجين السائل المفضل، وأيضا مقبول تجميد عينات في-80 درجة مئوية) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) في انخفاض الرطوبة.
   2. إعادة تشكيل العينات في تريس-HCl (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5) باستخدام ما يكفي لعينات معطف. شطف عينات 2-3 مرات في وسائل الإعلام الحرة المصل برفق باستخدام ميكروبيبيتي من قبل الاستخدام (أي استخدام 150-300 ميليلتر الواحدة شطف، في صفيحة جيدا 24 قياسية).
      ملاحظة: المخزن المؤقت تريس-HCl ووسائل الإعلام الحرة المصل (أي دميم، ولكن أي ثقافة الخلية الأساسية يمكن أن يكون محل وسائل الإعلام) أكثر فعالية في خفض التأثير على بقاء الخلية من الحزب الديمقراطي الصربي معاملة عينات من تلك تعامل مع منزوع ح₂س وحدها.

2-إعداد العينات باستخدام نهج ديسيلولاريزيشن خالية من المنظفات

ملاحظة: الخطوات الأولى لهذا الإجراء يتزامن مع الخطوات 1.1-1-1-2 (انظر أعلاه).

1. إعداد 5% (v/v) التبييض (ناكلو) ومحلول بيكربونات الصوديوم (ناكو₃) 3% (w/v). الحارة الحل في غطاء دخان إلى 60-70 درجة مئوية لعينات نبات hispida واو يقتطع أقراص 8 مم بينما التحريك على لوحة الساخن.
   ملاحظة: يمكن أن يكون محل بيكربونات الصوديوم مع كربونات الصوديوم (Na₂CO₃) أو هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم). درجة الحرارة المطلوبة تتفاوت إلى حد كبير (من درجة حرارة الغرفة إلى 90 درجة مئوية)، وينبغي أن تعدل وفقا لخصائص العينات المستخدمة.
2. حالما يصل الحل إلى نطاق درجة الحرارة المرغوبة، غمر العينات والحد من سرعة إثارة لتجنب تعرضها للتلف. بعد أن يتم مسح العينات واضح (انظر الشكل 1B للمقارنة البصرية)، إزالة من الحمام بعناية. احتضان عينات مرة واحدة في منزوع ح₂س لمدة 1-2 دقيقة إزالة الحل التبييض الزائدة.
   ملاحظة: الوقت اللازم لمسح العينات التي يمكن أن تختلف على نطاق واسع. على سبيل المثال، يمكن مسح البقدونس قطع في 10-15 دقيقة، في حين عينات أكثر سمكا و/أو أكبر مثل ما يترك الجامعة أو ينبع يمكن أن يستغرق ساعات في الحمامات ذات درجة الحرارة العالية واضحة تماما.
3. ليوفيليزي العينات وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) في انخفاض الرطوبة.

Representative Results

كلا الأسلوبين أسفرت عن السقالات التي كانت مناسبة لزراعة الخلايا والأنسجة التطبيقات الهندسية. ويبين الشكل 1 سير العمل العامة لعملية ديسيلولاريزيشن باستخدام جريد سليمة للأسلوب القائم على المنظفات وقطع عينات (8 مم) الخاصة بطريقة خالية من المنظفات. ديسيلولاريزيشن الناجح الأنسجة Ficus hispida عقب كلا الأسلوبين أسفرت عن عينات واضحة وسليمة (الشكل 1A و 1B). كان من الممكن ديسيلولاريزي أنسجة النبات (الشكل 1A)؛ ومع ذلك، ظهرت عينات صغيرة لمسح أسرع وأكثر فعالية. وتشارك مشكلة محتملة لاحظ مع النهج القائم على المنظفات ديسيلولاريزيشن غير متجانسة نتيجة للإزالة المبكرة من حمام السطح غير الأيونية (الشكل 1). عيب الأسلوب خالية من المنظفات أن الضرر يمكن أن يحدث بسبب حضانة طويلة في حمام ساخن (الشكل 1).

الخواص الميكانيكية للسقالات ديسيلولاريزيد المعدة باستخدام كلا الأسلوبين تم التحقيق باستخدام اختبار الشد أونياكسيال مثلما حدث في^24،دراسات أخرى³⁴. هذه التجارب أسفرت عن معامل المماس الحد الأقصى (أم تي أم) (الشكل 2A)، سلالة في فشل (القوات المسلحة السودانية) (الشكل 2)، وفي نهاية المطاف قوة الشد (إقليم اتحادي) (الشكل 2) لعينات واو hispida و اكواتيكا بشيرة . عرض عينات اكواتيكا P. المعدة باستخدام كلا البروتوكولين ديسيلولاريزيشن الخصائص الميكانيكية مماثلة عبر كل ثلاثة معلمات قياس. أظهرت وجود اتجاه مماثل في جميع الحالات باستثناء إقليم اتحادي اختبار العينات hispida واو . على وجه الخصوص، كانت العينات المعدة باستخدام البروتوكول (SDS) المستندة إلى المنظفات نتائج إقليم اتحادي متوسط أعلى من تلك التي أعدت مع النهج (التبييض) خالية من المنظفات. وتظهر هذه النتائج أن العينات التي تم جمعها من الأنواع النباتية المختلفة قد تنتج خصائص متميزة سقالة ديسيلولاريزيد عندما أعدت عبر البروتوكولين ديسيلولاريزيشن.

لقياس إزالة الحمض النووي، تم مسح العينات باستخدام أي من الطريقتين وعينات من الحمض النووي الجينومي المعزولة باستخدام بروتوكول المحددة سابقا³⁵. كلا الأسلوبين ديسيلولاريزيشن (القائم على المنظفات وخالية من المنظفات) تناقص محتوى الحمض النووي الجينومي العينات إلى 2.47 نانوغرام من الحمض النووي/mg (n = 3، s = 0.18) و 2.71 نانوغرام من الحمض النووي/ملغ أنسجة (n = 3، s = 1.60) على التوالي (الشكل 2D). عدم ديسيلولاريزيد العينات قد 104.67 نانوغرام من الحمض النووي/ملغ أنسجة (n = 3، s = 26.21) (الشكل 2D). المسألة الانخفاض الكبير في محتوى الحمض النووي بعد ديسيلولاريزيشن أشارت إزالة فعالة للخلية النباتية.

تم تقييم أثر ذلك على بقاء الخلية طريقتين ديسيلولاريزيشن بقياس النشاط الأيضي للبشرية الليفية الجلدية (hDF) مثقف لمدة يومين بحضور ديسيلولاريزيد P. اكواتيكا أو السقالات غاركينيا . وكان هي ارتفاع النشاط الأيضي عند مثقف حضور السقالات ديسيلولاريزيد عبر طريقة خالية من المنظفات مقابل تلك التي أعدت عن طريق الأسلوب القائم على المنظفات (الشكل 3A). لضمان كان إجراء إزالة شاملة من الكواشف المستخدمة أثناء ديسيلولاريزيشن، مجموعة إضافية من التجارب التي تم غسلها السقالات مستعدة على نطاق واسع قبل زراعة الخلايا. تم اختبار طريقتين الغسيل منفصلة على عينات المعدة باستخدام النهج القائم على المنظفات: يغسل في المخزن المؤقت تريس-HCl (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5) تليها يغسل في "وسائل الإعلام الحرة المصل" مقابل يغسل 2 في منزوع H₂o. يستخدم كلا النهجين خطوات الغسيل النهائي مع برنامج تلفزيوني 1 x. تم قياس أثر على خلايا الثدييات بعد ذلك عرضه للسقالات مصنع ديسيلولاريزيد باستخدام مقايسة النشاط الأيضي نفس النحو الوارد أعلاه. العازلة تريس-HCl (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5) متبوعاً "المصل وسائل الإعلام الحرة" ساعدت في التقليل من أثر على نشاط الأيض الخلوية مقارنة مع منزوع ح₂س، مما يجعل عينات تعامل مع النهج القائم على المنظفات قابلة للمقارنة لعينات من خالية من المنظفات الأسلوب (الشكل 3B).

وقد تبين سابقا أن خلايا الثدييات يمكن أن تنمو على السقالات المعدة باستخدام النهج القائم على المنظفات²⁵؛ ولذلك، من الضروري أن تثبت ذلك في العينات التي أعدت بطريقة خالية من المنظفات لم تختبر سابقا. كانت تبذر الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في ديسيلولاريزيد hispida واو ليف عينات (أقراص 8 مم) في الخلايا 20,000 كل سقالة ويسمح لاحتضانها ح 24. وقد فونكتيوناليزيد هذه السقالات قبل إدخال خلية مع المتقارن دوبامين إدارات لتسهيل الانضمام. ويبين الشكل 4 الصور التي تم جمعها من عينة نموذجية. وجمعت صورة مشرقة حقل لإظهار الهيكل العام لقسم من العينة المستخدمة (الشكل 4 أ). كانت الملون MSCs استخدام كالسين وتصويرها مجهر فلورية (الشكل 4 باء). تم تراكب الصور ثم (الشكل 4) لعرض موقع الخلايا المتزايد على سطح الورقة.

الشكل 1 . سير العمل العامة ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية. سير عمل نموذجي ديسيلولاريزيشن الأنسجة النباتية (والخطوات التحضيرية والغسيل العالمي)؛ (أ) أعلى المسار إلى أسفل الأسلوب القائم على المنظفات (ب) الخاصة بطريقة خالية من المنظفات. (ج) غير كاملة/فشل ديسيلولاريزيشن من نبات اكواتيكا P. استخدام الأسلوب القائم على المنظفات بسبب إزالة سابقة لأوانها من ديسيلولاريزيشن حمام (د) أضرار غير الأيونية الفاعل/بليتش من نبات hispida f. بسبب فترات طويلة حضانة في الحل التبييض ساخنة في أسلوب خال من المنظفات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . مقارنة بين الخواص الميكانيكية وفعالية ديسيلولاريزيشن بين الأساليب. يعني ± التنمية المستدامة؛ تم التحليل الإحصائي باستخدام اثنين--نموذج اختبار t و p القيم المدرجة فيها يعتد به إحصائيا (أقل من أو تساوي 0.05). نتائج مقارنة التجارب الميكانيكية بين اكواتيكا P. (أشرطة زرقاء المستخدمة للنهج القائم على المنظفات والأحمر خالية من المنظفات والأخضر لعينات غير المعالجة) وعينات من واو hispida (hispida ف. المستندة المنظفات n = 4، خالية من المنظفات n = 2؛ اكواتيكا P. المنظفات-قاعدة n = 3، خالية من المنظفات n = 4) سلالة أقصى المماس معامل التحويل (أم تي أم) (ب) (أ) في فشل (القوات المسلحة السودانية) (ج) وفي نهاية المطاف قوة الشد (إقليم اتحادي). (د) التحليل الكمي دسدنا تم تشغيلها في ثلاث نسخ على ثلاث عينات من كل مجموعة: غير المعالجة (ن الطازجة، = 3)، الأسلوب خالية من المنظفات (التبييض، n = 3) والأسلوب القائم على المنظفات (الحزب الديمقراطي الصربي، ن = 3)، قيم p للأسلوب ديسيلولاريزيشن مجموعة مقارنة بمجموعة عينة غير المعالجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . نتائج الفحص النشاط الأيضي مقارنة تأثير بين طريقتين ديسيلولاريزيشن. يعني ± التنمية المستدامة؛ تم التحليل الإحصائي باستخدام الاختبار t عينة اثنين و ف القيم المدرجة فيها معتدا به إحصائيا (أقل من أو تساوي 0.05). تم قياس النشاط الأيضي الخلوية حضور عينات الأنسجة اكواتيكا P. ونوع من أنواع غاركينيا (تطبيع لمراقبة الآبار بعينه لا يضاف) لعرض مقارنة أثر الاثنين الأيضية (A) أساليب ديسيلولاريزيشن (n = 3 لكل مجموعة) والمقارنة (ب) تأثير على النشاط الأيضي باستخدام اثنين الغسيل أساليب في البروتوكول على أساس المنظفات: المخزن المؤقت تريس-HCl (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5) جنبا إلى جنب مع "وسائل الإعلام الحرة المصل" (n = 4) مقابل منزوع ح ₂ O (n = 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . ديسيلولاريزيد الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) الذي ينمو على السطح نبات Ficus hispida ، فونكتيوناليزيد مع المتقارن دوبامين إدارات. نمت على أوراق hispida واو MSCs، ديسيلولاريزيد بطريقة خالية من المنظفات وفونكتيوناليزيد مع المتقارن إدارات-دوبامين (500 ميكرومتر مقياس تم إضافة أشرطة كمرجع) (A) مشرق حقل صورة لقسم من نبات ديسيلولاريزيد (ب ) صورة كالسين fluorescence الملون MSCs المتزايد على أوراق السطحية ممزوج (ج) مشرق الميدان والأسفار الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هنا، يتم وصف الأساليب اثنين ديسيلولاريزي الأنسجة النباتية. النتائج المعروضة هنا، مقترنة بنتائج الدراسات السابقة²⁵، تشير إلى أنه من المرجح طرح البروتوكولات تنطبق على طائفة واسعة من الأنواع النباتية، ويمكن أن يؤديها على السيقان والأوراق. هذه الإجراءات هي بسيطة ولا تتطلب معدات متخصصة، حيث يمكن القيام ديسيلولاريزيشن النباتية في معظم المختبرات. جدير بالذكر أنه بعد ديسيلولاريزيشن، يجب أن فونكتيوناليزيد السقالات لتسهيل انضمام خلايا الثدييات. ووصف الروغان مختلف التقنيات لتمكين التصاق خلايا الثدييات والنمو في مصنع الأنسجة قد تم في أماكن أخرى²⁵ ، وهي ليست الموضوع المخطوطة الحالية.

الخطوة النهائية في كلا البروتوكولين ديسيلولاريزيشن المقدمة هنا (الشكل 1) كان حاسما في نجاحها. عند القيام بأي من الطريقتين لا أوفيركروود الحمام كهذا سيؤدي تبادل غير متكافئ. يمكن تطبيق هذه الأساليب كلها أوراق الشجر وينبع؛ ومع ذلك، سيزيد هذا طول الفترة الزمنية المطلوبة لمسح عليها. تأكد من أن العينات مغمورة تماما للحفاظ على تطهير ثابتاً في العينة كاملة. ومن الناحية المثالية، يجب مسح ديسيلولاريزيشن الأنسجة النباتية للمسألة الأكثر الخلوية مع التقليل من الأضرار الهيكلية. ومن المرجح أن الأسلوب خالية من المنظفات يمكن تعديلها حسب الحاجة للعمل مع العينات المطلوب. ارتفاع درجات الحرارة حمام قد يؤدي مسح مرات أسرع، لكن قد يؤدي أيضا إلى مزيد من الأضرار العينات إذا كانوا المحتضنة الإفراط. درجات الحرارة المنخفضة قد تحتاج إلى وقت أطول للحضانة، وستكون مناسبة لعينات أكثر هشاشة. يمكن أيضا تغيير تركيز التبييض في الحل تسريع أو إبطاء عملية ديسيلولاريزيشن. عند اختبار عينات جديدة لاستخدامها مع أسلوب خال من المنظفات، فمن المستحسن البدء بفحص درجة حرارة حمام من 50-60 درجة مئوية بكثرة عن التقدم المحرز في ديسيلولاريزيشن (ومن الناحية المثالية كل 15-20 دقيقة) حتى أنها يتم مسح على نحو كاف. نطاق درجة الحرارة هذا كان جيد التحمل من معظم الأنواع النباتية التي تم اختبارها من خلال الاستغلال الأمثل للتقنية. عند الانتهاء، يمكن فحص العينات بصريا ويدويًا لضمان عدم الإفراط المحتضنة وأضرار لا يمكن إصلاحه كما أن الإشارة إلى تمزيق أو التفكك عند إزالة من الحمام. إظهار عينات المعدة باستخدام هذا النهج أثر إضعاف في نمو الخلايا (انظر الشكل 3 ألف) من النهج المستندة إلى مواد التنظيف بالغسيل فقط بواسطة H₂o. ومع ذلك، من المستحسن للمياه والصرف الصحي بالإضافة إلى ذلك مع HCl تريس (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5) ووسائل الإعلام الحرة المصل، خصوصا في التطبيقات الحساسة.

الأسلوب القائم على المنظفات (الحزب الديمقراطي الصربي) من المرجح تنطبق على معظم الأنواع النباتية، وهي مفيدة بشكل خاص لمسح ورقة كاملة وعينات حساسة لأنها تتطلب الحد الأدنى من الانفعالات الجسدية. وكما ذكر أعلاه، الخطوة الأخيرة حاسمة بالنسبة ديسيلولاريزيشن العينات. يمكن أن يتم مسح العينات مع الخصائص الفيزيائية المميزة عن طريق ضبط فترة الحضانة في الحمامات الفاعل غير الأيونية. عيب كبير من هذه العملية هو أن الأنسجة ديسيلولاريزيد قد تحتوي على آثار المنظفات المستخدمة، التي يمكن أن تؤثر في وقت لاحق نشاط الأيض الخلوية لخلايا الثدييات. ولذلك، يوصي باتخاذ الخطوات يغسل دقيقة قبل الاستخدام. هنا وجد أن عينات غسلها مع العازلة تريس-HCl (10 مم، الرقم الهيدروجيني 8.5) متبوعاً بوسائل الإعلام الحرة المصل بقاء الخلية أعلى من تلك التي تغسل بواسطة ح₂س قبل استعمالها (الشكل 3B).

عند تخزين العينات غير المعالجة لاستخدامها في المستقبل في أي من الطريقتين، من المهم رصد لهم عن الأضرار لضمان أن السقالات الناتجة سوف لا تتأثر. يمكن أن تظهر الأضرار تلون الأنسجة النباتية، فضلا عن هشاشة تكسير أو مفرطة عند التعامل معها. من المستحسن لرصد العينات على أساس أسبوعي للاستفادة منها من قبل أنها لم تعد مفيدة، وتحتاج إلى التخلص منها. بداية الأضرار تتراوح بين أنواع العينات، مع عينات قوية أكثر سمكا أطول أمداً.

بشكل عام، محطات تبشر كثيرا كمصدر محتمل للحيوية. هذا هو مدعومة بهياكلها معقدة بطبيعة الحال نمواً والخصائص التي تساعدهم على النمو في بيئاتها الأصلية. ويقترح الاستفادة الناجحة من الأنسجة النباتية السقالات هندسة الأنسجة بديل رخيص يحتمل أن تكون باهظة التكلفة، وغالباً ما يكون من الصعب تصميم، الحيوية. طبوغرافيا سطح الأنسجة النباتية، التي تختلف طبيعتها من نوع واحد إلى آخر، يمكن تسخيرها أيضا ل النمو الخلوي مكانياً التوجه المباشر²⁵. على سبيل المثال، أظهرت دراسة سابقة أن تستجيب الخلايا البشرية للإشارات الطوبوغرافية الحالية في²⁵من النباتات ديسيلولاريزيد، وبالتالي يمكن استخدام هذه السقالات للثقافة الخلايا في أنماط التنظيم²⁵. ميزة أخرى أن من المرغوب فيه في هندسة الأنسجة بيرفوسابيليتي دي نوفو . الأنسجة النباتية قد تطورت على مدى مئات الملايين من السنين لتكون فعالة للغاية في نقل السوائل، ويمكن أن تكون شبكات الأوعية الدموية perfused كفاءة²⁴. يمكن استخدام هذه الخاصية محتملة لتوجيه الهجرة الخلوية والأوعية مع الهدف النهائي المتمثل في إنشاء استبدال الأنسجة للتطبيقات السريرية. وهذا هو مدعومة بنتائج الدراسات السابقة التي أظهرت أن الحيوية مع المساحة السطحية العالية والمساميه مترابطة تؤدي إلى تكاثر الخلايا وعند زرعها في فيفو، تمكين الهجرة إلى الداخل للخلايا المضيفة إلى زرع^36،37،،من³⁸³⁹. المساحة السطحية العالية وسهولة اختراق مترابطة هي أيضا السمة المميزة للأنسجة النباتية^40،،من⁴¹⁴²، وهكذا السقالات المشتقة من النباتات لها القدرة على الاندماج مع الأنسجة المحيطة المجراة في. وعلاوة على ذلك، وجدت الدراسات الحديثة أن يترك ديسيلولاريزيد يمكن أن تكون perfused بنجاح مع خلايا²⁴ وأنه عندما كان المصنف الخلايا البشرية في الأنسجة النباتية ديسيلولاريزيد، أنها مطابقة لتلك الإشارات الطوبوغرافية²⁵. عندما اتخذت السقالات معا، والمشتقة من النباتات تمتلك الخصائص اللازمة تطبيقها بنجاح نحو الأنسجة التطبيقات الهندسية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.