यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए इंसुलिन व्यक्त 3 डी murine pancreatoids मुक्त-फ़्लोटिंग ई 10.5 असंबद्ध अग्नाशय progenitors और एसोसिएटेड mesenchyme से उत्पंन ।
अग्ंयाशय एक जटिल कई विभिंन प्रकार के सेल है कि एक साथ काम करने के लिए रक्त ग्लूकोज homeostasis और पाचन को विनियमित अंग बना है । इन सेल प्रकार एंजाइम स्रावित कोष्ठकी कोशिकाओं, पेट के लिए एंजाइमों की ढुलाई के लिए जिंमेदार एक arborized डक्टर प्रणाली, और हार्मोन का उत्पादन अंत में स्रावी कोशिकाओं शामिल हैं ।
अंत-स्रावी बीटा-कोशिकाओं शरीर में एकमात्र कोशिका प्रकार है कि रक्त शर्करा की मात्रा कम करने के लिए इंसुलिन का उत्पादन कर रहे हैं । मधुमेह, एक नुकसान या बीटा कोशिकाओं की शिथिलता की विशेषता रोग, महामारी अनुपात तक पहुंच रहा है । इस प्रकार, यह आवश्यक है कि बीटा सेल विकास की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए दवा और कोशिका आधारित चिकित्सकीय प्राप्त । हालांकि माउस के विकास की प्रायोगिक जांच जरूरी है, vivo में पढ़ाई श्रमसाध्य और समय लेने वाली है. कल्चरल सेल स्क्रीनिंग के लिए एक अधिक सुविधाजनक मंच प्रदान करते हैं; हालांकि, वे सेलुलर विविधता, वास्तु संगठन और सेलुलर बातचीत को बनाए रखने में असमर्थ है vivo में पाया । इस प्रकार, यह नए उपकरणों के विकास के लिए आवश्यक है अग्नाशय organogenesis और फिजियोलॉजी की जांच ।
अग्नाशय उपकला कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं को संगठित और जटिल, शारीरिक रूप से सक्षम वयस्क अंग में अंतर organogenesis की शुरुआत से mesenchyme के साथ निकट सहयोग में विकसित. अग्नाशय mesenchyme अंत में स्रावी विकास के लिए महत्वपूर्ण संकेत प्रदान करता है, जिनमें से कई अच्छी तरह से अभी तक समझ में नहीं हैं, इस प्रकार के दौरान दोहराऊंगा करने के लिए मुश्किल इन विट्रो संस्कृति. यहां, हम संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन तीन आयामी, सेलुलर जटिल माउस organoids कि mesenchyme बनाए रखने, pancreatoids । ई 10.5 murine अग्नाशय कली, असंबद्ध, और एक पाड़ मुक्त वातावरण में संस्कृति विदारक है । इन अस्थायी कोशिकाओं mesenchyme विकासशील pancreatoid और अंत में कोष्ठकी और वाहिनी कोशिकाओं के साथ विकासशील-स्रावी बीटा कोशिकाओं की एक मजबूत संख्या को घेर के साथ इकट्ठा स्व. इस प्रणाली के लिए सेल भाग्य निर्धारण, संरचनात्मक संगठन, और morphogenesis, सेल सेल बातचीत organogenesis के दौरान, या दवा, छोटे अणु, या आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Delineating सामांय विकास और शरीर विज्ञान के तंत्र को रोग एटियलजि समझ सर्वोपरि है और अंततः उपचार विधियों की खेती । जबकि संवर्धन और अंतर स्टेम कोशिकाओं के विकास के त्वरित और उच्च प्रवाह विश्लेषण में सक्षम बनाता है, यह ज्ञान के मौजूदा शरीर सेल भाग्य विनियमन और कृत्रिम रूप से एक अपेक्षाकृत में recapitulates विकास तंत्र के बारे में द्वारा सीमित है समरूप, दो आयामी स्थिति1,2। न केवल vivo बाह्य प्रभाव से प्रभावित विकास में है, आला और organogenesis गाइड करने के लिए paracrine संकेतों और संगठनात्मक समर्थन प्रदान वातावरण में विभिंन प्रकार के सेल के साथ, लेकिन इन कोशिकाओं के समारोह में भी उनके पर निर्भर करता है मार्गदर्शन के लिए परिवेश3,4,5। इन बाहरी संकेतों के महत्व को देखते हुए, विभेदक प्रोटोकॉल की सीमाओं, और vivo माउस मॉडल में की श्रमसाध्य प्रकृति, नई प्रणालियों के लिए प्रयोगात्मक विकास प्रक्रियाओं और फिजियोलॉजी की जांच करने के लिए आवश्यक हैं ।
प्रोटोकॉल के उद्भव के लिए तीन उत्पंन आयामी, जटिल organoids एक सुविधाजनक और अनुकूल प्रणाली का अध्ययन करने के लिए organogenesis, फिजियोलॉजी, दवा प्रभावकारिता प्रदान करता है, और यहां तक कि रोगजनन। विभिंन प्रणालियों के लिए murine organoids की स्थापना जैसे पेट6 और आंत7 organogenesis की हमारी समझ का विस्तार किया है, vivo में से कम प्रतिबंधों के साथ विकासात्मक जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान और इन विट्रो मॉडल । murine organoid गठन और मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के आगमन में इन अग्रिमों के कारण, मानव आंत्र8, रेटिना9, गुर्दे10,11, और सेरेब्रल12 organoids का उत्पादन किया गया है, और इस प्रदर्शनों की अध्यक्षता केवल मौजूदा विकास के तंत्र के बारे में ज्ञान द्वारा सीमित है ।
विशेष रुचि के अग्नाशय organoids की पीढ़ी है, रोगों के असंख्य के रूप में कोष्ठकी कोशिकाओं और नलिकाओं exocrine में अग्नाशय कमी13, अग्नाशयशोथ में कोष्ठकी कोशिकाओं सहित अलग अग्नाशय कोशिका प्रकार, प्लेग14, और डायबिटीज में बीटा कोशिकाएं15. इन विभिंन प्रकार के सेल के विकास के बारे में ज्ञान प्राप्त उनकी विकृति को समझने में सहायता कर सकता है और कर सकते हैं, भी, व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग या प्रत्यारोपण के लिए एक मंच के रूप में कार्य । इससे पहले, Greggio एट अल. murine अग्नाशय organoids बनाने के लिए एक विधि विकसित की है कि vivo morphogenesis में दोहराऊंगा और संगठित, तीन आयामी, जटिल संरचनाओं सभी प्रमुख अग्नाशय उपकला कोशिका से बना विकसित 16,17प्रकार । यह अग्नाशय के क्षेत्र में एक प्रमुख कदम आगे है, विशेष रूप से इन विट्रो में कोशिकाओं बनाने बीटा सेल विकास की जैविक जांच सक्षम कर सकते हैं । हालांकि, अंत में इस प्रोटोकॉल में गठित कोशिकाओं की कमी जब तक organoids ऊतक में प्रत्यारोपित किया गया, जहां आला बातचीत और अनुदेशात्मक cues17प्रदान कर सकता है । mesenchyme आला के सबसे बड़े हिस्से का गठन किया, भारी organogenesis के प्रारंभिक दौर से विकासशील उपकला ढंकना अंत में स्रावी फाड़ना और भेदभाव3सहित बाद के चरणों के लिए,4, 18. विकासशील अग्ंयाशय के साथ mesenchyme की बातचीत अभी तक बाह्य संकेतन और organogenesis का अध्ययन करने के लिए vivo सेलुलर जटिलता में बनाए रखने के महत्व का एक और उदाहरण है ।
यहां, हम का वर्णन कैसे तीन उत्पंन करने के लिए आयामी अग्नाशय organoids, pancreatoids, असंबद्ध e 10.5 murine अग्नाशय progenitors से, शब्द । इन pancreatoids को बनाए रखने के मूल mesenchyme, स्व-मुक्त अस्थायी स्थितियों में इकट्ठा, और अंत: स्रावी बीटा कोशिकाओं की एक मजबूत संख्या सहित सभी प्रमुख अग्नाशय कोशिका प्रकार, उत्पन्न19. यह दृष्टिकोण सबसे अच्छा अंत में स्रावी विकास के विश्लेषण के लिए अनुकूल है, पिछले प्रोटोकॉल के रूप में मजबूत अंत में अंतर विभेदक कमी. हालांकि, Greggio एट अल द्वारा वर्णित के रूप में अग्नाशय organoids के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग कर. बेहतर अग्नाशय उपकला शाखाओं और morphogenesis के विश्लेषण के लिए अनुकूल है, के रूप में शाखाओं में अधिक pancreatoids में सीमित है ।
सेल संस्कृति मॉडल की प्रगति ठीक से मॉडल विकास के लिए महत्वपूर्ण है, चिकित्सकीय प्रासंगिक सेल प्रकार, परीक्षण दवा प्रभावकारिता, या यहां तक कि रोगियों के लिए प्रत्यारोपण का उत्पादन । हालांकि, कृत्रिम रू…
The authors have nothing to disclose.
हम सहायक प्रोटोकॉल और पांडुलिपि के बारे में चर्चा के लिए Jolanta Chmielowiec धंयवाद । हम भी फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग के लिए बिंयामीन Arenkiel धंयवाद । इस कार्य को NIH (P30-DK079638 को M.B. और T32HL092332-13 को M.A.S. और M.B.), McNair मेडिकल फाउंडेशन (M.B. को), और फोकल कोर को बीसीएम बौद्धिक और विकासात्मक विकलांग अनुसंधान केंद्र (NIH U54 HD083092 से Eunice) द्वारा समर्थित किया गया कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान) ।
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
Isopropanol | Fisher | a4164 | |
Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
KCl | KaryoMax | 10575090 | |
KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |