Nous décrivons ici l’isolement de cellules gliales-entérique de la sous-muqueuse intestinale à l’aide des incubations EDTA séquentielles pour chélater les cations divalents, puis incubation dans une solution de récupération non enzymatique cellulaire. Placage de la suspension de cellules qui en résultent sur le poly-D-lysine et de la laminine se traduit par une culture fortement enrichie des cellules gliales sous-muqueux analyse fonctionnelle.
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Article de méthode
Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le système nerveux entérique (ENS) est constitué de neurones et les cellules gliales entériques (EGCs) qui résident dans la paroi musculaire lisse, la sous-muqueuse et la lamina propria. EGCs jouent un rôle important dans l’homéostasie intestinale grâce à la publication de divers facteurs trophiques et contribuent à l’intégrité de la barrière épithéliale. La plupart des études des cultures primaires de gliales entériques utilisent des cellules isolées de plexus myentérique après dissociation enzymatique. Ici, on décrit une méthode non enzymatique d’isoler et de la culture de EGCs de la sous-muqueuse intestinale et de la lamina propria. Après la suppression manuelle de la couche musculaire longitudinale, EGCs furent libérés de la lamina propria et de la sous-muqueuse en utilisant des incubations tampon HEPES EDTA séquentielles, suivies d’une incubation dans une solution de récupération disponibles dans le commerce non enzymatique cellulaire. Les incubations d’EDTA ne suffisaient pas à dépouiller la majeure partie de la muqueuse épithéliale de la lamina propria, permettant à la solution de récupération des cellules afin de libérer les sous-muqueuse EGCs. Toute résiduelle lamina propria et le muscle lisse a été écartée avec la glie myentériques. EGCs ont été facilement identifiés par leur capacité à exprimer la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP). Seulement environ 50 % de la suspension cellulaire contenaient GFAP + cellules après des incubations de tissu et avant la culture sur le substrat de poly-D-lysine/laminine. Toutefois, après 3 jours de culture de cellules de facteurs neurotrophiques cellule gliale (GDNF)-contenant des milieux de culture, la population de cellules adhérant aux plaques recouvertes de substrat composé de > 95 % glie entérique. Nous avons créé une lignée de souris hybride en croisant une souris hGFAP-Cre à la ligne de journaliste ROSA-tdTomato pour suivre le pourcentage de cellules GFAP + à l’aide de la fluorescence des cellules endogènes. Ainsi, non-myentérique glie entérique peut être isolé par des méthodes non enzymatiques et cultivée pendant au moins 5 jours.
Introduction
Intérêt pour la fonction des cellules gliales entériques (EGCs) a cessé d’augmenter en raison de leur rôle reconnu dans le tube digestif l’intégrité et l’homéostasie du1,2. En outre, EGCs varient selon leur emplacement le long du tractus GI3,4. EGCs libérer différents facteurs trophiques, y compris les facteurs neurotrophiques cellule gliale (GDNF), contribuent à gut motilité1,5 et répondre aux sous-produits microbienne6,7. Des études o....
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Protocole
Toutes les expériences animales décrites ont été approuvées par le Comité de l’Université du Michigan sur l’utilisation et l’entretien des animaux.
1. préparation des Solutions de laminine et de stériles de Poly-D-lysine (PDL)
- Au moins un jour avant l’isolement cellulaire, préparer des poly-D-lysine (PDL) et la laminine revêtue de plaques.
Remarque : Les plaques 6 puits tant de 12 puits ont été préparés selon les objectifs expérimentaux. En règle générale, les plaques de 12 puits étaient utilisées pour l’analyse quantitative des transferts western ; considérant que, en plaques 6 puits étaient utilisées pour conserver les autocl....
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Résultats
Preps étaient considérés comme infructueuses si GFAP + cellules n’ont pas adhérer et se propager dans les 24 heures (Figure 4 a). Le nombre de cellules gliales ne pourrait pas être déterminé qu’après 24 h, lorsque les cellules ont adhéré et montraient des signes de propagation en agrégats de plates (Figure 4 b). Cellules au bord des grappes ont tendance à étendre les processus longs et exprimé marqueurs gliales classiques, pa.......
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Discussion
EGCs jouent un rôle important dans l’homéostasie intestinale, et il est essentiel d’isoler et d’étudier in vitro. Dans ce protocole, une méthode simple pour isoler EGCs de la lamina propria de l’intestin de souris adultes a été introduite pour étudier la fonction gliale entérique.
Enlever le mésentère adhérente et LMMP avec un coton-tige prélève un échantillon de la glie inter-myentérique résidant entre les muscles longitudinaux et circulaires, augmente l’accessibilité des tampons à l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à souligner l’appui de DK045729 R37 (à JLM), AR060837 R01 (à HX) et l’Université du Michigan Gastrointestinal Research Center moléculaire Core P30 DK034933.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Poly-D lysine (1 mg/mL) | Sigma | A-003-E | Dilué 1:10 |
| Laminine (0,5 mg/mL) | Sigma | L4544 | Dilué à 10 & micro ; g/mL sur ICE |
| EDTA (0,5 M) | Lonza | 51201 | Diluer 1:100 dans DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Diluer 1:100 dans DPBS |
| Solution de récupération cellulaire | Corning | 354253 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 Thermo | Fisher Scientific | 11320033 | |
| Pénicilline-Streptomycine (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicine (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µ ; g stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (stock 200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Poulet anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Chèvre anti-a-Smooth Muscle Actin ; | Abcam | ab112022 | |
| Souris anti-Pgp9.5 ; | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Anti-Cadhérine pour chèvre ; | R& D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 ; | Abcam | ab34686 | |
| Souris p75 NTR ; | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Poulet IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Âne Anti-Chèvre IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Chèvre Anti-Souris IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Âne Anti-Lapin IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold anti-fade Réactif avec DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (amphotéricine B) 250 µ ; g/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Peptide de gastrin (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µ ; m) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Passoire en maille de nylon Celll (40 µ ; m) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Pipette sérologique jetable 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0,25 % Trypsine-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
Références
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gas....
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