Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.
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Article de méthode
Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La réparation de bris double-brin (CDB) dans l’ADN est un processus hautement coordonné, ce qui nécessite la formation et la résolution de plusieurs protéines de réparation complexes. Ce processus est réglé par une myriade de protéines qui promouvoir l’association et de dissociation des protéines à ces lésions. Grâce en grande partie à la capacité d’exécuter des écrans fonctionnels d’une vaste bibliothèque de protéines, il y a une plus grande appréciation des gènes nécessaires à la réparation de pause l’ADN double brin. Écrans souvent knock-out ou chimique inhibiteur identifient protéines impliquées dans le processus de réparation à l’aide de toxicité accrue comme marqueur pour une protéine qui est nécessaire pour la réparation de l’ORD. Bien qu’utile pour l’identification de nouvelles protéines cellulaires impliqués dans le maintien de fidélité du génome, analyse fonctionnelle exige la détermination de la question de savoir si la protéine d’intérêt favorise la localisation, formation ou résolution des réparations complexes.
L’accumulation des protéines de réparation peut être facilement détectée comme foyers nucléaires distinctes par microscopie d’immunofluorescence. Ainsi, association et dissociation de ces protéines dans les sites des lésions de l’ADN sont accessibles en observant ces foyers nucléaires à intervalles représentatifs après l’induction de cassures double brin de l’ADN. Cette approche peut également identifier des protéines de réparation mal localisées de facteur, si les défauts de réparation ne se produisent pas simultanément avec des retards incomplètes en réparation. Dans ce scénario, les cassures de l’ADN double brin longue durée peuvent être conçues en exprimant une endonucléase coupe rares (p. ex., I-SceI) dans les cellules où le site de reconnaissance pour l’enzyme ladite a été intégré dans le génome cellulaire. La lésion qui en résulte est particulièrement difficile à résoudre car réparation fidèle réintroduira site de reconnaissance de l’enzyme, ce qui incite une autre série de clivage. Ainsi, les différences dans la cinétique de réparation sont éliminés. Si la réparation complexes ne sont pas formés, localisation a été entravée. Ce protocole décrit la méthodologie nécessaire pour identifier les modifications dans la cinétique de la réparation ainsi que réparation localisation des protéines.
Introduction
Chaque jour, chaque cellule dans le corps humain est bombardé par un estimé 10 000 lésions de l’ADN1. Cette menace existentielle nous met en péril pour les mutations, oncogenèse comme cellule mort. Pour protéger la fidélité du génome, cellules de mammifères ont évolué pour répondre aux lésions de l’ADN avec une série complexe d’associations de protéines et de modifications. Cette réponse est constituée de multiples voies, collectivement connus comme l’ADN des dommages réponse (DDR)2,3. La DDR est constitué de l’accumulation des protéines de réparation de l’ADN à des lésions de l’ADN, co....
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Protocole
Veuillez noter que ce protocole est écrit pour U2OS cellules contenant un I-SceI reconnaissance site18. Les cellules ne sont pas nécessairement U2OS, mais doivent contenir le site I-SceI. Le protocole peut devoir être ajustée (p. ex., nombre de cellules ensemencées et temps d’incubation) selon le type de cellules utilisées.
1. la définition de la cinétique de la Formation d’un complexe réparation ORD
- La croissance de cellules U20S-DRGFP sur une plaque de culture de tissu de 10 cm jusqu'à 85-90 % confluentes.
- Retirez le support et laisser incuber à température ambiante (RT) dans 3 mL d’EDT....
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Résultats
La figure 1 illustre la sélection de la discrimination de bruit correct pour la quantification de maxima/foyers utilisant ImageJ. Les images fusionnées de DAPI et la réparation de protéine d’intérêt sont sur le panneau de gauche. Figure 1 a montre une discrimination de bruit de 90 et marque le nombre exact de foyers. Sur le bord (représenté par une flèche rose) et les foyers à l’extérieur des noyaux (représentés par une flèche ja.......
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Discussion
L’analyse de l’ADN endommagent la réparation en général et la réparation des cassures double brin de l’ADN est précisément un domaine actif de recherche parce que ses conséquences s’étendent de tumorigenèse biologie fondamentale6,20. Détails de ce manuscrit une approche qui dissèque avec précision l’apport de protéines RAD51 et γ-H2AX à la résolution des CDB par HR. hâte, cette méthode peut servir à élucider les fonctions supplémentaires de protéines de réparatio.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Joel Sanneman et Dr Philine Wangemann du noyau microscopie confocale, financé par la Kansas State University College of Veterinary Medicine, pour leur appui des efforts déployés pour développer cette technique. pCBASceI est un cadeau de Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. Les cellules U2OS DR-GFP ont été un gentil cadeau de Maria Jasin18.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lamelles de recouvrement de 12 mm | VWR | 89015-725 | |
| 16 % de paraformaldéhyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| Plaque à 24 puits | VWR | 82050-892 | |
| Plaque à fond en verre à 96 puits | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) ; | Plug-in Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats pour ImageJ | National Institute of Health (NIH) ; | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, haute teneur en glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Chèvre Anti-Lapin IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | ; A-11012 ; | |
| Peroxyde d’hydrogène | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| Logiciel ImageJ | Institut national de la santé (NIH) ; | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Vernis à ongles - Insta Dri | Sally et Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsine-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Réactif de transfection | TurboFect ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Références
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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Réimpressions et autorisations
