Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एंटीबॉडी का पता लगाना है कि एक सेल के साथ एंजाइम प्रतिस्थापन उपचार के सेलुलर को बेअसर परख आधारित

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/57777
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1BioMarin Pharmaceutical Inc

Summary

यहाँ हम एक कोशिका आधारित प्रवाह cytometry विधि बेअसर एंटीबॉडी या अन्य कारकों का पता लगाने के लिए कि एक मानव मैट्रिक्स में एंजाइम प्रतिस्थापन उपचारों के सेलुलर के साथ हस्तक्षेप, इस तरह के मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी के रूप में (सीएसएफ) या मानव सीरम.

Abstract

एंजाइम प्रतिस्थापन उपचार (ERTs) और रोगियों के लिए अन्य जीवविज्ञान चिकित्सा के प्रशासन एक विरोधी दवा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लाना हो सकता है. इन विरोधी दवा एंटीबॉडी (एडीए) के लक्षण वर्णन, विशेष रूप से उन है कि दवा की जैविक गतिविधि बेअसर हो सकता, एंटीबॉडी (नबस) बेअसर, है दवा पर इन एंटीबॉडी के प्रभाव को समझने में महत्वपूर्ण है औषधीय प्रोफ़ाइल । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सेल आधारित प्रवाह cytometry विधि कारकों का पता लगाने के लिए कि मानव मैट्रिक्स में एक प्रतिनिधि lysosomal ईआरटी के सेलुलर तेज बेअसर । प्रोटोकॉल तीन प्रक्रियाओं के होते हैं: स्क्रीनिंग, एक पुष्टि कदम है, और titer परख का पता लगाने के लिए, पहचान, और विषय के नमूनों में एंटीबॉडी titer बेअसर के सापेक्ष स्तर की स्थापना ।

इस विधि में, नमूने पहले fluorophore-संयुग्मित ईआरटी उत्पाद के साथ मिश्रित कर रहे हैं, तो कोशिकाओं के साथ मशीन [जैसे, मानव टी लिम्फोसाइटों (Jurkat कोशिकाओं)] है कि एक सेल-सतह कटियन-स्वतंत्र mannose 6 फॉस्फेट रिसेप्टर (CI-M6PR) एक्सप्रेस, और अंत में, एक प्रवाह cytometer के साथ विश्लेषण किया । नबस बिना एक नमूना ci-M6PR के माध्यम से fluorophore-संयुग्मित ईआरटी उत्पाद की अधिकता में परिणाम होगा, जबकि, नबस की उपस्थिति दवा के लिए बाध्य और सीआई-M6PR बाध्यकारी और के साथ हस्तक्षेप करेंगे । fluorophore की राशि-संयुग्मित Jurkat कोशिकाओं द्वारा आंतरिक ईआरटी प्रवाह cytometry द्वारा मापा जाता है और प्रतिशत के रूप में मूल्यांकन (%) संकेत निषेध एक प्रतिनिधि दवा की उपस्थिति में प्राप्त की प्रतिक्रिया की तुलना में-भोली मैट्रिक्स । पुष्टि कदम में, नमूनों पूर्व ईआरटी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ मशीन को चूस रहे है दवा विशिष्ट कारकों है कि (जैसे नबस के रूप में) कोशिकाओं के साथ एक मशीन से पहले दवा को बांध । नमूनों कि स्क्रीन और दवा की पुष्टि के लिए सकारात्मक परख में विशेष नबस तो धारावाहिक के लिए एक एंटीबॉडी titer उत्पंन पतला कर रहे हैं । अर्द्ध मात्रात्मक एंटीबॉडी titers दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता की माप के साथ संबद्ध किया जा सकता है ।

Introduction

Immunogenicity आकलन ERTs सहित किसी भी जीवविज्ञान चिकित्सकीय उत्पाद के लिए सुरक्षा और प्रभावकारिता निगरानी कार्यक्रम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है । रोगियों को एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि सीधे दवा सुरक्षा, प्रभावकारिता, और pharmacokinetic/pharmacodynamic प्रोफाइल प्रभाव कर सकते है विकसित हो सकता है । इन एडीए के एक सबसेट, नबस कहा जाता है, दो मायनों में ईआरटी प्रभावकारिता को बाधित कर सकते हैं: ईआरटी के निषेध के माध्यम से लक्षित सेल में या ईआरटी उत्प्रेरक गतिविधि बाधा द्वारा । विधि यहां प्रस्तुत नबस उपाय है कि कोशिकाओं में ईआरटी के साथ हस्तक्षेप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । पूरी तरह से सुरक्षा और चिकित्सीय ईआरटी की प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए, नबस की सतत निगरानी नैदानिक परिणाम या pharmacodynamic प्रभाव1के साथ किसी भी संभावित सहसंबंध elucidating में महत्वपूर्ण है.

प्रोटीन चिकित्सकीय के खिलाफ नबस के मूल्यांकन के लिए प्लेटफार्मों सेल आधारित, एंजाइमी गतिविधि और ligand-बाध्यकारी परख1शामिल हैं । इष्टतम परख मंच मानदंड की एक किस्म के आधार पर चयनित है: चिकित्सकीय उत्पाद की कार्रवाई की व्यवस्था, परख मंच संवेदनशीलता, selectivity, परिशुद्धता, और महत्वपूर्ण बात, इसकी क्षमता vivo में नबस के निरोधात्मक कार्रवाई की नकल करने के लिए . Ligand-बाध्यकारी परख कुछ मामलों में उपयुक्त हो सकता है (जैसे, जब एक प्रासंगिक सेल लाइन की पहचान नहीं की जा सकती है या यदि उचित संवेदनशीलता एक सेल में प्राप्त नहीं किया जा सकता है आधारित परख) । हालांकि, उद्योग दस्तावेज और अंय उद्योग के लिए २०१६ मसौदा एफडीए मार्गदर्शन में सफेद कागज स्वीकार किए जाते हैं, सेल आधारित पकड़ने की परख की सिफारिश कर रहे है क्योंकि वे बेहतर vivo1,2 में दवा के जैविक तंत्र को प्रतिबिंबित कर सकते है , 3.

एक प्रवाह cytometry कोशिका के विकास के लिए महत्वपूर्ण घटक-नब परख आधारित एक उपयुक्त सेल लाइन है कि दवा उत्तेजना, एक किराए की सकारात्मक नियंत्रण नब कि ईआरटी, एक fluorophore-संयुग्मित ईआरटी बेअसर, और परीक्षण प्रजातियों जैविक का जवाब शामिल मैट्रिक्स4,5,6। कक्ष लाइन चयन कार्रवाई के ईआरटी तंत्र पर निर्भर है और कई सेल लाइनों परख विकास3के दौरान मूल्यांकन किया जाना चाहिए । यहां वर्णित विधि में, मानव Jurkat टी कोशिकाओं उनके अंतर्जात CI-सेल सतह पर M6PR अभिव्यक्ति और एंटीबॉडी टुकड़ा रिसेप्टर्स (FcRs) है कि अंधाधुंध सबसे एंटीबॉडी7,8 के एफसी क्षेत्र बांध के अभाव के लिए चुना गया . परख विकास के दौरान, यह मांयता अध्ययन और रोगी नमूना परीक्षण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, ऐसे व्यक्तियों है कि परीक्षण के अनुच्छेद1के साथ इलाज नहीं किया गया है से परित के रूप में । सेल लाइनों भी गैर नैदानिक, नैदानिक, और दवा के विकास के बाद विपणन चरणों में निरंतरता के लिए विभिंन प्रजातियों से प्रासंगिक मैट्रिक्स बर्दाश्त1। एक अंय घटक है परख सकारात्मक नियंत्रण का चयन है । ईआरटी सेल के लिए सकारात्मक नियंत्रण परख अपने को चिकित्सीय बांध और CI के माध्यम से ले बेअसर-M6PR9,1की क्षमता के आधार पर चुना गया था । यह अक्सर एक परख नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए मानव विषयों से antisera बेअसर की उपयोगी या टिकाऊ मात्रा प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से दुर्लभ रोग रोगी आबादी2में । विकल्प हाइपर प्रतिरक्षित पशुओं, या अपनत्व से antisera शामिल-शुद्ध polyclonal या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी परख प्रासंगिक मैट्रिक्स1में नुकीला । एक प्रजाति-विशिष्ट मैट्रिक्स का उपयोग करते समय, यह संभव है कि मैट्रिक्स में मौजूद एंटीबॉडी के अलावा निरोधात्मक कारकों ईआरटी को बाधित कर सकते हैं । परख के एक अंय महत्वपूर्ण घटक fluorophore-संयुग्मित ईआरटी है । ईआरटी विकार के लिए fluorophore का चयन प्रत्येक ईआरटी के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए, चमक के लिए है परख की जरूरत पर आधारित, पीएच स्थिरता, और संभावित वर्णक्रमीय प्रवाह cytometer पर अंय चैनलों में ओवरलैप ।

परख यहां वर्णित एक ईआरटी के रूप में एक चिकित्सीय प्रोटीन को पकड़ने के लिए एक उदाहरण है, कि CI-M6PR के माध्यम से सेल में प्रवेश करती है । कई ERTs, lysosomal भंडारण विकारों (LSDs) के इलाज के लिए इरादा, सेल के लिए इस मार्ग का उपयोग और lysosomal लक्ष्यीकरण, elosulfase के लिए Morquio अल्फा सहित एक सिंड्रोम, cerliponase CLN2 रोग, बैटन के लिए agalsidase अल्फा Fabry रोग के लिए, और धूमधाम से रोग के लिए alglucosidase अल्फा10,11. इस पद्धति का उद्देश्य नबस के सापेक्ष स्तर को मापने के लिए है कि CI-M6PR के माध्यम से दवा बाध्यकारी और internalization के साथ हस्तक्षेप । यह tiered स्क्रीनिंग, पुष्टि, और titer चरण3में किया जाता है । नमूने पहले धनात्मकता को पकड़ने के लिए दिखलाई पड़ते हैं और फिर पुष्टि चरण में सकारात्मक की पुष्टि करते हैं. अंत में, नमूने है कि स्क्रीन और सकारात्मक पुष्टि करने के लिए एक एंटीबॉडी titer1उत्पंन करने के लिए पतला हो सकता है । इस कोशिका आधारित प्रवाह cytometry दवा को तेज परख प्रदान करता है एक संवेदनशील और mechanistically में प्रासंगिक इन इन विट्रो विधि दवा की विशिष्ट नबस है कि एक दवा औषधीय प्रोफ़ाइल को प्रभावित कर सकते हैं को मापने के । हम पहले विधि की पुष्टि की और दवा elosulfase अल्फा8के लिए इस मंच का उपयोग नैदानिक नमूनों का परीक्षण किया. यहां हम विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल है कि अंय चिकित्सीय प्रोटीन या ERTs के लिए लागू किया जा सकता है का वर्णन ।

Protocol

मानव मैट्रिक्स को उनके संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) से अनुमोदन के साथ वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा गया था लेकिन संभावित रूप से संक्रामक माना जाना चाहिए । सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला पर्यावरण का इस्तेमाल किया सुरक्षा की एक संस्कृति12रखता है ।

1. परख शुरू करने से पहले

  1. निर्माता के निर्देश के अनुसार ईआरटी-संयुग्मित streptavidin चुंबकीय मोतियों को तैयार करें13.
  2. गुणवत्ता नियंत्रण नमूने (QCs) तैयार: स्पाइक एक सकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी (पीसी) (जैसे, एक नब) प्रजातियों में विशिष्ट मैट्रिक्स (जैसे, परित सीएसएफ या सीरम) ।
    नोट: एफडीए और EMA मार्गदर्शन एक उच्च और परख सत्यापन और नियमित परीक्षण1,14के लिए एक कम QC की तैयारी की सिफारिश की ।
    1. उदाहरण के लिए, 10 µ g/ml पर एक QC प्राप्त करने के लिए, १,००० µ l की कुल मात्रा के लिए प्रासंगिक मैट्रिक्स (जैसे, सीएसएफ) के ९९० µ l में 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक सकारात्मक नियंत्रण के 10 µ l जोड़ें
    2. Aliquot एक एकल उपयोग (जैसे, ५० µ एल) के लिए उपयुक्त मात्रा में QC नमूनों की जांच करें और aliquots पर-६० करने के लिए-८० ° c1फ्रीज ।
    3. Aliquot एक कट-पॉइंट-कंट्रोल (CC), प्रजातियों-विशिष्ट मैट्रिक्स परीक्षण लेख (उदाहरणके लिए, परित सीएसएफ या सीरम) के साथ एक एकल उपयोग के लिए (जैसे, ५० µ l) और फ्रीज aliquots-६० करने के लिए-८० ° c1में इलाज नहीं है ।
  3. fluorophore और ईआरटी के बीच एक प्रोटीन-लेबलिंग किट का उपयोग करते हुए निर्माता के प्रोटोकॉल15के अनुसार एक विकार प्रतिक्रिया निष्पादित करें । Aliquot एक एकल उपयोग के लिए उपयुक्त मात्रा में नमूना (जैसे, ५० µ एल) और aliquots पर-६० करने के लिए-८० ° c फ्रीज ।

2. दिन 1: सेल चढ़ाना और नमूना तैयारी

  1. सेल प्लेट की तैयारी
    1. एक ऊतक संस्कृति हूड का प्रयोग करें और निंनलिखित चरणों के लिए एक अपूतित वातावरण बनाए रखने । स्प्रे प्रत्येक वस्तु है कि हुड में ७०% इथेनॉल के साथ रखा जाएगा और एक स्वच्छ पर्यावरण16,17,18बनाए रखने ।
    2. सेल विकास मध्यम (जैसे, RPMI-१६४० 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-streptomycin के साथ) एक पानी या मनका स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस19पर गर्म ।
    3. गिनती मानव टी लिम्फोसाइटों Jurkat कोशिकाओं और प्लेट १०० µ l प्रति अच्छी तरह से ७.५ x 105 कोशिकाओं/एमएल में एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे सेल संस्कृति एक प्रवाह cytometer एक प्लेट लोडर से सुसज्जित पर प्रयोग के लिए उपयुक्त थाली ।
      1. उदाहरण के लिए,20,21कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें ।
      2. यह सुनिश्चित करें कि प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं को कम से ७०% व्यवहार्यता है (जैसे, trypan नीले दाग के साथ व्यवहार्यता का आकलन)17।
    4. 5% CO2 और ९५% आर्द्रता के साथ एक ३७ ° c मशीन में कोशिकाओं को गर्मी 14 के लिए रात-20 एच ।
  2. स्क्रीनिंग सैंपल की तैयारी
    1. विषय या परख नियंत्रण सीरम मुक्त मीडिया (जैसे, RPMI-१६४०) के नमूनों का उपयोग कर पतला । यहां उदाहरण विधि में, नमूने पतला 1:2.5 RPMI-१६४० में ६० µ एल जोड़कर नमूने के ९० µ एल सीरम मुक्त मीडिया के लिए । (जैसे, 8 पट्टी ट्यूबों) । एक fluorophore-ईआरटी लेबल तैयार करने के लिए परख प्रक्रिया के लिए ३.१ कदम आगे बढ़ें ।
      नोट: 1 के कमजोर पड़ने: 2.5 प्रयोग निर्धारित किया गया था और यहां प्रस्तुत विधि के लिए इष्टतम है । इष्टतम नमूना कमजोरियां विकसित की है कि प्रत्येक विधि के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  3. पुष्टि मनका आणि नमुना वडा
    1. पुष्टि नमूनों के लिए आवश्यक ईआरटी-संयुग्मित मोतियों की संख्या की गणना ।
      1. उदाहरण के लिए, 10 नमूनों के लिए, ईआरटी-संयुग्मित मोतियों की 10 नमूने x १०० µ l का उपयोग करें + 30% अतिरिक्त धुलाई चरण के दौरान किसी भी नुकसान की भरपाई के लिए = १,३०० ईआरटी-संयुग्मित मोतियों की µ एल.
    2. भंवर मोती अच्छी तरह से । धोने के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए मोतियों की गणना की संख्या जोड़ें ।
    3. ईआरटी-संयुग्मित चुंबकीय मोती धो युग्मन बफर के १,३०० µ एल जोड़कर या के रूप में निर्माता द्वारा सुझाए गए (जैसे, ०.१% polysorbate 20 के साथ फॉस्फेट बफर खारा के साथ)13नीचे दिए गए चरणों का पालन ।
    4. भंवर ट्यूब अच्छी तरह से । 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय ट्यूब रैक में ट्यूब प्लेस । मोतियों को परेशान किए बिना, ध्यान से महाप्राण और supernatant को त्यागें.
      नोट: समाधान गहरे भूरे रंग से जब मोतियों चुंबक को खींच रहे है स्पष्ट करने के लिए बंद हो जाएगा ।
    5. १,३०० µ एल युग्मन बफर के साथ मोतियों resuspend । कुल चार धुल के लिए वॉश स्टेप्स को दोहराएं ।
    6. अंतिम धोने के बाद, युग्मन बफर के १,३०० µ एल में मोतियों को निलंबित (पहले चरण 2.3.1.1 में गणना) । जोड़ें १०० µ एल प्रति अच्छी तरह से एक ९६ के लिए-ठीक है, सफेद, गोल नीचे, गैर बाध्यकारी थाली के नक्शे के अनुसार प्लेट (जैसे, एक नमूना या QC प्रति अच्छी तरह से पुष्टि; नमूना डुप्लिकेट में विभाजित किया जाएगा जब fluorophore-लेबल ईआरटी के साथ मशीन) ।
    7. एक ९६ पर थाली प्लेस-अच्छी तरह से पक्ष-चुंबक स्कर्ट और मोतियों की अनुमति के लिए एक गोली फार्म । ध्यान से महाप्राण साफ supernatant और उसे त्याग दें ।
      नोट: समाधान के लिए गहरे भूरे रंग से बारी लगभग 1 के बाद स्पष्ट हो जाएगा-2 मिनट की ओर स्कर्ट-चुंबक पर । प्राप्त मोतियों को ' सूखी ' मोती कहा जाता है.
    8. यदि नमूने सकारात्मक दिखलाई और पुष्टि की जा रही है, के साथ एक नमूना के १०० µ l जोड़ें और बिना ईआरटी-संयुग्मित मोतियों में उपयुक्त/ एक प्लास्टिक की फिल्म के साथ प्लेट सील और यह लगभग ८०० rpm पर कमरे के तापमान (आरटी) में एक रोटरी शेखर पर कम से ६० मिनट के लिए हिला ।
      नोट: पहले से तैयार और जमे हुए सकारात्मक और नकारात्मक QCs और सीसी हर थाली पर शामिल किया जाना चाहिए ।
    9. इस मशीन के बाद, ९६ पर पुष्टि थाली जगह-अच्छी तरह से पक्ष-चुंबक स्कर्ट और मोतियों की अनुमति के लिए एक गोली फार्म ।
  4. Titer कमजोर पड़ने सीरीज की तैयारी
    1. titer श्रृंखला तैयार करने के लिए, प्रश्नपत्र में नमूना को पतला कर दिया गया है, जो कि पूर्व निर्धारित titer कट पॉइंट1को पार करने के लिए पर्याप्त संख्या में है ।
    2. उदाहरण के लिए, एक 1:3 कमजोर पड़ने की श्रृंखला में 8 कमजोर पड़ने के लिए (जैसे, 8 पट्टी ट्यूबों) pooled मैट्रिक्स के ६० µ एल के लिए नमूने के 30 µ एल मिश्रण । आगे बढ़ने के लिए परख प्रक्रिया के लिए ३.१ कदम fluorophore-लेबल ईआरटी तैयार करते हैं ।

3. दिन 1: परख प्रक्रिया

  1. fluorophore-लेबल्ड ईआरटी को सीरम-मुक्त माध्यम में तैयार करें (उदा., ६० µ l को प्रति well, या लगभग 6 मिलीलीटर/
    1. उदाहरण के लिए, 1 µ g/ml fluorophore-लेबल्ड ईआरटी के 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, 10 µ l का स्टॉक 1 मिलीग्राम/एमएल fluorophore-लेबल ईआरटी सीरम-मुक्त मीडिया (जैसे, RPMI-१६४०) के ९.९९ मिलीलीटर के लिए जोड़ें ।
  2. एक नई मशीन प्लेट में (जैसे, ९६-ठीक है, सफेद, गोल नीचे, गैर बाइंडिंग के लिए प्लेट), कदम से तैयार नमूनों जोड़ें २.२, २.३, या २.४ और एक fluorophore-लेबल्ड ईआरटी में एक 1:1 मिश्रण में डुप्लिकेट वेल्स (जैसे, स्थानांतरण ६० µ l प्रत्येक के तैयार नमूना और fluorophore के ६० µ एल जोड़ें-ईआरटी प्रति अच्छी तरह से लेबल) ।
    नोट: एक उदाहरण प्रयोग प्लेट मानचित्र चित्रा 1में प्रदान की जाती है ।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोग प्लेट लेआउट का उदाहरण । नमूनों और एक fluorophore-लेबल ईआरटी रात भर में 2-8 डिग्री सेल्सियस थे । उच्च गुणवत्ता नियंत्रण (HQC), कम गुणवत्ता नियंत्रण (LQC), और नकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण (NQC) के रूप में नियंत्रण प्लेट एकरूपता का आकलन करने के लिए प्लेट के विपरीत कोनों पर जांच की और पुष्टि की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. मिश्रण नमूने और fluorophore-pipetting द्वारा ईआरटी लेबल अप और एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ कई बार नीचे । पंनी में प्लेटें लपेटें और उंहें रात भर में 2-8 डिग्री सेल्सियस 14 के लिए-20 एच ।

4. Day 2: तैयार नमूनों को कोशिकाओं में जोड़ना

  1. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर मशीन से नमूना मशीन प्लेट (ओं) को हटा दें और उंहें एक मनका स्नान में 10 के लिए ३७ ° c-15 मिनट में रखकर प्लेटें गर्म ।
  2. सीओ2 मशीन से कोशिकाओं को हटा दें । मढ़वाया कोशिकाओं के एक दृश्य की जांच करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं स्वस्थ दिखाई देते हैं और समान रूप से कुओं में वितरित17,19.
  3. पहले से मिले नमूनों के १०० µ l को जोड़ें और प्रायोगिक प्लेट मैप के अनुसार एक सेल प्लेट के लिए fluorophore-लेबल ईआरटी.
  4. जोड़ा नमूनों के साथ सेल प्लेट प्लेस वापस ३७ डिग्री सेल्सियस में सह2 मशीन में । 3 एच और ± 15 मिनट के लिए थाली मशीन ।
    नोट: इस बार प्रयोगशाला में सिग्नल के लिए इष्टतम के रूप में स्थापित किया गया था-परख में शोर प्रतिक्रिया ।
  5. 14-18 डिग्री सेल्सियस पर एक तालिका में ३२० x g पर 6 मिनट के लिए सेल प्लेट केंद्रापसारक । प्लेट कुओं के तल पर एक सेल गोली की उपस्थिति की पुष्टि करें ।
  6. एक 30-45 ° कोण पर थाली पकड़ो । ध्यान से एक अच्छी तरह से सेल गोली परेशान बिना supernatant निकालें । एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को पुनर्स्थगित करने में सेल गोली पर 1x DPBS के २०० µ एल जोड़ें ।
  7. कुल 3 धुल के लिए सेल वॉशिंग स्टेप्स को दोहराएं । सेल की व्यवहार्यता धुंधला के लिए 5 कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें ।

5. दिन 2: सेल व्यवहार्यता धुंधला

  1. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, १०० µ एल का एक काम समाधान के जोड़ने 1x लाइव/मृत दाग के लिए एक अच्छी तरह से, एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए चुना से अलग fluorophore-लेबल ईआरटी और निर्माता के निर्देश के अनुसार तैयार22।
  2. अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए थाली मशीन । 14-18 डिग्री सेल्सियस पर एक तालिका में ३२० x g पर 6 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक ।
  3. ध्यान से एक अच्छी तरह से सेल गोली परेशान बिना supernatant निकालें । 1x DPBS के साथ सेल 1x धो लें ।

6. Day 2:1% Paraformaldehyde के साथ सेल फिक्सिंग

  1. एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, (2-8 डिग्री सेल्सियस से कम) 1% paraformaldehyde (पीएफए) एक अच्छी तरह से ठंडा के १०० µ एल बांटना ।
  2. प्लेटें सील और मिश्रण करने के लिए धीरे पल्स भंवर । पन्नी में प्लेट लपेटें और यह कम से कम 10 मिनट के लिए निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर जगह है ।
    नोट: प्लेट सील पर छप से बचने के लिए सावधान रहें ।
  3. एक अच्छी तरह से विश्लेषण करने से पहले ऊपर और नीचे पिपेट एक मल्टीचैनल का उपयोग में 1x DPBS के ५० µ एल जोड़ें ।

7. फ्लो Cytometry

  1. प्लेट लोडर के साथ प्रवाह cytometer पर प्लेटें रखें और उंहें चलाते हैं ।
  2. अधिग्रहण और रिकार्ड मापा माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: लोडर सेटिंग्स के लिए एक उदाहरण के रूप में चित्र 2 देखें । नमूना प्रवाह दर, नमूना मात्रा, मिश्रण मात्रा, मिश्रण की गति, और घोला जा सकता है की संख्या इस परख के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । इन मानदंडों को "तीर ऊपर" या "नीचे" प्रत्येक कसौटी के लिए संख्या के बगल में बटन का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है, प्रवाह cytometry अधिग्रहण सॉफ्टवेयर23पर निर्भर करता है ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो cytometer लोडर सेटिंग्स का उदाहरण । लोडर सेटिंग्स विकसित की है कि प्रत्येक परख के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. चित्र 3में दर्शाए अनुसार cytometer विश्लेषण/गेट्स/भूखंड बनाएं ।
    नोट: गेट निर्माण और आवेदन प्रत्येक प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर23के लिए अलग हो सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति । Jurkat कोशिकाओं को कुल घटनाओं से अलग किया गया और आगे-तितर बितर (FSC) बनाम साइड-कैटर (SSC) चैनल की साजिश रचने और लक्ष्य जनसंख्या के आसपास एक गेट ड्राइंग द्वारा एकत्र की । Singlets (एकल कक्ष) FSC क्षेत्र (FSC-A) और FSC ऊँचाई (FSC-H) चैनल का उपयोग करके दोहरी या बड़ा कक्ष समुच्चय से पृथक किए गए थे. लाइव कोशिकाओं गेटिंग द्वारा स्वेटर कोशिकाओं पर एक व्यवहार्यता दाग के लिए नकारात्मक चुना गया । माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) एकल, लाइव Jurkat कोशिकाओं में मापा गया था और एक हिस्टोग्राम के रूप में रची गई है । दवा के साथ कोशिकाओं के MFI मूल्यों को बंद कर दिया (जैसे, HQC) और ऊपर की नियंत्रण मात्रा के साथ कोशिकाओं के (लाल और नीले, क्रमशः) दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. विश्लेषण और रिकॉर्ड लगभग १०,००० घटनाओं23से मृत कोशिकाओं को शामिल न करें ।

8. डेटा विश्लेषण

  1. निर्यात डेटा (रॉ MFI) विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: विश्लेषण की आवश्यकता के आधार पर, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके निंन डेटा विश्लेषण किया जा सकता है ।
  2. डुप्लिकेट वेल्स (QCs और नमूनों) के माध्य MFI की गणना और भिन्नता के गुणांक (% CV) मतलब से डुप्लिकेट की प्रसार परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए.
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
  3. नमूनों और QCs कि परख में जांच के लिए, प्रतिशत संकेत निषेध (% SI) के सापेक्ष MFI के लिए QCs pooled मैट्रिक्स सीसी की गणना ।
    Equation 4
  4. यदि आवश्यक हो, तो पुनर्प्राप्ति अनुपात (आरआरएस) की पुष्टि QCs और संबंधित स्क्रीन मानों के सापेक्ष नमूनों के लिए परिकलित करें ।
    Equation 5

Representative Results

विधि के पहले दिन Jurkat कोशिकाओं के एक जमे हुए aliquot गल और चढ़ाया गया था, और परीक्षण के नमूने तैयार किए गए थे । चित्रा 1 एक उदाहरण प्लेट मानचित्र से पता चलता है. दूसरे दिन, नमूनों Jurkat कोशिकाओं के साथ मिश्रित और लगभग 3 एच और 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन थे । कोशिकाओं तो धोया, पीएफए के साथ तय की, और एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण किया गया । चित्रा 2 उदाहरण प्रवाह cytometer सेटिंग्स दिखाता है ।

फ्लो cytometry गेटिंग स्ट्रैटेजी के अनुसार लाइव सिंगल Jurkat कोशिकाओं24 (चित्रा 3) में fluorophore-संयुग्मित ड्रग की मात्रा को मापने के लिए डिजाइन किया गया था । कोशिकाओं को मलबे से अलग कर दिया गया है कि एक फाटक है कि सेलुलर मलबे शामिल नहीं [आमतौर पर, कम आगे तितर बितर (FSC)] और मृत कोशिकाओं [आमतौर पर, उच्च साइड कैटर (एसएससी)], केवल25विश्लेषण के लिए जीवित कोशिकाओं को छोड़कर । एकल कक्ष तो उच्च FSC क्षेत्र और कम FSC ऊंचाई26शामिल है एक गेट ड्राइंग द्वारा सेल क्लस्टर से अलग किया गया । कोशिकाओं एक व्यवहार्यता दाग है कि एक बरकरार झिल्ली के बिना किसी भी मृत या अस्वस्थ कोशिकाओं लेबल के साथ इलाज किया गया, और एक अतिरिक्त फाटक मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए बनाया गया था22. लाइव एकल कोशिकाओं के MFI fluorophore-संयुग्मित ईआरटी के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था । संभावित जांच परख परिणामों का एक उदाहरण के रूप में, मैट्रिक्स किराए विरोधी दवा एंटीबॉडी सकारात्मक नियंत्रण की एक उच्च राशि के साथ नुकीला [जैसे, उच्च गुणवत्ता नियंत्रण (HQC)] हिचक fluorophore-संयुग्मित ईआरटी तेज, एक कम MFI में जिसके परिणामस्वरूप लगभग ३०० (चित्रा 3) । इसके विपरीत, कोशिकाओं सकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी के अभाव में मैट्रिक्स के साथ मशीन एक उच्च mfi ( 3 चित्रमें mfi = ३७,८३०) होना चाहिए, fluorophore-संयुग्मित ईआरटी की अधिकता का प्रदर्शन ।

यहां उदाहरण के लिए बेअसर सकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी दवा की कार्रवाई के तंत्र के आधार पर चयन किया गया था (यानी, CI के माध्यम से ईआरटी-M6PR) । fluorophores का एक पैनल भी परीक्षण किया गया था और इष्टतम परख संवेदनशीलता और गतिशील रेंज1के लिए तुलना में । CypHer 5e एक अंलीय पीएच, जो दवा27के lysosomal लक्ष्यीकरण के एक अतिरिक्त उपाय के रूप में कुछ ERTs के लिए प्रासंगिक हो सकता है पर अपनी वृद्धि की प्रतिदीप्ति के कारण परीक्षण किया गया । एक हरी फ्लोरोसेंट डाई (जैसे, alexa Fluor ४८८), और एक दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई (जैसे, alexa Fluor ६४७) भी जांच की गई । कैसे अलग fluorophores प्रदर्शन हो सकता है का एक उदाहरण चित्रा 4a और 4bमें प्रस्तुत किया है । उदाहरण में, Alexa Fluor ६४७ ईआरटी सबसे अच्छा अपने बेहतर संवेदनशीलता के कारण प्रदर्शन किया था (उदाहरणके लिए, सबसे कम पीसी एकाग्रता में सबसे अधिक% SI) और वाइड गतिशील रेंज (परिमाण के ~ 3 आदेश) ।

Figure 4
चित्रा 4: उदाहरण के विभिन्न fluorophore से परिणाम-ईआरटी conjugates. (एक) परख विकास के दौरान, एक सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) कमजोर पड़ने वक्र अलग fluorophore-संयुग्मित ERTs का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए । यहां दिखाए गए उदाहरण में, दो fluorophore-संयुग्मित ERTs (alexa Fluor ४८८ और CypHer 5e) पर ६.२५ µ g/एमएल और एक उज्जवल fluorophore-संयुग्मित ईआरटी (Alexa Fluor ६४७) १.५६ µ g/ml पर सकारात्मक नियंत्रण नबस की सांद्रता बढ़ाने की उपस्थिति में परीक्षण किया गया । (ख) इस पैनल के पैनल से घटता एक ग्राफ से पता चलता है, MFI का उपयोग कर गतिशील रेंज में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाने के लिए एक Alexa Fluor ६४७-संयुग्मित ईआरटी का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

वर्णित विधि का पता लगाने, पुष्टि के लिए एक tiered दृष्टिकोण है, और interpolating के एक अर्ध मात्रात्मक स्तर titer3। परख स्थापित करने के लिए सत्यापन के लिए तैयार है, परख संवेदनशीलता, परिशुद्धता, selectivity, विशिष्टता, औषध सहिष्णुता, मजबूती सहित मापदंडों, और कटौती अंक स्थापित मार्गदर्शन के अनुसार मूल्यांकन किया जाना चाहिए1,3 .

नमूने इस परख में संभावित सकारात्मक माना जाता है जब% SI मान स्क्रीनिंग कट प्वाइंट (एससीपी) से अधिक प्राप्त किए गए थे । एससीपी एक प्रतिनिधि जनसंख्या से दवा भोले के नमूने परीक्षण द्वारा सांख्यिकीय निर्धारित किया गया था और संकेत तीव्रता (एसआई)3में एक रिश्तेदार कमी को मापने. मार्गदर्शन (एफडीए के उदाहरण के लिए) अनुशंसा करते हैं कि एससीपी सामान्य रूप से वितरित डेटा सेट के ९५वें शतमक पर स्थापित किया गया है, और एससीपी की गणना करने के लिए तरीके कहीं विस्तार से वर्णित किया गया है1. किसी भी नमूना है कि परख संकेत (% si में वृद्धि के रूप में मापा) पर या एससीपी के ऊपर संभावित सकारात्मक होना निर्धारित किया गया था, और परिणाम के साथ एससीपी (कोई परिवर्तन या% SI में कमी के साथ) से अधिक नमूने नकारात्मक माना जाता है ।

नमूने है कि (एससीपी ऊपर% SI) सकारात्मक दिखलाई पुष्टि परख में परीक्षण के लिए ईआरटी नबस की विशिष्टता निर्धारित किया गया । पुष्टि परख ईआरटी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ पूर्व के नमूनों की मशीन द्वारा प्रदर्शन के लिए दवा विशिष्ट एंटीबॉडी या निरोधात्मक कारकों को दूर किया गया । आरआर (पुष्टि mfi के अनुपात को स्क्रीनिंग mfi) नमूना से निकाल दिया नबस की संख्या निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया गया था. एक आरआर धनात्मकता की गणना की दहलीज से अधिक [यानी, पुष्टि कट प्वाइंट (सीसीपी)] विरोधी दवा नबस की उपस्थिति का संकेत दिया । स्क्रीनिंग परख के रूप में, सीसीपी पहले पुष्टि परख में एक प्रतिनिधि आबादी से उपचार-भोली नमूनों का मूल्यांकन द्वारा स्थापित किया जाना चाहिए । सीसीपी एक सांख्यिकीय निर्धारित 1% झूठी सकारात्मक दर पर आधारित था और दहलीज एक सकारात्मक पुष्टि नमूना (चित्रा 5)3नामित किया गया था ।

नमूनों की जांच की है कि और सकारात्मक प्रश्नपत्र पतला और titer परख में परीक्षण के लिए रिश्तेदार स्तर या प्रत्येक नमूने में नबस के titer निर्धारित थे । उच्चतम कमजोर पड़ने पर एक नमूना परीक्षण सकारात्मक जब यह एक निर्दिष्ट दहलीज पार [उदाहरण के लिए, titer कट प्वाइंट (TCP)] नमूना titer (चित्रा 5)1,3है ।

Figure 5
चित्र 5: नमूना परीक्षण परिणाम उदाहरण । इन पैनलों नमूनों कि सकारात्मक या नकारात्मक परीक्षण या तो ऊपर या नीचे १७.५१% SI की एक एससीपी से नीचे की जांच के उदाहरण दिखाते हैं । सकारात्मक नमूनों तो पुष्टि परख में परीक्षण किया गया दवा-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का प्रयोग परख में परीक्षण करने से पहले नमूनों से दवा विशिष्ट एंटीबॉडी चूस । एक वसूली अनुपात (आरआर) पुष्टि कटौती बिंदु (यानी, आरआर = १.३१५) से अधिक के साथ नमूने सकारात्मक पुष्टि करने के लिए माना जाता था । नमूनों की पुष्टि की है कि सकारात्मक जब तक संकेत titer कट पॉइंट (TCP) को पार कर titer (कमजोर पड़ने वाले कारक) जो नमूना परिणाम titer कट बिंदु के बराबर है स्थापित करने के लिए पतला थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

परख दोहराव और परिवर्तनशीलता कई दिनों से अधिक और एक से अधिक विश्लेषक के साथ परीक्षण किया गया । QCs शुरू में एक बैच और उप में तैयार 1x उपयोग के लिए aliquoted थे । 3 डी के पाठ्यक्रम पर, दो विश्लेषकों QCs के कई सेट के साथ परख प्रदर्शन के लिए परख की परिशुद्धता प्रदर्शन । उदाहरण के आंकड़ों में दिखाया गया है, QCs के लिए इंटर और अंतर-परख परिशुद्धता के% cv% cv < 20% (चित्रा 6)1के एफडीए गाइडेंस की सिफारिश से कम हैं ।

Figure 6
चित्र 6: दो विश्लेषकों के साथ तीन दिन में निर्मित QC परिशुद्धता डेटा का उदाहरण । परिशुद्धता डेटा प्रसरण एट अल में प्रस्तुत फार्मूले का उपयोग कर (ANOVA) के एक विश्लेषण द्वारा गणना की गई । 28. इंट्रा बैच (रन के भीतर) और अंतर-बैच (रन के बीच) आंकड़े% CV के रूप में सूचित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एंटीबॉडी या अन्य कारकों है कि CI-M6PR के माध्यम से ईआरटी को रोकने को निष्क्रिय ईआरटी सुरक्षा या प्रभावकारिता1प्रभाव की क्षमता है. इसलिए, यह एक मजबूत कार्रवाई की दवा तंत्र के लिए प्रासंगिक मॉडल का उपयोग कर विषय नमूनों में नबस का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम और दूसरों ने पाया है कि कुछ परख प्रारूपों के प्रदर्शन (जैसे, रिसेप्टर dimerization, luciferase अभिव्यक्ति, आदि) परख परिशुद्धता, reproducibility के लिए स्वास्थ्य प्राधिकरण सिफारिशों के साथ संरेखित नहीं है, और संवेदनशीलता 29. परख विधि में यहां वर्णित है, Jurkat कोशिकाओं है कि अंतर्जात CI-M6PR एक्सप्रेस को नबस lysosomal ईआरटी के लिए विशिष्ट निगरानी कार्यरत हैं । एक प्रवाह cytometry readout के साथ संयुक्त, इस परख उपयुक्त परख परिशुद्धता, संवेदनशीलता, reproducibility, और उच्च नमूना प्रवाह के साथ एक शारीरिक सेल मॉडल का उपयोग करता है । एक प्रवाह के साथ नब पता लगाने cytometry readout भी अन्य संकेतों के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, हेपेटाइटिस ई और adeno से जुड़े वायरस (AAV)30,31के खिलाफ पूर्व मौजूदा एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त fluorophore चयन शामिल है, एक LQC है कि परख संवेदनशीलता पर नज़र रखता है शामिल है, सेल व्यवहार्यता के एक पर्याप्त स्तर को सुनिश्चित करने, और गर्मी के समय के लिए सख्त पालन बनाए रखने । यहां प्रस्तुत उदाहरण में, fluorophores (जैसे, alexa Fluor ४८८, alexa Fluor ६४७, और CypHer 5e), एक संयुग्मित lysosomal को ईआरटी, व्यापक रूप से उनके प्रदर्शन में विविध । Alexa Fluor ६४७, जो भी प्रतिभाशाली fluorophore३२परीक्षण किया गया था, आगे परख विकास के लिए चुना गया था । हम अनुशंसा करते हैं कि कई fluorophores पर जल्दी मूल्यांकन किया जा परख के विकास में सबसे अच्छा संवेदनशीलता और गतिशील रेंज प्रदान करने के लिए. नमूना परीक्षण के दौरान परख संवेदनशीलता एक LQC कि संवेदनशीलता सीमा के लिए पर्याप्त है कि यह परीक्षण के 1% में विफल हो जाएगा सहित द्वारा निगरानी की जानी चाहिए1रन । HQC के साथ साथ, LQC भी एक प्रणाली उपयुक्तता QC के रूप में कार्य करता है के लिए समय3पर परख बहाव की निगरानी । इष्टतम सेल व्यवहार्यता और प्रदर्शन एकल उपयोग aliquots के एक सेल बैंक तैयार करने और नए सेल बैंकों में तुलनीय QC परिणाम3,18के आधार पर अर्हता प्राप्त की है । सेल और fluorophore-संयुग्मित दवा मशीन बार भी एक लगातार परख प्रदर्शन के लिए केंद्रीय समय दवा कोशिकाओं के साथ मशीन है की मात्रा के साथ बढ़ जाती है के बाद से कर रहे हैं । दवा के साथ-साथ दिन में दिन में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, नमूना डेटा प्रत्येक प्लेट पर परित मैट्रिक्स नियंत्रण नमूने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है (जैसे, ऊपर विधि में कटौती बिंदु नियंत्रण नमूने). इस विधि के साथ सुसंगत डेटा के उत्पादन में एक और महत्वपूर्ण कारक प्लेट एकरूपता की निगरानी और संभव बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए है । एक प्रारंभिक प्रयोग परख पूरी थाली में एक एकल QC का उपयोग कर प्रदर्शन शामिल हो सकते हैं, जबकि अधिक मजबूत प्रयोगों परख सत्यापन के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है (जैसे, परिशुद्धता और सटीकता)1। यह थाली नक्शा लेआउट३३के महत्व को दर्शाता है । प्लेट मानचित्र उदाहरण में दिखाया गया है, गुणवत्ता नियंत्रण प्लेट के दोनों किनारों पर रखा नमूने एक एकरूपता है कि Levey-Jennings चार्ट३४के साथ समय पर नज़र रखी जा सकती है ।

हालांकि इस परख नबस और अंय कारकों है कि lysosomal ईआरटी को बाधित कर सकते है पर नज़र रखता है, अतिरिक्त प्रयोगों के लिए एक ले एंटीबॉडी के कारण संकोच की पुष्टि आयोजित किया जा सकता है । एक विकल्प के लिए प्रोटीन के साथ नमूनों का इलाज है A/G/L, जो गैर-विशेष रूप से immunoglobulin३५बांधता है । यदि नमूने के बाद सकारात्मक परीक्षण के लिए जारी रखें प्रोटीन a/G/L कमी, एक गैर-एंटीबॉडी निरोधात्मक कारक दवा को रोकने के लिए जिम्मेदार हो सकता है. विधि यहां वर्णित एंटीबॉडी-मध्यस्थता तेज निषेध को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और सकारात्मक नियंत्रण और अन्य परख पैरामीटर यदि गैर-एंटीबॉडी निरोधात्मक कारकों के साथ विषय नमूनों की एक उच्च प्रतिशत पाया जाता है पर पुनर्विचार किया जाना चाहिए.

परख भी आगे fluorophore का प्रदर्शन करने के लिए विशेषता हो सकती है-कार्रवाई की दवा तंत्र के आधार पर उचित सेलुलर डिब्बे के लिए दवा यातायात लेबल । यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, एक ईआरटी को सीआई-M6PR को कोशिका की सतह पर बाँधने की आशा है और यह lysosome को यातायात. हम पहले से संकेत है कि लगभग फ्लोरोसेंट संकेत के सभी fluorophore से विधि परिणामों में मनाया-lysosome8में ईआरटी लेबल कई प्रयोगों के परिणामों की सूचना दी । हमने पाया है कि fluorophore-ईआरटी संकेत लेबल cytochalasin बी, जो actin पुनर्गठन के निषेध के माध्यम से internalization बाधित के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद समाप्त किया गया था । इसके अलावा, प्रयोग है कि trypan नीले रंग के साथ बाहरी fluorophore बुझती है, या 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखकर internalization धीमा, संकेत मिलता है कि fluorophore-लेबल ईआरटी तेजी से आंतरिक है और बहुत कम प्रतिदीप्ति एक ईआरटी के कारण है सेल सतह पर बंधे । Lysosomal लक्ष्यीकरण की पुष्टि की सह-स्थानीयकरण के साथ पीएच के संवेदनशील lysotracker डाई fluorophore-संयुग्मित दवा का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ. CI-M6PR के माध्यम से ऊपर उठाने के लिए एक विशिष्टता भी रिसेप्टर बाइंडिंग के लिए लेबल दवाओं के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए exogenous M6P का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है. इसी तरह के प्रयोगों को अन्य परख में fluorophore-संयुग्मित दवाओं के कैनेटीक्स और सेलुलर स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए ।

इस सेल-परख मंच आधारित चिकित्सीय दवाओं है कि CI-M6PR रिसेप्टर endocytosis मध्यस्थता का उपयोग करने के लिए नबस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हम हाल ही में इस परख मंच है कि elosulfase अल्फा३६,३७के लिए एक पकड़ने और दवा प्रभावकारिता के विकास के बीच कोई संबंध का प्रदर्शन का उपयोग कर परिणाम की सूचना दी । नैदानिक नमूना परीक्षण के लिए परख मांय करने के लिए, पैरामीटर, परख संवेदनशीलता सहित, परिशुद्धता, selectivity, विशिष्टता, दवा सहिष्णुता, मजबूती, और कटौती अंक, स्थापित मार्गदर्शन3 के अनुसार मूल्यांकन किया जाना चाहिए, 4. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए, lysosomal ERTs के लिए, कि नबस एंजाइम उत्प्रेरक साइट के पास बाध्यकारी के माध्यम से दवा गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करने की क्षमता के साथ विकसित कर सकते हैं । सामांय में, हम lysosome के कठोर अंलीय और proteolytic पर्यावरण के बाद से एक कम प्राथमिकता का होना करने के लिए इस प्रकार की निगरानी पर विचार एंटीबॉडी-ईआरटी2,३९,४०बातचीत करने के लिए अनुकूल नहीं है । हालांकि, यह संभव है कि proteolytic प्रतिरोधी नबस मौजूद है और एक दवा४०के उत्प्रेरक भाग को बाधित कर सकते हैं । इस परख fluorophore पर नज़र रखता है-ईआरटी lysosome को ले लेबल, और परख की सीमा proteolytic-प्रतिरोधी नबस की निगरानी करने में असमर्थता है । यदि इस प्रकार की नब सुरक्षा या प्रभावकारिता डेटा पर आधारित संदिग्ध है, एक परख है कि ईआरटी गतिविधि पर नज़र रखता है विकसित किया जाना चाहिए और नमूनों का परीक्षण किया ।

immunogenicity का आकलन औषध सुरक्षा और प्रभावकारिता पर नबस के प्रभाव को समझने में महत्वपूर्ण है. नबस की पहचान इन विट्रो दवा पर बाधा के माध्यम से CI-M6PR में सक्षम करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है vivo मेंपकड़ने गतिविधि को समझने के लिए । विधि यहां प्रस्तुत एक मानव कोशिका रेखा है कि CI-M6PR व्यक्त fluorophore-संयुग्मित lysosomal ईआरटी सेलुलर के हस्तक्षेप को मापने के लिए उपयोग करता है । इस विधि पहले से ही कई lysosomal भंडारण रोगों के इलाज के लिए इरादा ERTs के लिए नबस निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस परख मंच जीवविज्ञान चिकित्सकीय कि उनके उचित समारोह के लिए एक सेलुलर internalization की आवश्यकता पर नबस के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अंय तरीकों पर लागू हो सकता है ।

Disclosures

लेखक कर्मचारी और मारिन फार्मास्युटिकल इंक के शेयरधारकों हैं

Acknowledgments

लेखकों की कोई पावती नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks Corning CLS430769
Round Bottom 96-well culture plates Thermo-Nunclon 163320
Sterile reagent reservoirs VistaLab 3054-1004
96 well white round bottom polystyrene microplate plate Corning 3605
96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips Corning 4408
Magnetic bead separator tube rack V&P Scientific, Inc VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
DynaMag -96 Side Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Biosciences
BD High Throughput Sampler (HTS) BD Biosciences
BioRad TC20 Automated Cell Counter BioRad 1450103
Microplate Shaker VWR 12620-928
Galaxy MiniStar Microcentrifuge VWR C1413
tissue culture CO2 incubator Nuaire NU-4750
Biosafety cabinet Labcono Purifier Cell Logic +
Jurkat Cell Line ATCC TIB152™
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific A20173
Dynabeads M270 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 65306
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21343
RPMI-1640 1x Medium Life Technologies A10491-01-500mL
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
Pen-Strep (100x) liquid formulation Corning 30-002-CI
1x DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
4% Para-formaldehyde Electron Microscopy Science 15735-85
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Life Technologies L34955
Tween 20 Sigma P1379-100mL
Bovine Serum Albumin Sigma 3059
Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) Bioreclamation IVT request a quote from website
VWR Polyester Plate Film VWR 60941
Seal & Sample Aluminum Foil Beckman Coulter 538619

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDER. Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , FDA Guidance for Industry. (2016).
  2. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).
  3. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).
  4. Pedras, A. NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays. BEBPA Forum. , (2015).
  5. Stovold, C. NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow. Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).
  6. Kromminga, A. Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , IPM Biotech. (2013).
  7. Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).
  8. Melton, A. C., et al. Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome. Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).
  9. U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , ICH. (2012).
  10. Lee, K., et al. A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease. Glycobiology. 13, 305-313 (2003).
  11. Kirkegaard, T. Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases. Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).
  12. Miller, J. M., et al. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report. , Available from: https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm 1-101 (2012).
  13. Invitrogen by ThermoFisher Scientific. Dynabeads M-270 Streptavidin. , (2015).
  14. European Medicines Agency. Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , European Medicines Agency. (2017).
  15. ThermoFisher Scientific. Molecular Probes Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).
  16. JoVE Science Education Database. An Introduction to Working in the Hood. Journal of Visualized Experiments. , General Laboratory Techniques (2018).
  17. Invitrogen and Gibco. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific Inc. (2010).
  18. Coecke, S., et al. Guidance on Good Cell Culture Practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).
  19. ThermoFisher Scientific. Introduction to Cell Culture. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html (2018).
  20. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  21. Bio-Rad Laboratories. Counting Cells with Bio-Rad's TC20(TM) Automated Cell Counter. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M (2012).
  22. ThermoFisher Scientific. User Guide LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).
  23. Biosciences. Getting Started with BD FACSDiva Software. , BD Biosciences. (2007).
  24. Biosciences. BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).
  25. Quirke, P. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).
  26. Bio-Rad Laboratoratories. A guide to gating in flow cytometry. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html (2016).
  27. Minor, L. K. Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
  28. Desilva, B., et al. Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules. Pharmaceutical Research. 20, (2003).
  29. Hu, J., et al. Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).
  30. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Scientific Reports. 6, (2016).
  31. Charles River. A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors. Charles River Researcher. , (2015).
  32. Biosciences. BD Biosciences Relative Fluorochrome Brightness. BD Biosciences. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/us/applications/research/multicolor-flow/m/745795/overview 16181 (2014).
  33. Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays. MethodsX. 4, 153-165 (2017).
  34. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).
  35. Thermo Fisher Scientific. Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).
  36. Long, B., et al. Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study. Clinical Therapeutics. 39, (2017).
  37. Schweighardt, B., et al. Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial. Clinical Therapeutics. 37, (2015).
  38. Schneider, Z. Importance of isoelectric point (pI) of antibodies. Antibody Society. , Available from: http://www.antibodysociety.org/importance-isoelectric-point-pi-antibodies/ (2017).
  39. Mellman, I. R. A., Plutner, H. Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes. The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).
  40. Wang, J., et al. Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment. Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३९ एंटीबॉडी परख बेअसर lysosomal भंडारण रोग एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी प्रवाह cytometry सेल-परख परख विकास और सत्यापन आधारित
एंटीबॉडी का पता लगाना है कि एक सेल के साथ एंजाइम प्रतिस्थापन उपचार के सेलुलर को बेअसर परख आधारित
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheung, R., deHart, G. W., Jesaitis, … More

Cheung, R., deHart, G. W., Jesaitis, L., Zoog, S. J., Melton, A. C. Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay. J. Vis. Exp. (139), e57777, doi:10.3791/57777 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter