Article de méthode

Optogenetics Identification d’un Type Neuronal avec un verre de Optrode chez les souris éveillés

DOI :

10.3791/57781

⸱

28 juin 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail présente une méthode pour exécuter une seule unité optogenetic enregistrement fiable d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C’est une préoccupation majeure en neurosciences comment différents types de neurones fonctionnent dans les circuits neurones. Les progrès récents dans l’optogenetics ont permis l’identification du type neuronal dans in vivo des expériences électrophysiologiques dans les régions du cerveau large. Dans les expériences d’optogenetics, il est essentiel de fournir de la lumière sur le site d’enregistrement. Toutefois, il est souvent difficile de livrer la lumière de stimulation pour les régions du cerveau profond de la surface du cerveau. En particulier, il est difficile pour la lumière de stimulation atteindre les régions cérébrales profondes lorsque la transparence optique de la surface du cerveau est faible, comme c’est souvent le cas avec des enregistrements d’animaux éveillés. Nous décrivons ici une méthode pour enregistrer les réponses de pointe à la lumière d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure. Dans cette méthode, la lumière est assurée à l’électrode de verre enregistrement afin qu’il est possible de stimuler efficacement le neurone enregistré avec la lumière dans les régions du cerveau profond. Ce système fait sur commande d’optrode se compose de matériaux accessibles et peu coûteux et est facile à assembler.

Introduction

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Le système nerveux central se compose de différents types de neurones, qui ont des fonctions différentes. Comment ces différents types de neurones travaillent au sein du circuit neuronal est l’une des préoccupations majeures en neurosciences. Toutefois, dans de nombreuses régions du cerveau, il a été impossible de distinguer les types neurones dans in vivo des enregistrements des activités électriques car il n’y a aucune différence claire dans le signal électrique spike lui-même, à quelques exceptions près. Les progrès récents dans les optogenetics ont fait une percée1,2. À l’aide d’animaux transgéniques dans laquelle opsine sensible à la lumière (par exemple, channelrhodopsin-2) est exprimée dans des types de neurones spécifiques, il est devenu possible de distinguer les types neurones efficacement dans in vivo enregistrements3, 4,5,6. Chez ces animaux, les neurones avec photosensible opsine sont excités en donnant des stimuli lumineux durant les enregistrements électriques, mais les autres neurones ne sont pas. Les neurones de l’opsine positifs, donc, sont aisément distinguées des autres types de neurones par leurs réponses à la lumière.

Dans les expériences d’optogenetics, il est essentiel de fournir de la lumière sur le site d’enregistrement. Comme une méthode non invasive, la lumière est souvent réalisée de la surface du cerveau. Cependant, car la force de la lumière diminue car il passe par les tissus du cerveau, il est difficile de stimuler les régions du cerveau profond de la surface du cerveau. En particulier, il est difficile pour la lumière de stimulation atteindre les régions cérébrales profondes lorsque la transparence optique de la surface du cerveau est faible, comme c’est souvent le cas avec des enregistrements d’animaux éveillés. Expériences électrophysiologiques ont souvent été réalisées sur des animaux anesthésiés parce que le mouvement du corps provoque un bruit dans les enregistrements. Comme est bien documentée, cependant, anesthésie est connu pour changer les réponses neuronales7,8,9,10. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser des animaux éveillés afin d’étudier les réponses neuronales sans les effets artificiels de l’anesthésie. À la différence des expériences avec des animaux anesthésiés, les enregistrements électrophysiologiques sont effectuées après la récupération de la chirurgie dans les expériences avec des animaux éveillés. Au cours de l’intervalle entre les enregistrements et la chirurgie, l’exsudat de tissu souvent s’accumule sur la surface du cerveau et rend la transparence optique de la surface du cerveau faible.

Nous décrivons ici une méthode pour enregistrer les enregistrements unitaires d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure. Dans cette méthode, la lumière est assurée à l’électrode de verre enregistrement afin qu’il est possible de stimuler efficacement le neurone enregistré avec la lumière dans les régions du cerveau profond. Ce système fait sur commande d’optrode se compose de matériaux accessibles et peu coûteux et est facile à assembler.

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Protocole

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Toutes les procédures s’effectuent conformément aux principes directeurs de la société physiologique du Japon et avec l’approbation de l’Animal Care Committee de Kanazawa médical University.

1. construction de la porte de Optrode de verre

Remarque : Pour construire un porte-optrode en verre, un porte-électrode commerciale est utilisée (Figure 1 a).

  1. Retirez doucement le tube d’acier pour le contrôle de la pression du corps de la titulaire.
  2. Par forage, élargir le trou du côté siège broche dans le canon du titulaire. Faire le trou de 3 mm de diamètre et de 12 mm de profondeur.
  3. Mettre un tuyau en acier inox (3 mm de diamètre, épaisseur 0,5 mm et 8 mm de longueur ; Figure 1 a 2) dans le trou.
  4. Insérer une céramique divisé manchon accouplement pour embouts de ⌀2.5 mm (Figure 1 a,1) dans le trou.
  5. Fixer le canon de la porte-électrode à une rainure en forme de L avec de la colle époxy.
  6. Faire les trous (3 mm de diamètre) dans la rainure et attachez-le à un manipulateur avec vis.

2. tête Post Installation

  1. Préparer un post tête sur mesure faite d’un écarteur de circuit imprimé. Prendre l’entretoise colonnaires circuit imprimé dans une forme cubique avec une fraise et coupez-le en 2 postes de tête avec une scie (Figure 1 b). Aplatir le bas du poteau tête avec une fraise.
  2. Préparer l’animal transgénique dans laquelle une opsine photosensible est exprimée dans un type de neurone spécifique pour l’étude. Dans cet ouvrage, la souris transgénique (VGAT-ChR2 souris) dans lequel les neurones inhibiteurs expriment channelrhodopsin-2 (ChR2)11 est utilisée.
  3. Anesthésier l’animal avec un mélange de 0,3 mg/kg de la médétomidine 4,0 mg/kg de midazolam et 5,0 mg/kg de butorphanol par injection intrapéritonéale. Pour confirmer que l’animal est complètement anesthésié, tester ses réactions pour pincer la queue.
  4. Placez votre souris dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant. Nettoyer le cadre stéréotaxique et le chauffage pad avec alcool à 70 % à l’avance. Placez les dents dans le trou de la barre de la morsure et serrer la pince nez. Fixer les deux côtés de la tête à l’aide de barres d’oreilles. Lorsque la tête est correctement fixée par les barres d’oreilles, serrer le collier du nez. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.
  5. Se raser la tête de la peau avec petits ciseaux et nettoyer le cuir chevelu avec un coton-tige de gluconate de chlorhexidine. Avant la chirurgie, stériliser tous que les instruments chirurgicaux et une tête de poteau avec un autoclave (121 ° C, 15 min).
  6. Couper le cuir chevelu le long de la ligne médiane avec des ciseaux et mettre de côté. Faire l’incision de l’arrière de la tête aux yeux (environ 20 mm). Retirez le périoste avec un coton-tige imbibé d’alcool à 70 % et séchez le crâne.
  7. Fixer le poteau en tête pour le manipulateur. Positionner le poteau tête plat sur le crâne autour du bregma à l’aide de celui qui les manipule.
  8. Mélanger le monomère (4 gouttes), du catalyseur (1 goutte) et polymère (1 petite cuillère) de ciment dentaire sur un petit plat qui est refroidi au réfrigérateur à l’avance. Mettre le ciment dentaire (inférieure à 1 g) sur le frontal et l’os pariétal du crâne pour fixer le poteau tête au crâne.
  9. Après que le ciment dentaire devient dur, retirez la souris du cadre stéréotaxique. Mettre une pommade antibiotique sur la peau exposée. Injecter l’antagoniste de la médétomidine (0,3 mg/kg) et les antibiotiques (oxytétracycline ; 20 mg/kg). Placer et contrôler la souris sur le coussin chauffant dans une cage jusqu'à ce qu’il se réveille et retourner à une cage de logement.
  10. Maison de l’animal dans une cage habitat individuel avec un dispositif d’enrichissement. Changer le papier animaux literie tous les jours pour nettoyer la cage et de prévenir l’infection. Surveiller attentivement si l’animal montre des signes d’inconfort. Appliquez la lidocaïne sur la plaie si aucune douleur est suspectée. Administrer meloxicam ou carprofène une fois toutes les 24 h pendant 48 h les deux la tête après des chirurgies installation et craniotomie. La lidocaïne locale peut être donnée en outre, si la prise d’AINS n’est pas suffisante.

3. acclimatation

  1. Deux jours (minimum) après la récupération de l’anesthésie, acclimater les animaux à l’état de chef-fixé dans la chambre d’enregistrement. Effectuer les sessions d’acclimatation pendant au moins 5 jours.
  2. Pendant les séances d’acclimatation, placer l’animal dans la chambre d’enregistrement avec le post de tête fixé à un collier sur mesure. Au cours de la session, afin de limiter le mouvement, le corps avec un tube de la moitié de résine sur mesure (Figure 1), la couverture faite à l’aide d’une imprimante 3D.
    Remarque : Le jour 1, la session d’acclimatation doit être long de 5 min. Il est ensuite passé par jour à 10, 20, 40 et 60 min pour les jours 2, 3, 4 et 5, respectivement.
  3. À la fin de chaque session, donner à l’animal une récompense alimentaire. Si l’animal se débat sans cesse au cours de l’acclimatation, arrêter la session.

4. craniotomie

Remarque : Après l’acclimatation, une craniotomie est effectuée au-dessus de la région du cerveau pour l’enregistrement. La craniotomie est effectuée dans le cadre stéréotaxique sous anesthésie, avec la tête après l’installation. La procédure après l’opération, c’est le même que le chef post installation.

  1. Avant la craniotomie, nettoyez le crâne avec un coton tige avec chlorhexidine gluconate et 70 % d’alcool.
  2. Soigneusement, gratter le crâne sur le site d’enregistrement avec une fraise dentaire. Lorsque l’os sont assez mince, couper avec la pointe du scalpel et retirez-le.
  3. Mettre le ciment dentaire autour de la région exposée afin de renforcer le crâne.
  4. Recouvrir la surface de cerveau exposé avec adhésif silicone après que le ciment dentaire devient difficile. La procédure post-opératoire est comme indiqué au point 2.8.

5. électrophysiologique enregistrement

  1. Permettre à l’animal de récupérer au moins 1 nuit après la craniotomie avant d’effectuer l’enregistrement électrophysiologique. Placer l’animal dans la chambre d’enregistrement de la même manière que cela a été fait au cours des sessions d’acclimatation au démarrage de l’enregistrement.
  2. Faire des pipettes de verre de capillaires en verre borosilicate (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm de long) a tiré sur un extracteur d’électrode. Leur diamètre est de 2 à 3 µm et leur résistance est de 4 à 6 MΩ lorsqu’ils sont remplis avec 10 mM PBS. La longueur de l’électrode est 40 à 50 mm. Dans certains enregistrements, 2 % neurobiotin est ajouté à la 10 mM PBS.
  3. Et placez la pipette de verre remplis l’optrode sur mesure.
  4. Mettre le fil d’argent Ag-Cl enduit (0,2 mm de diamètre) dans la pipette de verre. Connecter le fil d’argent à un pin via un fil électrique enduit mince. Brancher la fiche pour le préamplificateur de l’amplificateur de l’enregistrement.
  5. Connectez le cordon de raccordement de fibre optique (base = 960 µm, bardage = 1 000 µm, NA = 0,63) avec une bague zircone (OD = 2,5 mm) à la scission accouplement manchon sur le porte-optrode. Poussez le cordon de raccordement dans le manchon jusqu'à ce que la pointe de l’embout entre en contact avec le dos de la pipette de verre. Le cordon de raccordement livre la lumière (longueur d’onde = 465 nm) de LED. La lumière LED est contrôlée par un conducteur de LED monocanal.
  6. Enlever l’adhésif silicone franchissant la craniotomie. Mettez saline chauffée (38 ° C) sur la surface du cerveau périodiquement pour que la surface du cerveau ne se dessèchent au cours de la séance d’enregistrement. Si nécessaire, enlever la dura avec des pincettes pointus.
  7. Insérer l’électrode de verre dans le tissu cérébral avec un manipulateur. Contrôler la résistance de l’électrode lorsqu’elle est insérée. Remplacez l’électrode lorsque la résistance est plus faible que prévu parce que la pointe de l’électrode peut être endommagée. À la profondeur de l’intérêt, Rechercher et isoler les pointes de la seule unité de réglage de la profondeur de 2 à 5 µm.
  8. Après que l’unité unique est isolée, la lumière LED et observez la réponse aux stimuli lumineux.
  9. Enregistrer les activités neuronales après l’identification des types de cellules. Effectuer les enregistrements pendant 2 – 3 h. Si l’enregistrement se fait sur deux jours consécutifs (maximum de 2 jours), couvrir la craniotomie avec de la colle silicone. Lorsque l’enregistrement est terminé et que l’animal est sacrifié, récupérer le poste de chef et mettez-le dans l’acétone pour laver et réutiliser.

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Résultats

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Dans la Figure 2, nous avons examiné les effets de la taille de l’embout et la longueur des pipettes de verre sur la puissance lumineuse à la pointe des pipettes (Figure 2 a-B). La puissance lumineuse est mesurée par un compteur d’électricité optique placé à 1 mm de la pointe. L’intégral a été mis à 50 ± 2 mm si la taille de la pointe variables, tandis que la taille de la pointe a été mises à 2.5 µm quand toute l...

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Discussion

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Optogenetics est devenu un outil puissant en neurosciences. Il a été utilisé pour identifier les types spécifiques de neurones en vivo ainsi manipuler les activités de certaines voies neuronales. La clarification des activités neuronales de différents types de neurones favorise la compréhension du mécanisme des circuits neurones. Ici, nous avons démontré une méthode pour remettre la lumière sur le site d’enregistrement grâce à une électrode de verre dans l’IC de souris de VGAT-ChR2 éveillés.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs ont été pris en charge par la société japonaise pour la Promotion de la Science KAKENHI Grant JP16K11200 et 17H 02223 et la subvention pour la recherche de l’Université médicale de Kanazawa S2016-8 et C2017-3. Nous remercions Yuhichi Kuda pour son aide en prenant des photos.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Porte-électrodeDispositif moléculairePorte-pipette 1-HL-Upour amplificateur de microélectrodes
Manchon d’accouplement fendu en céramiqueThorlabsADAF1f2.5 mm
Entretoise de carte de circuit impriméTeishin DenkiSPA-320f8.0 mm, 20.0 mm de long
Cadre stéréotaxique pour sourisNarishigeSR-6M-HTInstruments stéréotaxiques pour souris
ManipulateurNarishigeNAManipulateur manuel
SuperbondSun MedicalM : 204610557Adhésif dentaire résine ciment
Form2FormlabsNAImprimante 3D
Kwik-SilWPIKWIK-SILAdhésif silicone à faible toxicité
Capillaires en verre borosilicatéNarishigeGD-1.5OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm de long
Cordon de raccordement à fibre optiqueLentilles DoricMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Cordon de raccordement monofibre optique, OD, 2,5 mm, noyau = 960 mm, gainage = 1000 mm, NA = 0,63
LED connectéeLentilles DoricLEDC-1B_FCLongueur d’onde centrale = 465 nm, puissance de sortie = 45 mW (noyau 960 mm 0,63 NA )
Pilote LEDLentilles DoricLEDRV_1CH_1000pilote de LED 1 canal, sortie maximale = 1000 mA
Extracteur d’électrodeNarishigePB-7Extracteur de micropipette en verre à deux étages
Capillaire en verre borosilicatéNarishigeGD-1.5Capillaire en verre bolosilicaté, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm de long
GENTACINMSD CO., Ltd185711173Pommade antibiotique
Terramycin® ;-LAZoetisG 333Oxytétracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548VGAT-ChR2 souris
Multiclamp 700BMolecular Devices2500-0157Amplificateur de microélectrodes

Références

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Mots-clés

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