Optogenetics Identification d’un Type Neuronal avec un verre de Optrode chez les souris éveillés

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les fonctions de différents types de neurones. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier de manière fiable les différents types de neurones in vivo avec des matériaux peu coûteux et accessibles. Je ferai une démonstration de la procédure avec Shinji Muramoto, notre technicien, et Lanlan Ma, notre professeur adjoint de notre laboratoire.

Pour commencer cette procédure, retirez doucement le tube d’acier pour le contrôle de la pression du canon du support. Élargissez le trou du côté du siège de la goupille dans le canon du support en perçant. Ensuite, placez un tuyau en acier inoxydable dans le trou.

Ensuite, insérez un manchon d’accouplement fendu en céramique pour virole de 2,5 millimètres de diamètre dans le trou. Faites un trou dans un lapin en forme de L et fixez le canon du porte-électrode au lapin avec de l’adhésif époxy. Ensuite, fixez-le à un manipulateur avec des vis.

Préparez un poteau de tête sur mesure en façonnant l’entretoise de carte de circuit imprimé en colonne dans une forme cuboïdale à l’aide d’une fraise, et coupez-le en deux poteaux de tête avec une scie. Ensuite, aplatissez le bas du poteau de tête avec une fraise. Avant l’opération, stérilisez tous les instruments chirurgicaux et un poteau de tête avec un autoclave.

Nettoyez le cadre stéréotaxique et le coussin chauffant avec de l’alcool à 70 %. Ensuite, anesthésie la souris et place-la dans le cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant. Dans cette expérience, une souris transgénique chez laquelle les neurones inhibiteurs exprimant la channelrhodopsine-II sont utilisés.

Placez les dents dans le trou de la barre d’occlusion et serrez légèrement le pince nasale. Par la suite, fixez les deux côtés de la tête à l’aide de barres d’oreille. Lorsque la tête est correctement fixée par les barres d’oreille, serrez le pince nasale.

Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux. Coupez les cheveux au-dessus de la tête avec de petits ciseaux et nettoyez le cuir chevelu avec un coton-tige de gluconate de chlorhexidine. Ensuite, coupez le cuir chevelu le long de la ligne médiane et poussez-le de côté.

Retirez le périoste à l’aide d’un coton-tige imbibé d’alcool à 70 % et laissez sécher le crâne. Ensuite, fixez le poteau de tête au manipulateur. Positionnez le poteau de tête à plat sur le crâne autour du bregma à l’aide du manipulateur.

Mélangez quatre gouttes de monomère, une goutte de catalyseur et une petite cuillère de polymère sur un petit plat refroidi au réfrigérateur. Appliquez du ciment dentaire sur l’os frontal et pariétal et fixez le pilier de la tête au crâne. Une fois que le ciment dentaire a durci, retirez la souris du cadre stéréotaxique.

Appliquez une pommade antibiotique sur la peau exposée et injectez un cocktail de médétomidine, antagoniste et antibiotique. Ensuite, placez la souris sur le coussin chauffant dans une cage jusqu’à ce qu’elle se réveille et retournez-la dans une cage de logement avec des enrichissements. Pour effectuer une craniotomie sur la région cérébrale cible pour l’enregistrement, nettoyez le crâne avec un coton-tige imbibé de gluconate de chlorhexidine et d’alcool à 70 %.

Grattez soigneusement le crâne sur le site d’enregistrement avec une perceuse dentaire. Lorsque l’os est suffisamment fin, coupez-le avec la pointe du scalpel et retirez-le. Appliquez ensuite du ciment dentaire autour de la région exposée afin de renforcer le crâne.

Couvrez la zone cérébrale exposée avec un adhésif silicone une fois que le ciment dentaire a durci. Ensuite, placez l’animal sur le coussin chauffant dans une cage jusqu’à ce qu’il se réveille et remettez-le dans une cage de logement. Laisser l’animal récupérer pendant au moins un jour après la craniotomie, avant d’effectuer l’enregistrement électrophysiologique.

Avant d’effectuer l’enregistrement électrophysiologique, fabriquez des pipettes en verre à partir de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur d’électrodes. Remplissez les pipettes avec du PBS de 10 millimolaires. Dans certains enregistrements, deux pour cent de neurobiotine sont ajoutés au PBS de 10 millimolaires.

Ensuite, placez l’animal dans la chambre d’enregistrement. Fixez une pipette en verre rempli sur le support d’optrode sur mesure. Insérez un fil recouvert de chlorure d’argent dans la pipette en verre.

Ensuite, connectez la broche à l’étage de tête de l’amplificateur d’enregistrement. Par la suite, connectez le cordon de raccordement à fibre optique avec une virole en zircone au manchon d’accouplement fendu sur le support d’optrode. Enfoncez le cordon de raccordement dans le manchon jusqu’à ce que la pointe de la virole entre en contact avec l’arrière de la pipette en verre.

Le cordon de raccordement fournit la lumière à partir de la LED, qui est contrôlée par un pilote de LED à canal unique. Ensuite, retirez l’adhésif en silicone sur la craniotomie. Appliquez périodiquement une solution saline chaude sur la surface du cerveau pour éviter que la surface du cerveau ne se dessèche pendant la session d’enregistrement.

Si nécessaire, retirez la dure-mère à l’aide d’une pince à épiler pointue. Ici, les réponses de pointe ont été enregistrées dans le colliculus inférieur des souris éveillées VGAT channelrhodopsin-II. Dans le colliculus inférieur des souris VGAT channelrhodopsin-II, les neurones GABAergiques expriment spécifiquement la channelrhodopsine-II.

Chez les souris éveillées, les neurones GABAergiques et glutamatergiques étaient respectivement excités ou supprimés lorsqu’ils recevaient des stimuli lumineux. Lorsque le stimulus lumineux est délivré à travers l’électrode de verre, il a provoqué des réponses de pointe dans certains neurones. En revanche, dans d’autres neurones, les stimuli lumineux ont supprimé les réponses de pointe évoquées par les stimuli sonores.

Ces résultats montrent qu’une optrode en verre peut enregistrer l’activité unitaire bien isolée et stimuler de manière fiable les neurones enregistrés par la lumière. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer comment différents types de neurones fonctionnent dans la cavité neuronale de diverses régions du cerveau.