Name: Optogenetics Identification d’un Type Neuronal avec un verre de Optrode chez les souris éveillés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Découvrez l'enregistrement optogénétique unitaire chez la souris éveillée avec une optrode en verre personnalisée. Cette technique permet d'identifier les neurones GABAergiques et glutamatergiques in vivo.

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Les auteurs ont été pris en charge par la société japonaise pour la Promotion de la Science KAKENHI Grant JP16K11200 et 17H 02223 et la subvention pour la recherche de l’Université médicale de Kanazawa S2016-8 et C2017-3. Nous remercions Yuhichi Kuda pour son aide en prenant des photos.

Toutes les procédures s’effectuent conformément aux principes directeurs de la société physiologique du Japon et avec l’approbation de l’Animal Care Committee de Kanazawa médical University.
1. construction de la porte de Optrode de verre
Remarque : Pour construire un porte-optrode en verre, un porte-électrode commerciale est utilisée (Figure 1 a).
<ol><li>Retirez doucement le tube d’acier pour le contrôle de la pression du corps de la titulaire.</li>
	<li>Par forage, élargir le trou du côté siège broche dans le canon du titulaire. Faire le trou de 3 mm de diamètre et de 12 mm de profondeur.</li>
	<li>Mettre un tuyau en acier inox (3 mm de diamètre, épaisseur 0,5 mm et 8 mm de longueur ; Figure 1 a 2) dans le trou.</li>
	<li>Insérer une céramique divisé manchon accouplement pour embouts de ⌀2.5 mm (Figure 1 a,1) dans le trou.</li>
	<li>Fixer le canon de la porte-électrode à une rainure en forme de L avec de la colle époxy.</li>
	<li>Faire les trous (3 mm de diamètre) dans la rainure et attachez-le à un manipulateur avec vis.</li>
</ol>2. tête Post Installation
<ol><li>Préparer un post tête sur mesure faite d’un écarteur de circuit imprimé. Prendre l’entretoise colonnaires circuit imprimé dans une forme cubique avec une fraise et coupez-le en 2 postes de tête avec une scie (Figure 1 b). Aplatir le bas du poteau tête avec une fraise.</li>
	<li>Préparer l’animal transgénique dans laquelle une opsine photosensible est exprimée dans un type de neurone spécifique pour l’étude. Dans cet ouvrage, la souris transgénique (VGAT-ChR2 souris) dans lequel les neurones inhibiteurs expriment channelrhodopsin-2 (ChR2)11 est utilisée.</li>
	<li>Anesthésier l’animal avec un mélange de 0,3 mg/kg de la médétomidine 4,0 mg/kg de midazolam et 5,0 mg/kg de butorphanol par injection intrapéritonéale. Pour confirmer que l’animal est complètement anesthésié, tester ses réactions pour pincer la queue.</li>
	<li>Placez votre souris dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant. Nettoyer le cadre stéréotaxique et le chauffage pad avec alcool à 70 % à l’avance. Placez les dents dans le trou de la barre de la morsure et serrer la pince nez. Fixer les deux côtés de la tête à l’aide de barres d’oreilles. Lorsque la tête est correctement fixée par les barres d’oreilles, serrer le collier du nez. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.</li>
	<li>Se raser la tête de la peau avec petits ciseaux et nettoyer le cuir chevelu avec un coton-tige de gluconate de chlorhexidine. Avant la chirurgie, stériliser tous que les instruments chirurgicaux et une tête de poteau avec un autoclave (121 ° C, 15 min).</li>
	<li>Couper le cuir chevelu le long de la ligne médiane avec des ciseaux et mettre de côté. Faire l’incision de l’arrière de la tête aux yeux (environ 20 mm). Retirez le périoste avec un coton-tige imbibé d’alcool à 70 % et séchez le crâne.</li>
	<li>Fixer le poteau en tête pour le manipulateur. Positionner le poteau tête plat sur le crâne autour du bregma à l’aide de celui qui les manipule.</li>
	<li>Mélanger le monomère (4 gouttes), du catalyseur (1 goutte) et polymère (1 petite cuillère) de ciment dentaire sur un petit plat qui est refroidi au réfrigérateur à l’avance. Mettre le ciment dentaire (inférieure à 1 g) sur le frontal et l’os pariétal du crâne pour fixer le poteau tête au crâne.</li>
	<li>Après que le ciment dentaire devient dur, retirez la souris du cadre stéréotaxique. Mettre une pommade antibiotique sur la peau exposée. Injecter l’antagoniste de la médétomidine (0,3 mg/kg) et les antibiotiques (oxytétracycline ; 20 mg/kg). Placer et contrôler la souris sur le coussin chauffant dans une cage jusqu'à ce qu’il se réveille et retourner à une cage de logement.</li>
	<li>Maison de l’animal dans une cage habitat individuel avec un dispositif d’enrichissement. Changer le papier animaux literie tous les jours pour nettoyer la cage et de prévenir l’infection. Surveiller attentivement si l’animal montre des signes d’inconfort. Appliquez la lidocaïne sur la plaie si aucune douleur est suspectée. Administrer meloxicam ou carprofène une fois toutes les 24 h pendant 48 h les deux la tête après des chirurgies installation et craniotomie. La lidocaïne locale peut être donnée en outre, si la prise d’AINS n’est pas suffisante.
</li>
</ol>3. acclimatation
<ol><li>Deux jours (minimum) après la récupération de l’anesthésie, acclimater les animaux à l’état de chef-fixé dans la chambre d’enregistrement. Effectuer les sessions d’acclimatation pendant au moins 5 jours.</li>
	<li>Pendant les séances d’acclimatation, placer l’animal dans la chambre d’enregistrement avec le post de tête fixé à un collier sur mesure. Au cours de la session, afin de limiter le mouvement, le corps avec un tube de la moitié de résine sur mesure (Figure 1), la couverture faite à l’aide d’une imprimante 3D. Remarque : Le jour 1, la session d’acclimatation doit être long de 5 min. Il est ensuite passé par jour à 10, 20, 40 et 60 min pour les jours 2, 3, 4 et 5, respectivement.</li>
	<li>À la fin de chaque session, donner à l’animal une récompense alimentaire. Si l’animal se débat sans cesse au cours de l’acclimatation, arrêter la session.</li>
</ol>4. craniotomie
Remarque : Après l’acclimatation, une craniotomie est effectuée au-dessus de la région du cerveau pour l’enregistrement. La craniotomie est effectuée dans le cadre stéréotaxique sous anesthésie, avec la tête après l’installation. La procédure après l’opération, c’est le même que le chef post installation.
<ol><li>Avant la craniotomie, nettoyez le crâne avec un coton tige avec chlorhexidine gluconate et 70 % d’alcool.</li>
	<li>Soigneusement, gratter le crâne sur le site d’enregistrement avec une fraise dentaire. Lorsque l’os sont assez mince, couper avec la pointe du scalpel et retirez-le.</li>
	<li>Mettre le ciment dentaire autour de la région exposée afin de renforcer le crâne.</li>
	<li>Recouvrir la surface de cerveau exposé avec adhésif silicone après que le ciment dentaire devient difficile. La procédure post-opératoire est comme indiqué au point 2.8.</li>
</ol>5. électrophysiologique enregistrement
<ol><li>Permettre à l’animal de récupérer au moins 1 nuit après la craniotomie avant d’effectuer l’enregistrement électrophysiologique. Placer l’animal dans la chambre d’enregistrement de la même manière que cela a été fait au cours des sessions d’acclimatation au démarrage de l’enregistrement.</li>
	<li>Faire des pipettes de verre de capillaires en verre borosilicate (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm de long) a tiré sur un extracteur d’électrode. Leur diamètre est de 2 à 3 µm et leur résistance est de 4 à 6 MΩ lorsqu’ils sont remplis avec 10 mM PBS. La longueur de l’électrode est 40 à 50 mm. Dans certains enregistrements, 2 % neurobiotin est ajouté à la 10 mM PBS.</li>
	<li>Et placez la pipette de verre remplis l’optrode sur mesure.</li>
	<li>Mettre le fil d’argent Ag-Cl enduit (0,2 mm de diamètre) dans la pipette de verre. Connecter le fil d’argent à un pin via un fil électrique enduit mince. Brancher la fiche pour le préamplificateur de l’amplificateur de l’enregistrement.</li>
	<li>Connectez le cordon de raccordement de fibre optique (base = 960 µm, bardage = 1 000 µm, NA = 0,63) avec une bague zircone (OD = 2,5 mm) à la scission accouplement manchon sur le porte-optrode. Poussez le cordon de raccordement dans le manchon jusqu'à ce que la pointe de l’embout entre en contact avec le dos de la pipette de verre. Le cordon de raccordement livre la lumière (longueur d’onde = 465 nm) de LED. La lumière LED est contrôlée par un conducteur de LED monocanal.</li>
	<li>Enlever l’adhésif silicone franchissant la craniotomie. Mettez saline chauffée (38 ° C) sur la surface du cerveau périodiquement pour que la surface du cerveau ne se dessèchent au cours de la séance d’enregistrement. Si nécessaire, enlever la dura avec des pincettes pointus.</li>
	<li>Insérer l’électrode de verre dans le tissu cérébral avec un manipulateur. Contrôler la résistance de l’électrode lorsqu’elle est insérée. Remplacez l’électrode lorsque la résistance est plus faible que prévu parce que la pointe de l’électrode peut être endommagée. À la profondeur de l’intérêt, Rechercher et isoler les pointes de la seule unité de réglage de la profondeur de 2 à 5 µm.</li>
	<li>Après que l’unité unique est isolée, la lumière LED et observez la réponse aux stimuli lumineux.</li>
	<li>Enregistrer les activités neuronales après l’identification des types de cellules. Effectuer les enregistrements pendant 2 – 3 h. Si l’enregistrement se fait sur deux jours consécutifs (maximum de 2 jours), couvrir la craniotomie avec de la colle silicone. Lorsque l’enregistrement est terminé et que l’animal est sacrifié, récupérer le poste de chef et mettez-le dans l’acétone pour laver et réutiliser.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Optogenetics est devenu un outil puissant en neurosciences. Il a été utilisé pour identifier les types spécifiques de neurones en vivo ainsi manipuler les activités de certaines voies neuronales. La clarification des activités neuronales de différents types de neurones favorise la compréhension du mécanisme des circuits neurones. Ici, nous avons démontré une méthode pour remettre la lumière sur le site d’enregistrement grâce à une électrode de verre dans l’IC de souris de VGAT-ChR2 éveillés.
<p class="jove_c...

Le système nerveux central se compose de différents types de neurones, qui ont des fonctions différentes. Comment ces différents types de neurones travaillent au sein du circuit neuronal est l’une des préoccupations majeures en neurosciences. Toutefois, dans de nombreuses régions du cerveau, il a été impossible de distinguer les types neurones dans in vivo des enregistrements des activités électriques car il n’y a aucune différence claire dans le signal électrique spike lui-même, à quelques exceptions près. Les progrès récents dans les optogenetics ont fait une percée1,2. À l’aide d’animaux transgéniques dans laquelle opsine sensible à la lumière (par exemple, channelrhodopsin-2) est exprimée dans des types de neurones spécifiques, il est devenu possible de distinguer les types neurones efficacement dans in vivo enregistrements3, 4,5,6. Chez ces animaux, les neurones avec photosensible opsine sont excités en donnant des stimuli lumineux durant les enregistrements électriques, mais les autres neurones ne sont pas. Les neurones de l’opsine positifs, donc, sont aisément distinguées des autres types de neurones par leurs réponses à la lumière.
Dans les expériences d’optogenetics, il est essentiel de fournir de la lumière sur le site d’enregistrement. Comme une méthode non invasive, la lumière est souvent réalisée de la surface du cerveau. Cependant, car la force de la lumière diminue car il passe par les tissus du cerveau, il est difficile de stimuler les régions du cerveau profond de la surface du cerveau. En particulier, il est difficile pour la lumière de stimulation atteindre les régions cérébrales profondes lorsque la transparence optique de la surface du cerveau est faible, comme c’est souvent le cas avec des enregistrements d’animaux éveillés. Expériences électrophysiologiques ont souvent été réalisées sur des animaux anesthésiés parce que le mouvement du corps provoque un bruit dans les enregistrements. Comme est bien documentée, cependant, anesthésie est connu pour changer les réponses neuronales7,8,9,10. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser des animaux éveillés afin d’étudier les réponses neuronales sans les effets artificiels de l’anesthésie. À la différence des expériences avec des animaux anesthésiés, les enregistrements électrophysiologiques sont effectuées après la récupération de la chirurgie dans les expériences avec des animaux éveillés. Au cours de l’intervalle entre les enregistrements et la chirurgie, l’exsudat de tissu souvent s’accumule sur la surface du cerveau et rend la transparence optique de la surface du cerveau faible.
Nous décrivons ici une méthode pour enregistrer les enregistrements unitaires d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure. Dans cette méthode, la lumière est assurée à l’électrode de verre enregistrement afin qu’il est possible de stimuler efficacement le neurone enregistré avec la lumière dans les régions du cerveau profond. Ce système fait sur commande d’optrode se compose de matériaux accessibles et peu coûteux et est facile à assembler.

<table><tbody><tr><td>Porte-électrode</td><td>Dispositif moléculaire</td><td>Porte-pipette 1-HL-U</td><td>pour amplificateur de microélectrodes</td></tr><tr><td>Manchon d’accouplement fendu en céramique</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm</td></tr><tr><td>Entretoise de carte de circuit imprimé</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm de long</td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique pour souris</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Instruments stéréotaxiques pour souris</td></tr><tr><td>Manipulateur</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manipulateur manuel</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M : 204610557</td><td>Adhésif dentaire résine ciment</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>Imprimante 3D</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Adhésif silicone à faible toxicité</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm de long</td></tr><tr><td>Cordon de raccordement à fibre optique</td><td>Lentilles Doric</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Cordon de raccordement monofibre optique, OD, 2,5 mm, noyau = 960 mm, gainage = 1000 mm, NA = 0,63</td></tr><tr><td>LED connectée</td><td>Lentilles Doric</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Longueur d’onde centrale = 465 nm, puissance de sortie = 45 mW (noyau 960 mm 0,63 NA )</td></tr><tr><td>Pilote LED</td><td>Lentilles Doric</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>pilote de LED 1 canal, sortie maximale = 1000 mA</td></tr><tr><td>Extracteur d’électrode</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Extracteur de micropipette en verre à deux étages</td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilicaté</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Capillaire en verre bolosilicaté, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm de long</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Pommade antibiotique</td></tr><tr><td>Terramycin&reg ;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytétracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 souris</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Amplificateur de microélectrodes</td></tr></tbody></table>

optogenetics identification d’un type neuronal avec un verre de optrode chez les souris éveillés

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

C’est une préoccupation majeure en neurosciences comment différents types de neurones fonctionnent dans les circuits neurones. Les progrès récents dans l’optogenetics ont permis l’identification du type neuronal dans in vivo des expériences électrophysiologiques dans les régions du cerveau large. Dans les expériences d’optogenetics, il est essentiel de fournir de la lumière sur le site d’enregistrement. Toutefois, il est souvent difficile de livrer la lumière de stimulation pour les régions du cerveau profond de la surface du cerveau. En particulier, il est difficile pour la lumière de stimulation atteindre les régions cérébrales profondes lorsque la transparence optique de la surface du cerveau est faible, comme c’est souvent le cas avec des enregistrements d’animaux éveillés. Nous décrivons ici une méthode pour enregistrer les réponses de pointe à la lumière d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure. Dans cette méthode, la lumière est assurée à l’électrode de verre enregistrement afin qu’il est possible de stimuler efficacement le neurone enregistré avec la lumière dans les régions du cerveau profond. Ce système fait sur commande d’optrode se compose de matériaux accessibles et peu coûteux et est facile à assembler.

Dans la Figure 2, nous avons examiné les effets de la taille de l’embout et la longueur des pipettes de verre sur la puissance lumineuse à la pointe des pipettes (Figure 2 a-B). La puissance lumineuse est mesurée par un compteur d’électricité optique placé à 1 mm de la pointe. L’intégral a été mis à 50 ± 2 mm si la taille de la pointe variables, tandis que la taille de la pointe a été mises à 2.5 µm quand toute l...

Ce travail présente une méthode pour exécuter une seule unité optogenetic enregistrement fiable d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure.

Optogenetics Identification d’un Type Neuronal avec un verre de Optrode chez les souris éveillés

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les fonctions de différents types de neurones. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier de manière fiable les différents types de neurones in vivo avec des matériaux peu coûteux et accessibles. Je ferai une démonstration de la procédure avec Shinji Muramoto, notre technicien, et Lanlan Ma, notre professeur adjoint de notre laboratoire.Pour commencer cette procédure, retirez doucement le tube d’acier pour le contrôle de la pression du canon du support. Élargissez le trou du côté du siège de la goupille dans le canon du support en perçant. Ensuite, placez un tuyau en acier inoxydable dans le trou.Ensuite, insérez un manchon d’accouplement fendu en céramique pour virole de 2,5 millimètres de diamètre dans le trou. Faites un trou dans un lapin en forme de L et fixez le canon du porte-électrode au lapin avec de l’adhésif époxy. Ensuite, fixez-le à un manipulateur avec des vis.Préparez un poteau de tête sur mesure en façonnant l’entretoise de carte de circuit imprimé en colonne dans une forme cuboïdale à l’aide d’une fraise, et coupez-le en deux poteaux de tête avec une scie. Ensuite, aplatissez le bas du poteau de tête avec une fraise. Avant l’opération, stérilisez tous les instruments chirurgicaux et un poteau de tête avec un autoclave.Nettoyez le cadre stéréotaxique et le coussin chauffant avec de l’alcool à 70 %. Ensuite, anesthésie la souris et place-la dans le cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant. Dans cette expérience, une souris transgénique chez laquelle les neurones inhibiteurs exprimant la channelrhodopsine-II sont utilisés.Placez les dents dans le trou de la barre d’occlusion et serrez légèrement le pince nasale. Par la suite, fixez les deux côtés de la tête à l’aide de barres d’oreille. Lorsque la tête est correctement fixée par les barres d’oreille, serrez le pince nasale.Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux. Coupez les cheveux au-dessus de la tête avec de petits ciseaux et nettoyez le cuir chevelu avec un coton-tige de gluconate de chlorhexidine. Ensuite, coupez le cuir chevelu le long de la ligne médiane et poussez-le de côté.Retirez le périoste à l’aide d’un coton-tige imbibé d’alcool à 70 % et laissez sécher le crâne. Ensuite, fixez le poteau de tête au manipulateur. Positionnez le poteau de tête à plat sur le crâne autour du bregma à l’aide du manipulateur.Mélangez quatre gouttes de monomère, une goutte de catalyseur et une petite cuillère de polymère sur un petit plat refroidi au réfrigérateur. Appliquez du ciment dentaire sur l’os frontal et pariétal et fixez le pilier de la tête au crâne. Une fois que le ciment dentaire a durci, retirez la souris du cadre stéréotaxique.Appliquez une pommade antibiotique sur la peau exposée et injectez un cocktail de médétomidine, antagoniste et antibiotique. Ensuite, placez la souris sur le coussin chauffant dans une cage jusqu’à ce qu’elle se réveille et retournez-la dans une cage de logement avec des enrichissements. Pour effectuer une craniotomie sur la région cérébrale cible pour l’enregistrement, nettoyez le crâne avec un coton-tige imbibé de gluconate de chlorhexidine et d’alcool à 70 %.Grattez soigneusement le crâne sur le site d’enregistrement avec une perceuse dentaire. Lorsque l’os est suffisamment fin, coupez-le avec la pointe du scalpel et retirez-le. Appliquez ensuite du ciment dentaire autour de la région exposée afin de renforcer le crâne.Couvrez la zone cérébrale exposée avec un adhésif silicone une fois que le ciment dentaire a durci. Ensuite, placez l’animal sur le coussin chauffant dans une cage jusqu’à ce qu’il se réveille et remettez-le dans une cage de logement. Laisser l’animal récupérer pendant au moins un jour après la craniotomie, avant d’effectuer l’enregistrement électrophysiologique.Avant d’effectuer l’enregistrement électrophysiologique, fabriquez des pipettes en verre à partir de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur d’électrodes. Remplissez les pipettes avec du PBS de 10 millimolaires. Dans certains enregistrements, deux pour cent de neurobiotine sont ajoutés au PBS de 10 millimolaires.Ensuite, placez l’animal dans la chambre d’enregistrement. Fixez une pipette en verre rempli sur le support d’optrode sur mesure. Insérez un fil recouvert de chlorure d’argent dans la pipette en verre.Ensuite, connectez la broche à l’étage de tête de l’amplificateur d’enregistrement. Par la suite, connectez le cordon de raccordement à fibre optique avec une virole en zircone au manchon d’accouplement fendu sur le support d’optrode. Enfoncez le cordon de raccordement dans le manchon jusqu’à ce que la pointe de la virole entre en contact avec l’arrière de la pipette en verre.Le cordon de raccordement fournit la lumière à partir de la LED, qui est contrôlée par un pilote de LED à canal unique. Ensuite, retirez l’adhésif en silicone sur la craniotomie. Appliquez périodiquement une solution saline chaude sur la surface du cerveau pour éviter que la surface du cerveau ne se dessèche pendant la session d’enregistrement.Si nécessaire, retirez la dure-mère à l’aide d’une pince à épiler pointue. Ici, les réponses de pointe ont été enregistrées dans le colliculus inférieur des souris éveillées VGAT channelrhodopsin-II. Dans le colliculus inférieur des souris VGAT channelrhodopsin-II, les neurones GABAergiques expriment spécifiquement la channelrhodopsine-II.Chez les souris éveillées, les neurones GABAergiques et glutamatergiques étaient respectivement excités ou supprimés lorsqu’ils recevaient des stimuli lumineux. Lorsque le stimulus lumineux est délivré à travers l’électrode de verre, il a provoqué des réponses de pointe dans certains neurones. En revanche, dans d’autres neurones, les stimuli lumineux ont supprimé les réponses de pointe évoquées par les stimuli sonores.Ces résultats montrent qu’une optrode en verre peut enregistrer l’activité unitaire bien isolée et stimuler de manière fiable les neurones enregistrés par la lumière. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer comment différents types de neurones fonctionnent dans la cavité neuronale de diverses régions du cerveau.

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