Summary
Цель настоящего Протокола заключается в обеспечивают систему на основе ячеек, которая реплицирует формирования альфа synuclein агрегатов в естественных условиях. Внутриклеточные альфа synuclein включений в первичной нейронов порожденный интернализации и распространения экзогенных под родной микросом связанные альфа synuclein агрегатов, изолированные от пораженной альфа synuclein трансгенных мышей.
Abstract
Лет невозможность репликации образование нерастворимых альфа synuclein (αS) включений в клеточных культурах был большой ограничение в исследовании комплексирования αS при болезни Паркинсона (PD). Недавно разработка новых животных моделей через экзогенных прививка экстрактов мозга с больными αS трансгенных мышей или PD пациентов дал новые надежды на возможность создания более адекватной модели клетки αS агрегации. К сожалению когда дело доходит до клеток в культурах, администрация экстрактов сырой мозга не оказалась столь успешным, как и мышей и источник выбора внешних агрегатов до сих пор в vitro теплоизоляционная αS фибрилл.
Мы разработали метод, чтобы вызвать образование αS внутриклеточных включений в первичной нейронов через администрации экзогенных родной микросом связанные αS агрегатов, высокотоксичных αS видов, изолированных от пораженной области трансгенных мышей. Эта часть αS агрегатов, связанный с микросом везикулы, эффективно внедрено и индуцирует образование внутриклеточных включений позитивные для агрегированных и фосфорилированных αS. По сравнению с в vitro-преформированных фибрилл, которые сделаны из рекомбинантных αS, наш метод быстрее и гарантии, которые патогенных посев производится с аутентичными αS агрегатов извлечено от больных животных моделей PD, подражая более тесно тип включений получил в естественных условиях. В результате обязательным является наличие тканях, богатых αS включений.
Мы считаем, что этот метод будет предоставлять универсальная модель на основе клеток для изучения аспектов микроскопические αS агрегирования и смежных сотовой патофизиологии в естественных условиях и будет отправной точкой для создания более точные и сложные ячейки парадигма PD.
Introduction
Накопление альфа synuclein (αS) белковых включений является заметную и важную особенность Паркинсона болезнь (PD) и альфа synulceinopathies1. К сожалению, в то время как Животные модели способны предоставлять среде достаточно сотовой и биохимических побудить агрегации шаги, необходимые для формирования белков фибриллами2, репликация формирования сложных Леви тела (LB)-, как агрегатов в клеточных культурах является трудным и сложным.
Здесь мы описываем метод, чтобы вызвать образование αS включений, аналогичные агрегаты белка, полученные в животных моделях и PD пациентов, культивируемых клеток, используя изолированные мозга мыши первичной нейронов. Наш протокол основан на экзогенные администрации микросом связанные αS агрегатов, изолированные от αS симптоматическая трансгенных мышей (Tg) мыши гиппокампа или корковых нейронов первичной. Этот метод использует способности распространения и распространения токсичных видов αS, который, после добавления питательной среды, способны стать интернализации и стимулировать формирование зрелых αS-позитивных агрегаты3,4, 5,6,,78.
Первоначально стандартные методы для получения формирования αS фибрилл в клеточных культурах были основаны на гиперэкспрессия соответствующего cDNA αS через регулярные трансфекции протоколы или инфекции, вирусные опосредованной9. В то время как в первом случае получения LB-как αS агрегаты были случайными, показали низкую эффективность и зависит от типа клеток, второй протокол привело к образованию нерастворимых фибрилл, включая виды высокой молекулярной массой (HMW) в 24-48 ч от инфекции 10. в этих методах, формирование агрегатов, вероятно, из-за чрезмерного и несбалансированным в количестве белка αS, что становится неразрешимой вместо патологического преобразования αS конформации, что диктует агрегации. Вместо этого метод, который мы представляем здесь не изменяет уровень выражения αS но вызывает широко белка агрегации за счет интернализации экзогенных фибриллами. Кроме того, формирование αS агрегатов через администрацию экзогенных фибриллами является длительным процессом, который требует дней или недель, чтобы стать исчерпывающим, позволяя нам изучить ранних и промежуточные этапы формирования αS включений в промежуток времени моды и чтобы соотнести его с сотовой биохимические изменения. Таким образом наш метод является ценным приложение для создания сотовой модели комплексирования αS, которые являются полезными для изучения формирования αS фибриллярных микроскопически применительно к сотовой патофизиологии.
Кроме хотя администрация сырой мозга выдержки из больной αS Transgenic (Tg) мышах11,12 или6,мозги человека PD13 способен побудить αS осаждения в ТГ или одичал тип (WT) животных, приложение из той же процедуре для культур клеток не оказалось столь успешным, возможно из-за низкого количества агрегатов в образцах используется и отсутствие стандартной процедуры изолировать токсичных видов родной αS14. Из-за этого, в пробирке преформированные фибриллами (PFFs) αS были источником агрегатов выбора до тех пор пока теперь для индукции αS включений в клетках и животных моделей3,4,6,7 ,,1516. С нашей протоколом однако, мы покажем, что агрегированные видов микросом связанные αS изолированы от мышей Tg αS эффективно может вызвать накопление внутриклеточных включений αS LB-как в первичной нейронов.
В нашей лаборатории микросом связанные αS агрегированных видов изолированы от спинного мозга (SpC) ткани больных Tg мышей, выражая человеческого гена αS A53T под контролем промотора мыши прионных белков (PrP) [Prp человека A53T αS Tg мышей, G2-3 линии17]. Эти шоу мышей, возраст зависимых нейродегенеративных фенотип, которая включает в себя надежные моторные дисфункции и формирование включений в центральной нервной системе, сделанный из фосфорилированных, убиквитинированных и нерастворимый αS, начиная после 9 месяцев возраста. Как только появляется моторные дисфункции, фенотип быстро развивается в паралич, начиная от задней конечности, что приводит к смерти в 2-3 недели. Накопление αS агрегатов параллели проявления болезни. Мышей, жертву в начале моторные дисфункции показывают надежную степень агрегирования αS в СПК, ствола мозга и мозжечке. Существует не нужно ждать пока паралич в жертву мыши. Presymptomatic мышей принимаются на 9 месяцев старый животных, которые не отображаются моторные дисфункции.
Protocol
Использование WT и Tg животных был утвержден и выполнены в полном объеме национального и международного законодательства для лабораторных животных и эксперименты (EEC Совета Директива 86/609, 12 декабря 1987 года и Директива 2010/63/ЕС, 22 сентября 2010). Все протоколы, описанные в настоящем документе руководящим животных ухода нашего учреждения.
1. изоляция микросом связанные αS агрегатов от мышей Tg αS больных A53T
- Подготовьте гомогенизации буфер, который состоит из сахарозы 250 мм, 20 мм HEPES, 10 мм KCl, 1,5 мм MgCl2, ЭДТА 2 мм и 1 x фосфатазы /-ингибиторов протеазы. Сохраните буфер на льду.
- Однородный свежие или замороженные ткани в 1:10 (w/v) объем ледяной гомогенизации буфера с помощью тефлоновой пестиком гомогенизатор, с 10-15 ударов.
- Передать первоначальный огневки (1-2 мл) пробки microcentrifuge и центрифуги на 1000 g × 10 мин при 4 ° C, с помощью холодильных центрифуги для удаления ядра и нерушимой клетки в результате гранулы (P1). Отказаться от P1.
- Передать трубку чистой microcentrifuge супернатант (S1) и центрифуги S1 на 10 000 × g 20 мин при 4 ° C, с помощью холодильных центрифуги для получения второй супернатант (S10) и Пелле (P10).
Примечание: P10-сырой мембраны Пелле, который содержит митохондрии и синаптосомах. Выбросите P10. - Передача супернатант (S10) поликарбоната бутылка (> 1 мл) и центрифуги S10 в 100 000 × g, за 1 ч при 4 ° C, с использованием ультрацентрифугирования и фиксированный угол ротора (90 Ti).
Примечание: Супернатант то чисто цитозоль фракция гранул, P100, содержит связанные микросом αS агрегатов. - Ресуспензируйте P100 лепешка с 500 мкл буфера гомогенизации. Передавать P100 чистой microcentrifuge трубки и центрифуги на 10 000 × g 20 мин при 4 ° C в охлажденных центрифуги.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте P100 с 100 мкл буфера гомогенизации.
Примечание: Эта часть является микросом связанные αS агрегатов. - Sonicate образцы для 2 s на льду [установить Выходная мощность 1 Вт (RMS)]. Хранить образцы на-80 ° C.
- На следующий день после, определить количество белка, с помощью анализа BCA.
2. Западная помарка
Примечание: Биохимическая характеристика микросом связанные αS агрегатов оценивается по западной помарки.
- Литье на аппарат вертикального электрофореза геля полиакриламида трис глицин градиента 4-20%.
- Загрузите 1 мкг микросом связанные αS фракций, растворенного в буфере денатурируя образца.
- В различных хорошо нагрузка 5 мкл белок стандартного маркера.
- Побегите гель на 100 V в Tris/глицин/SDS работает буфер до тех пор, пока маркер белок достигает конца геля.
- Переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, используя буфер основной карбонат (10 мм NaCO3, 3 мм NaHCO3, 20% метанола) O/N на 4 ° C, на 200 мА, постоянное.
- Блокировать мембраны с PBS-неионогенных ПАВ 0,05% (PBS-T) с 5% обезжиренное сухое молоко на орбитальный шейкер для 30 мин на RT.
- Вкратце Промойте мембрану с PBS-T.
- Проинкубируйте мембрану с Syn-1 (1:5, 000) или pSer129-αS антитела (1:5, 000) в 2,5% обезжиренное сухое молоко в PBS-T, O/N при 4 ° C на орбитальный шейкер.
- Вымойте мембрана для 10 мин на RT с PBS-T на орбитальный шейкер.
- Проинкубируйте мембрану с анти мыши или анти кролик HRP-конъюгированных вторичное антитело (1:3, 000) в 2,5% обезжиренное сухое молоко в PBS-T 1 h на RT.
- Вымойте мембрана для 10 мин на RT с PBS-T на орбитальный шейкер. Повторите 3 x.
- Получите сигнал через регулярные хемилюминесценции комплекты.
3. Первичные нейрональных культур
Примечание: Основная нейрональных культур были подготовлены от WT новорожденных (P0) мыши гиппокампа или коры (линии C57BL/6). Вся процедура, минус центрифугирования шаги, осуществляется под капотом культуры клеток, в стерильных условиях.
- Лечить coverslips (диаметром 18 мм) с 65% раствор азотной кислоты для по крайней мере 12 h на RT.
- Удаление азотной кислоты. Промывайте coverslips дважды с PBS 10 x и несколько раз дистиллированной водой.
- Вставить coverslips в 24-ну блюда и покрыть их с поли D-Лизин (0,1 мг/мл в стерильной дистиллированной воде или PBS 1 x) за 1 ч при 37 ° C.
- Удаление поли D-лизин и мыть coverslips три раза с дистиллированной водой. Храните при 4 ° C до тех пор, пока требуется.
- Усыпить мыши щенков, обезглавливание и отдельные руководители органов. Руководители на блюда и аккуратно вскрыть кожи.
- С помощью тонкой ножницы, откройте черепа, сделав надрез на базах мозги. Отдельные две половинки черепа и тщательно удалить их.
- С помощью щипцов, щепотка покинуть мозги из баз и изолировать коры головного мозга и гиппокампе. Перенесите их в две отдельные блюда, содержащие Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) среде, содержащей 1% пенициллина/стрептомицина.
- Повторите шаги 3.6 и 3.7 для каждого животного. Имейте в виду, что весь процесс не следует принимать более чем на 30-45 мин.
- Фарш собранных тканей и перенести их в две 50 мл конические трубы (один для гиппокампа) и один для коры с 10 мл HBSS носитель, содержащий трипсина 0,1%. Инкубируйте на водяной бане в течение 7 минут при 37 ° C.
Примечание: Никакой агитации не требуется. - Добавьте 1 mL DMEM, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 10 мкг/мл DNase к огневки блокировать активность трипсина.
- Центрифуга результате диссоциированных ткани на 200 g × 5 мин на RT на центрифуге и удалить супернатант.
Примечание: Гранулы представляет ячейки, расчлененный из ткани. - Ресуспензируйте клеток в среде обшивка, содержащий 2% B27, глютамин 2 мм, глюкозы 6 мг/мл, 10% FBS, 12,5 мкм глутамата и гентамицин 10 мкг/мл.
- Пластина отделить нейронов на поли D-лизин coverslips в 24 хорошо пластины согласно соотношение: 1 коры/12 скважин и скважин 1 гиппокампа/6, что приводит к примерно 150 000/200 000 ячеек на хорошо. Сохранить клетки в инкубаторе при 37 ° C.
- На следующий день после (день в пробирке, DIV-1), обшивка среднего Замените носитель, содержащий 2% B27, 10 мкг/мл гентамицина и глютамин 2 мм.
- В DIV 2 удалить 1/3 средних и добавить 1/3 свежей среды, содержащие 2,5 мкм цитозин арабинозид для 48 h для уменьшения глиальных загрязнения.
- Поддерживать нейроны при 37 ° C и заменить половину среды каждые три дня.
4. нейронов лечение
Примечание: Обработка была выполнена в DIV 7. Все шаги проводятся под капотом культуры клеток в стерильных условиях. Пример плотности корковых нейронов культуры в DIV 7 показано на рисунке 1.
- Бассейн микросом связанные αS агрегатов, полученные от спинного трех различных больной Tg мышей для того чтобы иметь 1 мкг/мкл раствора, используя оригинальные гомогенизации буфер для разведения.
- Удаление 1/3 среды и заменить его нежно свежие носитель, содержащий 2% B27, 1 x гентамицина и 2 мм глутамина.
- Добавьте 1 мкг пуле микросом связанные αS агрегатов среднего ячейки. Возвращение нейронов в инкубаторе при 37 ° C.
- Каждые 3 дня на 1 неделю, добавить 1/3 свежей среды. Не заменять среды. Просто добавьте его.
- После 1 недели лечения удалите 1/3 среды и заменить его нежно свежие носитель, содержащий 2% B27, 10 мкг/мл гентамицина и глютамин 2 мм. Повторяйте каждые 3 дня.
- Нейроны исправьте после 2 недель лечения (DIV 21).
5. иммунофлуоресценции
- Исправить нейронов с 2% параформальдегида в PBS 1 x и 5% раствора сахарозы для 15 мин на RT без встряхивания, под химического дыма капот.
- Удалите крепежные решения. Вкратце мыть с PBS 1 x, 3 раза.
Примечание: Выполните все стиральные осторожно потому что основной нейроны не твердо придерживаться поли лизин coverslips. - Разрушения нейронов с 0,3% неионогенных ПАВ в PBS 1 x 5 мин на RT.
- Вкратце мыть с PBS 1 x, 3 раза.
- Инкубировать нейронов с 3% FBS в PBS 1 x 30 мин на RT, чтобы блокировать неспецифических привязки сайтов, орбитальный шейкер.
- Инкубировать нейронов с соответствующим основным антителом, растворяют в 3% FBS в PBS 1 x, O/N при 4 ° C на орбитальный шейкер.
Примечание: syn303 (1:1, 000), мыши αS (1: 200), pser129-αS (1:1, 000) и Тау (1:10, 000) были использованы антитела. - Удалите раствор антител и мыть, кратко, с PBS 1 x, 3 раза.
- Проинкубируйте нейронов с соответствующим флуоресцентные вторичное антитело, растворяют в 3% FBS в PBS, за 1 ч в темноте на орбитальный шейкер в рт.
- Удалите раствор антител и мыть, кратко, с PBS 1 x, 3 раза.
- Пятно нейронов DAPI раствором (0,1 мкг/мл в PBS 1 x) за 15 мин на RT в темноте на орбитальный шейкер.
- Удалите раствор антител и мыть, кратко, с PBS 1 x, 3 раза.
- Гора coverslips на слайде с помощью среднего antifade монтажа.
Representative Results
После протокол описанных выше и обобщены на рисунке 2, мы очищены микросом связанные αS агрегатов из трех больных A53T αS Tg мышей (рис. 3). Микросом являются сырой мембраны Пелле фракций, которые содержат эндоплазматического ретикулума, Гольджи и малых синаптических пузырьков. Степень чистоты микросомальной Пелле, по сравнению с другими ранее оценивалась с использованием определенных органелл маркеры18.
После того, как изолированные, биохимическая характеристика αS агрегатов оценивается через денатурируя SDS-Page, следуют инкубации с Syn-1 или фосфорилированных αS на антитела Серина 129 (pSer129-αS). По сравнению с presymptomatic (Дикт) и соответствует возрасту не Tg (nTg) мышах, микросом, изолированных от совместного преципитат больных мышей с αS агрегатов. ΑS микросом ассоциированных видов Показать характерные черты αS агрегатов, таких как накопление HMW моющих средств устойчивых видов, фосфорилирование Серина 12919 , C- и N-терминальный усечение фрагментов (для полной характеристики микросом связанные αS агрегатов см ссылку18,,20-21). Это основные требования, поскольку мономерных αS не получить внутреннюю эффективно и не вызвать αS осаждения7,15,22. Важно не использовать любой моющего средства (ионный или неионные) для Ресуспензируйте P100 окатышей, так как это может быть вредным для клеток. Кроме того во избежание изменчивость выборки, микросом связанные αS агрегатов от трех различных больной мышей будут включены в пул для нейрональные лечения.
Отправления 1 мкг агрегатов пула αS микросом связанные с больными A53T мышей на носитель культуры нейронов коры головного мозга и гиппокампе индуцирует зависящих от времени формирования αS включений, αS агрегатов специфические антитела такие как к Syn303 (рис. 4, 5) или pser129-αS (рис. 5). После двух дней (2d) лечения, эти агрегаты отображаются в виде мелких, разрозненных puncta, которая станет более обильны в позднее время точках. После двух недель, αS включений напоминают давно и зрелые бусы как структуры, сильно распространилась нейрональных культур, следуя модели neurite и частично совместно локализации с пресинаптической и невритов маркеры (рис. 5). Иногда недавно сформированной αS включений может рассматриваться совместно локализовать и запятнать клетки Сома или охватывают весь процесс, напоминающие некротические невритов.
Хотя микросом связанные αS агрегатов фракции может эффективно распространяться в нейрональных культур, их количество должно быть тонко настроены на количество нейронов покрытием (рис. 1). В самом деле, превышающих рекомендуемое отношение, мкг микросом связанные агрегатов: количество нейронов, заставят преждевременной клеточной гибели в течение нескольких дней (рис. 6), в то время как недостаточное количество агрегатов микросом связанные αS приведет к скудные и снижение количество включений после двух недель лечения, похож на что был получен в более ранние моменты времени (рис. 4A).
Рисунок 1 . Корковых нейронов культур. Представитель изображением плотность в DIV 7 корковых нейронов культур. Изображения были взяты с инвертированным микроскопом света, 10 X цель. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Изоляция микросом связанные αS агрегатов от мыши SpC. Блок очистки протокол микросом связанные αS агрегатов от ЮТК больной мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Изоляция микросом фракций от больных, presymptomatic A53T αS Tg nTg мышей и. Вестерн-блот анализ показаны очищенного микросом связанные αS агрегатов, изолированных от трех больных (больных), presymptomatic (Дикт) и престарелых согласованной nTg мышей. Больной мышей, мышей Tg αS A53T, которые показывают мотор и неврологической дисфункции, включая накопление αS включений, в то время как presymptomatic животные являются здоровыми A53T αS Tgs 9 месяцев возраста, которые не показывают, но любой патологии αS связанных с фенотипом. nTg мышей являются однопометники больной мышей, которые не несут αS трансген и поэтому не развиваются αS индуцированные патологии. 1 мкг каждого очищенного фракций были работать на денатурируя SDS-Page, переведены на нитроцеллюлозную мембрану и смыты с Syn-1 или pSer129-αS антител. Только микросом фракции изолированных от больных мышей содержится HMW моющих средств устойчивостью αS агрегатов, которые были фосфорилированных на Серин 129 и показал C- и N-терминальный усечения. Этот показатель был адаптирован от колла и др. 18. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Время зависимых индукции αS осаждения после отправления микросом связанные αS агрегатов. (A) иммунофлюоресценции первичного Нейроны гиппокампа относились с 1 мкг микросом связанные αS агрегатов фракций пуле из трех различных больной мышей. Нейроны были зафиксированы на 2 дня (2d), 1 неделя (1w) или 2 недели (2w) лечения и immunostained с syn303 (S303, 1: 1000), антител специфических для окисленной и агрегированы αS. Клетки были counterstained с DAPI. Конфокальный изображения были взяты с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа, 63 X цель. Шкалы бар = 50 µm. (B) количественный анализ общего fluorescence, после вычитание фона, было сделано с помощью плагина фото частицы J образа программного обеспечения. Значения были нормализованы на количество ядер в поле (DAPI count) и выраженное в процентах S303 флуоресценции сигнала на 2D. Значения даны как среднее ± SD (n = 5). ** p < 0,001, *** p < 0,00001, односторонним ANOVA, после чего пост hoc тест Фишера ЛСД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . ΑS внутриклеточных включений colocalize с корковой невритов сети. Представитель конфокальный изображения корковых нейронов относились с микросом связанные αS агрегатов, полученных от больных Tg мышей. После 2 недель лечения нейронов были фиксированной и двойной витражи с агрегатов специфические антитела [S303 (A, B) или pser129-αS, 1:1,000 (C)] и neurite маркеры [αS мыши, 1: 200 (A, B) или Тау, мэм (C)]. Совместной маркировки флуоресцентные сигналов продемонстрировал частичного совместного локализации новообразованной αS шарик подобных структур с невритов сети. Иногда αS включений накапливаются в нейрональных Сома (A, B, стрелок). Сложены изображения были приобретены с помощью лазера, сканирование конфокального микроскопа, 63 X цель. Шкалы бар = 50 мкм. Эта цифра была изменена от колла и др. 20. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Неоптимальный количество микросом связанные αS агрегатов является токсичным для нейронов. DAPI пятнать нейронов, относились с увеличением концентрации микросом связанные αS агрегатов приводит к гибели клеток. (A) корковых нейронов относились с 1, 2 мкг микросом связанные αS агрегатов, извлеченные из больной мышей или только буфер, который не содержит агрегатов (B) и витражи с DAPI. Флуоресцентного изображения были приобретены с epi флуоресцентным микроскопом с помощью 20 X цель. Шкалы бар = 100 µm.(B) DAPI-положительных клеток были подсчитаны с помощью программного обеспечения J изображения. График показывает уменьшение числа ядер с увеличением концентрации микросом связанные αS агрегатов, добавлены в нейрональных СМИ. Значения выражаются в виде % b и даются как среднее ± SD (n = 5), *** p < 0,0001, односторонним ANOVA, после чего пост hoc тест Фишера ЛСД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Мы описал метод, чтобы получить формирования αS включений в мозга, полученных первичных нейрональных культур от WT мышей, путем добавления очищенный микросом связанные αS агрегатов, изолированный от αS Tg животных моделей.
Важнейшие шаги этого протокола являются следующие: соотношение мкг микросом связанные αS агрегатов/нейронов и источник αS агрегатов. Как видно из результатов сессии, важно оптимизировать соотношение мкг микросом связанные αS агрегатов/количество нейронов, поскольку работа в неоптимальных условиях может привести к преждевременной клеточной гибели или слишком скудные внутриклеточных агрегации (см. Представитель раздел результаты). Из-за этого очень важно оценить плотность нейронов культуры в DIV 7 (показано на рис. 1) перед началом лечения. Кроме того αS агрегатов должны очищаться от больной αS Tg мышей, т.е. от животного моделей, которые аккумулируют LB-как включений характеризуется фосфорилированных и стиральный порошок нерастворимые αS HMW фибриллами.
Возможные изменения в этот протокол связи ткани, замороженные или свежие, от которого микросом могут быть изолированы и начальной суммы. Хотя мы использовали мышей SpC ТГ за высокое содержание нерастворимых агрегатов αS, протокол подходит для изоляции агрегатов микросом связанные с любых тканей, условии, что площадь имеет высокое содержание в αS агрегатов. Замороженных образцов также может использоваться, так как замораживание не влияет на шаги очистки микросом связанные агрегаты или агрегаты per se. Хотя рекомендованные начальный вес для тканей около 100-150 мг, этот протокол предназначен для получения микросом от как низко как 50 мг сырья (без ограничения максимального веса). Однако, в случае сумма меньше, чем 100 мг, соответствующие гомогенизации соотношение будет 1:20 (w/v) для того чтобы иметь по крайней мере 1 мл супернатанта S10 для загрузки на бутылке поликарбоната для ультрацентрифуга осадков. В самом деле загрузка тома меньше, чем 1 мл может привести к распада трубки и образец потери. Увеличение объема гомогенизации приведет к более разбавленного супернатанта, но концентрация микросомальной Пелле, останется неизменным.
Ограничение этого протокола касается неэффективных кросс сидинга в формировании αS включений, которые недавно сообщалось в случае отправления αS PFFs человеческого происхождения для мышиных нейрональных культур вместо мыши αS PFFs24. Поскольку увеличение количества экзогенных αS фибрилл уделено мышиных культур можно обойти эту проблему, мы рекомендуем тонко настраивать количество связанных микросом агрегатов в случае отправления фибрилл, полученные от других вариантов αS или из разных видов мыши нейрональных культур, чем то, что мы описали.
Экзогенных αS агрегатов, добавлен в культуре средств массовой информации могут быть из разных источников. В пробирке αS PFFs ранее использовали как посевной шаблон внутриклеточных αS агрегатов в клеточных культурах и первичных нейронов, Животные модели3,,78,15. По сравнению с нашим методом, где микросом связанные αS агрегаты могут быть изолированы в несколько часов, формирование PFFs длительный и трудоемкий, требующий несколько шагов очищения, следуют дополнительные анализы для проверки что αS агрегатов confomations25 . Кроме того, PFFs, получаемых от бактериальных выразил человека или мыши αS, типичный эукариот, т.е. не хватает Посттрансляционная модификации могут представлять различные конформации, с патогенными свойствами и выборочный посева согласно протоколы нуклеации последовал (т.е. ленты против фибриллами)5,8 приводит к разным результатам и выводам. Вместо этого единой администрации в естественных условиях очищенной αS агрегатов гарантирует передачу более аутентичные патогенных шаблонов, тесно имитирует процесс формирования αS включений в животных моделях и PD пациентов.
Как будущее применение этой техники мы считаем, что этот протокол может успешно использоваться для изолировать αS патогенных семена от мозга PD больных или других αS Tg животных моделей, условии, что больной области, из которого изолированы микросом богаты αS включений.
Насколько нам известно это первый метод, который позволяет очистки токсичных видов αS в vivo PD моделей для использования в качестве заполнения шаблона для получения формирования αS включений в первичной нейронов.
Мы считаем, что этот метод является чрезвычайно гибким и может обеспечить уникальное на основе ячеек модель для изучения различных аспектов αS агрегирования и его влияние на клетки патофизиологии. Поскольку формирование αS включений представляют собой сложный процесс, который был трудно воспроизвести в культивируемых клеток, мы надеемся, что эта модель будет обеспечивать большие идеи в острой патогенетических механизмов, трудно определить в хронические и более сложные системы, такие как Животные модели.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа подкрепляется итальянского министерства университета и исследования (MIUR) через схему Грант карьеры реинтеграции (RLM программа для молодых исследователь) и от Scuola Normale Superiore. Мы благодарим профессор Майкл ли от университета штата Миннесота, США, за предоставление ОТР человека A53T αS Tg мышей, которые изолированы агрегатов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
