Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في ايليجانس كاينورهابديتيس

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College/CUNY

Summary

هذا البروتوكول يوضح كيفية تعقب إزفاء بروتين النووي تحت الإجهاد الحراري باستخدام بروتين انصهار بروتين (بروتينات فلورية خضراء) فلورية خضراء كعلامة 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وتلطيخ. DAPI تلطيخ البروتوكول بسرعة ويحافظ على إشارات التعريب سوبسيلولار البروتين والتجارة والنقل.

Abstract

في هذا البروتوكول، بروتين انصهار بروتين (بروتينات فلورية خضراء) فلورية خضراء و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تلطيخ تستخدم لتعقب التغييرات التعريب سوبسيلولار البروتين؛ على وجه الخصوص، يؤكد إزفاء نووية تحت حرارة الشرط. تتفاعل البروتينات إشارات في المقابل إلى الخارجية والداخلية. إنشاء إليه مشتركة لتغيير به التعريب سوبسيلولار. توضح هذه المقالة بروتوكول لتتبع البروتين التعريب التي لا تتطلب جسم أو وضع العلامات المشعة أو مجهر [كنفوكل]. في هذه المقالة، يتم استخدام بروتينات فلورية خضراء للوسم أكسل-1 البروتين المستهدف في C. ايليجانس، عضو الأسرة كلوريد البروتينات (كليكس) قناة داخل الخلايا، بما في ذلك CLIC4 الثدييات. خط المعدلة وراثيا متعدية متكامل أكسل-1::gfp (مع أحد المروجين وتسلسل جين كامل) أنشئت γ-الإشعاع والتحول، وثابت يعبر عن الجينات و التجارة والنقل. وأظهرت البحوث التي أجريت مؤخرا أن أكسل 1::GFP عند الإجهاد الحراري، عدم الأكسدة، يتراكم في النواة. تداخل إشارة بروتينات فلورية خضراء مع هيكل النوى و DAPI إشارات تؤكد التغييرات التعريب سوبسيلولار أكسل-1 تحت الضغط. هذا البروتوكول يقدم طريقتين تثبيت مختلفة لتلوين DAPI: التثبيت الإيثانول والاسيتون التثبيت. البروتوكول المصبوغة DAPI الواردة في هذه المادة بسرعة وكفاءة ويحافظ على إشارة بروتينات فلورية خضراء والتغييرات التعريب سوبسيلولار البروتين. هذا الأسلوب يتطلب إلا مجهر الأسفار مع نومارسكي وعامل تصفية فيتك وعامل تصفية DAPI. ومناسبة لإعداد مختبر صغير والبحث الجامعي والبحوث طالب مدرسة ثانوية وفصول دراسية في مجال التكنولوجيا الأحيائية.

Introduction

تغيير التعريب سوبسيلولار البروتين إليه مشتركة استجابة لإشارات داخلية أو خارجية مثل الإجهاد الحراري، والمجاعة، والأكسدة، المبرمج، الفسفرة البروتين وغيرها. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد الحراري عضو فوكسو DAF-16 النووية إزفاء1،2، والبروتين BCL-2 برو-apoptotic محاولة translocates إلى الميتوكوندريا عند وفاة تلقي الإشارات3،4. وتتوفر تقنيات مختلفة للكشف عن هذه التغييرات. مزيج من النشاف الغربية وعزل المتحلل هياكل سوبسيلولار (مثلاً، الميتوكوندريا أو الأنوية) يمكن أيضا تحقيق الهدف3. بيد أنه يتطلب جسم معين ضد بروتين الفائدة. وهكذا، يصبح جسم راسخة مفتاح النجاح. نهج بديل يتمثل في تسمية مختلف الهياكل سوبسيلولار أو العضيات مع علامات مختلفة مثل مشري والأسفار الصفراء البروتين (يفب)، البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) والبروتين الأحمر الفلورية (RFP)، وفي الوقت نفسه تسمية البروتين من الفائدة مع علامات أخرى. ثم، مراقبة لهم تحت مجهر [كنفوكل] إلى ترجمة أهداف5،6. النظائر المشعة خيار بديل لوسم البروتينات المستهدفة وثم كشف عن التعريب سوبسيلولار7. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب التدريب السليم والتعامل مع النفايات المشعة. تحت ظروف مثل الافتقار إلى جسم معين، وعدم وجود علامة السليم، أو [سكرسنس] معدات مثل مجهر [كنفوكل]، يحتاج نهج بديل النظر. لتحديد إزفاء بروتين النووي، أنها جذابة لتسمية البروتينات المستهدفة فقط مع علامة ووصمة عار الأنوية مع الكاشف الكيميائي 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) منذ هذا يتطلب إلا مجهر الأسفار عادية.

إيمونولابيلينج C. ايليجانس مع الأجسام المضادة صعبة بسبب نفاذية منخفضة قشر البيض أو بشرة collagenous المحيطة بالحيوان. وفي الوقت نفسه، نظراً للبروتينات C. ايليجانس متباينة إلى حد كبير من تلك أورثولوجس الفقاريات، تقديم عدد قليل من الشركات التجارية C. ايليجانس بمنتجات محددة. من الصعب لمختبر صغير لتوليد الأجسام المضادة C. ايليجانس لأنفسهم. الباحثين في المجتمع غالباً ما تستخدم البروتينات المعلمة كعلامات لإظهار تعبير بروتين التعريب أو الجينات. يستخدم هذا المقال أكسل 1::GFP كمثال لتعقب إزفاء بروتين النووي تحت ضغط الحرارة8. متعدية الجنسيات متكامل أكسل 1::gfp في جينوم الحيوان يستخدم ستابلي التعبير عن الجينات مع الانصهار بروتينات فلورية خضراء . وأظهرت الأبحاث أن أكسل-1 هو المعرب عنها في الأمعاء وجدار الجسم العضلات وغيرها من الهياكل سوبسيلولار8. هذا البروتوكول يوضح كيفية مزامنة الديدان إلى المرحلة الرابعة اليرقات (L4)، أداء الإجهاد الحرارة التجربة، وسلوك تلطيخ DAPI، تثبيت الإيثانول والاسيتون التثبيت، وتصوير تحت مجهر فلورية عادية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الحلول

  1. لوحات NGM
    1. في قارورة Erlenmeyer ل 2، إضافة 3 غرام من كلوريد الصوديوم، ز 17 من أجار، 2.5 g من ببتون، ومل 975 درهم2سين غطاء فم قارورة مع رقائق الألومنيوم. اﻷوتوكﻻف قارورة للحد الأدنى 50 بارد عليه لمدة 20 – 30 دقيقة.
    2. قم بإضافة حلول المعقم: 1 مل كاكل م 12، 1 مل 5 ملغ/مل الكولسترول في الإيثانول، 1 مل 1 م MgSO4، و 25 مل م 1 مشرف4 (pH 6.0) المخزن المؤقت. دوامة والحلول لمزجها جيدا.
    3. استخدام موزع سائلة، الاستغناء عن حل NGM لوحات بيتري 60 ملم. تعبئة كامل لوحات 2/3 لاجار. تخزينها في حاوية الغلق عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  2. 1 M مشرف4 المخزن المؤقت (pH 6.0)
    1. حل 10.83 ز خ2ص4 و 3.56 ز ك2هبو4 في dH2س، ثم ضبط الحجم الكلي إلى 100 مل. اﻷوتوكﻻف الحل لمدة 15 دقيقة.
  3. M9
    1. حل ز 3 خ2ص4، ز 6 غ2هبو4و 5 غ من كلوريد الصوديوم في dH2س، أضف 1 مل من 1 م MgSO4، وضبط الحجم الكلي للأم 1
  4. DAPI 10 ميكروغرام/مل
    1. أضف 1 ميليلتر من 10 ملغ/مل DAPI إلى ميليلتر 999 درهم2o.
  5. كحول 95% (v/v)
    1. قياس 95 مل كحول 100% وإضافة الماء المقطر ضبط حجم الصوت إلى 100 مل.
  6. الأسيتون 30% (v/v)
    1. إضافة 30 مل الأسيتون إلى dH2س وضبط الحجم الكلي إلى 100 مل.

2. الإجهاد الحراري

  1. إنشاء خط صفيف اكستراتشروموسومال مع بنية متعدية الجينات الهدف9،10. وبدلاً من ذلك، الحصول على هذه الخطوط من مركز كاينورهابديتيس علم الوراثة (كجك)، الذي من موارد عامة للبحوث C. ايليجانس ، أو من مختبر أبحاث منشورة سابقا.
  2. دمج الخطوط اكستراتشروموسومال في الجينوم بتعريض الديدان ل الإشعاع γ راد 3,8009. ثم، حدد أسطر ستابلي أعرب حيث أن كل الحيوانات وتعرب عن بروتين علامة مثل التجارة والنقل أو الاسطوانة.
  3. لإزالة الطفرات التي تم إنشاؤها أثناء الإشعاع، التهجين خطوط على الأقل 2 x. استخدام هذا الخط المحورة وراثيا للكشف عن التغييرات نمط التعبير البروتين تحت الضغط.
  4. إعداد لوحات دودة NGM كما هو موضح في الخطوة 1، 1. متتالية استنساخ OP50 والثقافة البكتيريا في السائل LB مرق بين عشية وضحاها. بذور الثقافة لوحات NGM مع OP50 السائلة واحتضان اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أن ينمو حشيش بكتيريا كمصدر لغذاء للديدان. أن تهدئة اللوحات في درجة حرارة الغرفة على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  5. تنمو السطر المعدلة وراثيا في 20 درجة مئوية دون المجاعة على الأقل 2 أجيال قبل فحص الإجهاد الحرارة.
  6. اختيار 8 – 10 صغار البالغين جرابيد (الرحم مليئة بالبيض) إلى لوحة دودة جديدة، ثم السماح لهم وضع البيض لحوالي 3-5 ح وإزالة جميع البالغين من اللوحات.
  7. لمزامنة الديدان، اسمحوا البيض تفقس وتنمو اليرقات لما يقرب من 48 ساعة إلى المرحلة الرابعة (L4) اليرقات. دراسة هيكلها الفرج (بنية هالفمون) لتحديد المرحلة (الشكل 1)، السهم) L411.
  8. وضع لوحات الدودة مع اليرقات L4 في حاضنة 35 درجة مئوية ح 2 – 5 تحقيقا للإجهاد الحراري. وضع مقياس حرارة في الحاضنة لقياس درجة الحرارة بدقة.

3-DAPI تلطيخ

  1. تثبيت الإيثانول
    1. إضافة 10 ميليلتر من المخزن المؤقت M9 في وسط شريحة الزجاج.
    2. اختيار الديدان صدمة الحرارة من الخطوة 2.8 ووضعها في المخزن المؤقت M9 على الشريحة الزجاجية.
      1. وبدلاً من ذلك، يغسل اللوحة مع M9 والطرد المركزي أنه في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية. إضافة الديدان إلى الشريحة الزجاجية.
    3. استخدام أنسجة لينة لاستنزاف أي سائل الزائدة. مشاهدة هذه الخطوة تحت مجهر تشريح.
    4. إضافة 10 ميليلتر من الكحول 95% على الديدان والسماح لهم بالهواء الجاف. مشاهدة العملية تحت مجهر تشريح، ولا تدع الحيوانات الحصول على الجاف للغاية. فورا بعد الإيثانول قد تبخرت من الحيوانات، تابع إلى الخطوة التالية.
      ملاحظة: الإيثانول يتبخر بسرعة كبيرة.
    5. كرر الخطوة 3.1.4 مرتين حيث أن الديدان هي ثابتة.
      ملاحظة: من الطبيعي للحيوانات لتبدو أكثر قتامة ومشوهة.
    6. إضافة 10 ميليلتر من DAPI (10 ميكروغرام/مل) للديدان. غطاء لهم ساترة على الفور وختم الشريحة مع جل طلاء الأظافر الشفاف.
    7. عرض الحيوانات بعد حوالي 10 دقيقة في مجهر الأسفار.
  2. تثبيت الأسيتون (نهج بديل)
    1. يغسل لوحة صدمة الحرارة من الخطوة 2.8 مع M9 والطرد المركزي أنه في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية. أغسل بيليه مع 1 مل من dH2س وجمع بيليه، وتجاهل المادة طافية.
    2. إضافة 400 ميليلتر من الأسيتون 30% عن 15 دقيقة للطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية. استخدم ميليلتر 500 درهم2س لغسل الحيوانات 2 x. تجاهل المادة طافية.
    3. إضافة 200 ميليلتر من DAPI (10 ميكروغرام/مل)، أو 4 × حجم الديدان مجموع، في أنبوب لمدة 15 دقيقة.
    4. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية. أغسل بيليه 2 x مع ميليلتر 500 درهم2أولمبيك وضع الديدان على الشرائح الزجاجية وغطاء لهم مع كوفيرسليبس وختم الشريحة مع جل طلاء الأظافر شفافة ومراقبة الحيوانات تحت مجهر الأسفار.

4-المجهري التصوير

  1. قم بتشغيل مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ومجهر الأسفار. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر متصلاً بالمجهر.
  2. تحميل الشريحة المجهر الأسفار. استخدام عدسة هدف طاقة منخفضة (10 X) لتحديد موقع الديدان، وزيادة قوة التكبير إلى 400 X، والتركيز على العينة.
  3. فتح البرامج المتوفرة مع المجهر. انقر على "شراء" في القائمة؛ انقر فوق "الكاميرا" وحدد الكاميرا متصلة بالمجهر؛ وهذا ما يسمح الكاميرا المختارة للتواصل مع البرنامج.
    ملاحظة: قد تختلف مجاهر مختلفة في العملية.
  4. تحت نفس "حيازة" وانقر على "شراء متعددة الأبعاد". وهذا يفتح نافذة ملاحة "اقتناء متعددة الأبعاد" جديدة. انقر فوق الزر "المتعددة"، وسوف تظهر جميع القنوات المتاحة.
  5. اختر اللون الأزرق والأخضر DIC (التباين التدخل التفاضلية) لمراقبة العينة. في الإطار التنقل "اقتناء متعددة الأبعاد"، ترك في "الأزرق-DAPI" "الأخضر-التجارة والنقل" و "غراي-دبي"، قنوات "نومارسكي"؛ انقر بالزر الأيمن على قنوات أخرى، مثل "الأحمر-والرودامين" و "حقل أبيض مشرق"، لإغلاقها.
  6. أولاً، قياس زمن التعرض لكل قناة:
    1. Left-click القناة "الأزرق-DAPI" لتحديده ثم انقر فوق "مقياس" من أجل التقاط صورة حية تحت القناة DAPI مع وقت التعرض الآلي. سوف تظهر نافذة جديدة مع صورة حية.
    2. على الجانب الأيسر من إطار الصورة الحية، يدوياً ضبط وقت التعرض إذا لزم الأمر لجعل الصورة كما هو مطلوب.
    3. وأخيراً، انقر على ''موافق "في نافذة الصورة الحية. يؤدي هذا إلى تعيين وقت التعرض تحت القناة DAPI.
  7. كرر الخطوة 4، 6 قنوات أخرى، "أخضر-التجارة والنقل" و "غراي--مدينة دبي للإنترنت"، "نومارسكي"، إعداد أوقات التعرض لتلك القنوات.
  8. في الإطار التنقل "اقتناء متعددة الأبعاد"، انقر فوق "ابدأ" لجمع الصور 3 تحت 3 قنوات مختلفة في النظام (انظر أعلاه) مع أوقات التعرض المحددة كمجموعة تلقائياً.
  9. لحفظ الملف، انتقل إلى القائمة الرئيسية، انقر على "ملف" ثم على "حفظ باسم". إدخال اسم الملف واسم المجلد. حفظ الملف كتنسيق ملف افتراضي للحفاظ على معلومات التصوير مفصلة للرجوع إليها في المستقبل.
  10. لتصدير الملف بتنسيقات أخرى:
    1. الذهاب إلى "ملف" ثم انقر فوق "تصدير". سيؤدي هذا إلى فتح نافذة إعدادات تصدير.
    2. تعيين اسم الملف والمجلد. تحقق من "إنشاء مجلد مشروع" لأفضل تنظيم البيانات. البرنامج أيضا يسمح للمستخدم بتحديد خيارات أخرى 4: "إنشاء دمج الصور"، "استخدام الألوان للصور لقناة"، "استخدام أسماء قناة"، و "الصورة ممزوج فقط".
    3. اختر نوع ملف المطلوب من القائمة المنسدلة، مثل "معرض طرابلس" و "السجناء"، "مديرية الأمن العام"، أو "JPG" وأنواع أخرى. ثم انقر فوق "ابدأ" للتصدير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كلوريد قناة داخل الخلايا البروتينات (انقر) هي بروتينات متعددة الوظائف التي هي الغاية حفظت عبر الأنواع12. ويبين الكثير من البحوث أن كليكس تنظيم الإجهاد الخلوية، أوتوفاجي، المبرمج، التسرطن، والأوعية، والاستجابة المناعية الفطرية بلعم في نظام الثدييات13،،من1415،16 ،17. هناك اثنين انقر homologs في C. ايليجانس: أكسل-1 و exc-4. وأظهرت الدراسة الأخيرة أن أكسل-1 تنظم إدارة الإجهاد الحيوانية8. ونحن إدماج بناء متعدية أكسل 1::gfp جينوم الحيواني وإنشاء خطوط المعدلة وراثيا، والتي ستابلي التعبير عن الجينات أكسل-1 مع بروتينات فلورية خضراء كعلامة (الشكل 2 ألف و 2 باء). تحت الإجهاد الحراري، يتراكم أكسل 1::GFP في النواة في المنطقة المعوية نظراً لإشارة بروتينات فلورية خضراء قوية يتراكب مع هيكل النواة (الشكل 2-ج-ه). للتأكد من الترجمة سوبسيلولار، DAPI تلطيخ استخدمت كنهج لوصمة عار الأنوية. استخدام الإيثانول تثبيت DAPI المصبوغة يظهر واضحا الأنوية في جسم الحيوان (الشكل 3B). التثبيت الأسيتون أيضا تحقق نتائج مماثلة (الشكل 3E). تداخل الإشارات بروتينات فلورية خضراء و DAPI تأكيد أن أكسل 1::GFP المتراكمة في الواقع في الأنوية في المنطقة المعوية (الشكل 3، و).

Figure 1
الشكل 1: مرحلة الصور رابعة اليرقات (L4) C. ايليجانس تحت قوي تكبير مختلفة. (أ) 63 X و X 115 من (ب) و (ج) 400 X التكبير السلطة. تشير الأسهم إلى الفرج من دودة L4؛ ملاحظة بنية هالفمون. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في جميع الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحت الإجهاد الحراري، يتراكم أكسل 1::GFP في نواة الأمعاء. (أ) صورة نورماسكي من منطقة الأمعاء قبل صدمة الحرارة. (ب) لوحظ إشارة قوية بالتجارة والنقل في منطقة إينستيستينال قبل صدمة الحرارة. (ج) صورة نورماسكي من المنطقة المعوية بعد صدمة الحرارة (نقطة الأسهم إلى النواة لمنطقة الأمعاء). (د) إشارة قوية بالتجارة والنقل يتراكم بعد صدمة الحرارة. (ﻫ) تداخل الصورة للتجارة والنقل ونورماسكي. وتؤخذ جميع الصور مع قوة التكبير X 400. شريط المقياس = 50 ميكرومتر في جميع الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أكسل 1::GFP النووية إزفاء يتأكد تلطيخ DAPI. (أ-ج) استخدام الإيثانول التثبيت لتلطيخ DAPI. (د-و) باستخدام التثبيت الأسيتون لتلطيخ DAPI. في ألف و دال، يظهر اللون الأخضر إشارة التجارة والنقل في المنطقة المعوية. في باء و هاء، يظهر اللون الأزرق الأنوية تلطيخ DAPI. ج وو إظهار الصور المتداخلة للتجارة والنقل، و DAPI ونورماسكي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر في جميع الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الرقم: التثبيت الأسيتون يحتفظ بالعينة و 60 يوما بعد التثبيت الأسيتون، إشارات بروتينات فلورية خضراء و DAPI لا يزال يمكن ملاحظتها. (أ) الأخضر للتجارة والنقل. (ب) الأزرق للإشارة DAPI. (ج) تداخل الصورة للتجارة والنقل، و DAPI، ومدينة دبي للإنترنت. وتؤخذ جميع الصور تحت 400 X التكبير السلطة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه المقالة طريقة سريعة وفعالة للتحقق من التغييرات البروتين سوبسيلولار من السيتوبلازم إلى النواة. وأبدى تعبير البروتين بدمج التجارة والنقل، بينما تم التحقق من بنية نواة طريق DAPI تلطيخ (الشكل 3). منذ إيمونوستينينج C. ايليجانس البروتينات التحدي، معظم C. ايليجانس البروتين تعريب سوبسيلولار تتميز بوضع علامات عليها مع البروتينات علامة مثل التجارة والنقل، لآز، مشري، وآخرون،من1819 , 20 , 21-في هذه المادة، واستخدمت بروتينات فلورية خضراء للوسم الجينات المستهدفة أكسل-1 بغية إظهار التعريب الخلوية البروتين. لتأكيد التعريب النووي، استخدمت تلطيخ DAPI. وعرضت اثنين من الأساليب البديلة لتلطيخ DAPI. سواء أظهرت كفاءة نواة قوية في الديدان داخل إطار الزمني عمل لائق (أقل من 1 ح). تثبيت الإيثانول مناسبة لجمع عينة صغيرة مثل مراقبة جودة (جمع الديدان أقل من 50). منع الديدان من التجفيف تماما هو المفتاح. عندما يتبخر الكحول 95% من الديدان، تابع إلى الخطوة التالية فورا. تثبيت الأسيتون مناسب لجمع عينة واسعة النطاق مثل تحليل الكمي (جمع ما يزيد على 50 من الحيوانات). ومع ذلك، بسبب عدة خطوات الغسيل العينة، ستفقد بعض العينات. وهكذا، فإنه ينصح بشدة إزالة المادة طافية بعناية والاحتفاظ بها الديدان أكبر عدد ممكن. بمجرد أنها مختومة، يمكن تخزين الشرائح الناتجة عن تثبيت الأسيتون لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية.

ويمكن تعديل هذا البروتوكول للبروتينات الأخرى ذات الأهمية لتعقب التغييرات التعريب سوبسيلولار. بالإضافة إلى الإجهاد الحراري المعروضة هنا، يمكن تقييم فحوصات التوتر الأخرى، مثل الأكسدة وإجهاد المعادن الثقيلة، والقيود الغذائية وغيرها. يمكن أيضا دراسة البروتين التعريب سوبسيلولار التغيير عن طريق تغيير الخلفية الوراثية لبروتين الفائدة. على سبيل المثال، يمكن عبروا الخط المعدلة وراثيا إلى الخلفية متحولة مختلفة ل، حيث أنه يمكن تحديد التفاعل الوراثية الرواية. يمكن أيضا تطبيق تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) نهدم جينات محددة والتحقيق في تغيير التعريب سوبسيلولار البروتين الناتج عن ذلك. هذه التطبيقات من الفائدة العالية لتحديد مكونات تنظيمية جديدة. لبروتين غير معروف، ظروف تجريبية مختلفة ينبغي اختبار، مثل تركيزات كاشف الاختبار، مدة وقت الإجهاد، ومرحلة معينة من الديدان. لقد حاولنا في دراستنا، مدد مختلفة، من 30 دقيقة إلى 5 ساعات، ودرجات الحرارة المختلفة الإجهاد. صدمة حرارة على 35 درجة مئوية ح 3 يبين بوضوح إزفاء بروتين النووي.

تطبيقات إضافية لتلطيخ DAPI تشمل دراسة عملية الانقسام الاختزالي والانقسام في الديدان، ولا سيما في germline الخلايا22،،من2324،25، وإحصاء لعدد الأنوية في الوراثية المسخ خلفية20،،من2627.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.

Acknowledgments

وتم الحصول على سلالات C. ايليجانس المستخدمة في هذه الدراسة من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس، الذي يدعمه "المعاهد الوطنية للصحة"-مكتب برامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة: 1R03AG048578-01 يونيو ليانغ، جامعة مدينة نيويورك-ككرج 1501 إلى يونيو ليانغ، ومجلس السلام والأمن-جامعة مدينة نيويورك 66184-00 44 و 45 67248-00 إلى يونيو ليانغ. ونحن نشكر كاثي سافاج--دان يرجى تقاسم الفضاء المختبر لها. وقد جمعت جميع الأسفار الصور في "المرافق الأساسية كلية كوينز". ونحن نشكر وليام ج. رايس لتعليقاته على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).

Tags

علم الأحياء، العدد 137، الإجهاد الحراري، تغيير التعريب سوبسيلولار، تعريب النووية، البروتينات الفلورية الخضراء، وتلطيخ DAPI، التثبيت الإيثانول، الأسيتون التثبيت
الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في <em>ايليجانس كاينورهابديتيس</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. … More

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter