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Article de méthode

Intraveineuse amniotique et In Utero une Transplantation chez le modèle murin

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DOI :

10.3791/58047

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9 octobre 2018

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1Division of General, Thoracic, and Fetal Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia, 2Division of Plastic Reconstructive Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole permettant d’effectuer une transplantation in utero (IUT) par voies intraveineuse et amniotique d’injection dans le modèle murin. Ce protocole peut être utilisé pour introduire des cellules, vecteurs viraux et autres substances dans l’environnement unique de tolérance immunitaire fœtal.

Résumé

In utero transplantation (IUT) est un mode de thérapie qui peut être utilisé pour introduire des cellules souches, vecteurs viraux ou toute autre substance au début de la gestation unique et polyvalent. La logique de l’IUT à des fins thérapeutiques est issue de la petite taille du foetus, l’immaturité immunologique fœtale, l’accessibilité et la nature proliférative des cellules souches ou progénitrices foetales et le potentiel pour traiter une maladie ou l’apparition des symptômes avant la naissance. Profitant de ces propriétés du développement normales du foetus, la livraison de cellules souches hématopoïétiques (CSH) via un IUT a le potentiel pour traiter des troubles hématologiques congénitales comme la drépanocytose, sans le besoin myéloablatif ou immunosuppresseur conditionnement nécessaire pour les greffes de CSH postnatal. De même, l’accessibilité des cellules progénitrices dans plusieurs organes au cours du développement potentiellement permet un ciblage plus efficace des cellules souches/progénitrices après un IUT de vecteurs viraux de thérapie génique ou la modification du génome. En outre, IUT peut être utilisé pour étudier les processus de développement normales y compris, mais sans s’y limiter, le développement de la tolérance immunologique. Le modèle murin fournit un moyen précieux et abordable pour comprendre le potentiel et les limites de l’IUT avant des gros animaux études précliniques et une éventuelle application clinique. Nous décrivons ici un protocole permettant d’effectuer un IUT dans le fœtus murin par voies intraveineuse et amniotique. Ce protocole a été utilisé avec succès pour élucider les conditions nécessaires et les mécanismes à l’origine dans l’utérus la transplantation de cellules souches hématopoïétiques, induction de la tolérance et dans l’utérus la thérapie génique.

Introduction

Les progrès récents dans le diagnostic et le dépistage prénatal ont mis en lumière la possibilité de traiter le fœtus pour un certain nombre de troubles congénitaux qui ne pas avoir les options de traitement postnatal adéquat et entraîner une morbidité et mortalité. Plus précisément, dans l’utérus de transplantation de cellules souches hématopoïétiques (IUHCT) et d’édition de thérapie/génome gène ont le potentiel pour profiter des propriétés du développement normales du foetus pour traiter congénitale hématologique, immunitaires et génétiques les troubles de manière plus efficace que la greffe de CSH postnatal et édition de thérapie/génome gène peuvent faire1,2. Plus précisément, en raison de la petite taille du foetus, la cellule du donneur ou la dose de vecteur viral peut être agrandie par le poids du destinataire. En outre, l’immaturité immunitaire du foetus permet de donateurs CSH à doser sans myéloablatif et immunosuppresseurs conditionnement qui est requise dans protocoles greffe postnatal. De même, les vecteurs viraux transportant un transgène thérapeutique ou la technologie d’édition du génome peuvent être injectés sans une réponse immunitaire limitante le produit transgénique ou le vecteur viral. Enfin, l’accessibilité et la nature proliférative des cellules souches/progénitrices foetale s’offrir la possibilité d’une transduction plus efficace des cellules progénitrices de cibles, ainsi que certains modes de génome édition (axés sur l’homologie réparation) qui nécessitent de cyclisme cellules se produire efficacement. Le modèle murin constitue un moyen perspicace et abordable pour répondre à des questions importantes dans la biologie des cellules souches et immunologie avant d’expérimenter dans des modèles animaux grands précliniques et, à ce titre, a été le modèle primaire dans laquelle IUHCT et dans l’utérus la thérapie génique ont été explorés1,2,3.

Bien que de nombreuses variables jouent un rôle important dans le succès de IUHCT et dans l’utérus gene therapy/génome édition dans des modèles murins et grands animaux, une variable-clé est la méthode de livraison des CSH ou des vecteurs viraux. La livraison de grandes quantités de donateur CSH avec un effet de premier passage dans le foie fœtal, les organes hématopoïétiques au moment de la IUHCT, s’est avérée être contribué à atteindre un niveau de prise de greffe dans les souris et les modèles animaux grands4 macrochimeric ,,5. Ceci a été réalisé via une injection de donateurs cellules via la veine vitelline chez la souris et via une injection intracardiaque dans le modèle canin. La voie d’injection joue également un rôle fondamental dans le ciblage des cellules progénitrices de différents organes au cours du développement. Par exemple, une injection intraveineuse par l’intermédiaire de la veine vitelline a été démontrée à transmettre efficacement les cardiomyocytes et hépatocytes suite à une fin de gestation injection6,7. Par ailleurs, une injection intra-amniotique de vecteurs viraux permet le ciblage des organes qui affleurent physiquement basés sur le pliage/développement embryonnaire au moment de l’injection de8. Ceci est mieux illustré par le ciblage de l’épithélium respiratoire via une injection intra-amniotique vers la fin de la gestation pour profiter de mouvements normaux foetale « breathing », qui expose les voies respiratoires au vecteur viral dans l’amniotique fluide de9. Ces deux modes de l’IUT, par voie intraveineuse via la veine vitelline et amniotique, ont servi de base à plusieurs des expériences passées et en cours dans notre laboratoire. Dans ce protocole, nous décrivons en détail les méthodes permettant d’effectuer par voie intraveineuse et amniotique IUT dans le modèle murin.

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Protocole

Les protocoles expérimentaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à hôpital le de Philadelphie enfants et d’institutionnels animalier.

1. création des Pipettes d’Injection

  1. À l’aide d’une verticale de micropipettes, tirez une pipette de microcapillaire 100 µL (Figure 1 a - 1C). Calibrer les micropipettes afin que l’extrémité effilée est > 1 cm de long.
    Remarque : Au début, les paramètres de l’extracteur doivent être ajustés pour une longueur optimale. Un réglage de chaleur plus élevé fera la pointe plus longue et un réglage de traction plus élevé rendra le diamètre de la pointe plus étroit.
  2. Coupez l’extrémité effilée afin qu’elle soit ≥ 1 cm de long. S’assurer que le diamètre intérieur à la pointe de l’aiguille est entre 70 µm et 100 µm et qu’elle est inversement proportionnelle à la longueur de l’extrémité effilée.
    NOTE : Le diamètre interne dépend aussi de l’étalonnage de la micropipettes. Reportez-vous aux instructions du fabricant de la verticale de micropipettes ou n’importe quel type d’extracteur préféré une micropipette.
  3. Après s’être assuré que l’aiguille est au bon diamètre interne, créer le biseau de 15-20 degrés de l’affûtage de la pointe avec une chanfreineuse micropipette avec un diamant affûtage roue (Figure 2 a - 2C). Veillez à reposer l’embout délicatement sur la roue sans trop de pression, à diminuer les chances de casser ou fendre l’extrémité.
    Remarque : Un pinceau peut être utilisé pour éliminer les saletés qui s’appuie sur la pointe de l’aiguille.
  4. Évaluer la pointe sous le microscope et faire en sorte que la pointe est ronde sans éclats ou fissures. Réévaluer le diamètre interne pour s’assurer que c’est entre 70 µm et 100 µm (Figure 2D - 2 H).
  5. Dessiner des lignes sur le reste de l’aiguille pour désigner 5 µL de volume entre eux (par exemple, aiguilles avec un diamètre intérieur de 1,3 mm devraient en lignes tracées par tranches de 3,77 mm).
  6. Autoclave le préalable d’aiguilles à utiliser dans la chirurgie et les manipuler avec des gants stériles.

2. in utero des Injections

  1. Préparer les nécessaires instruments par autoclavage leur avance. Inclure des instruments essentiels tels que le porte-aiguille de microinjector, un pilote aiguille chirurgicale, une paire de pince Adson, une paire de ciseaux courbes tissu ordinaire, une seringue de 1 mL insuline, un couple d’applicateurs de coton-pointe, une pipette de transfert, un tube conique de 50 mL et un Pack de sutures polyglactin 910 4-0.
  2. Utilisant une technique stérile, fixer l’aiguille sur le porte-aiguille et branchez-le sur le microinjector.
    Remarque : Les paramètres de l’azote comprimé utilisé sont comme suit : injecter 4 à 6 lb/po2, solde 0 lb/po2. Selon ce qui est injecté, plus précisément, la viscosité de l’injection de co-Set, ainsi que la taille de la micropipette, les temps d’injection varient entre 0,3 - 1,5 s.
  3. Nettoyer l’extrémité de l’aiguille de tout débris possible en tirant vers le haut de 5 à 10 µL de stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite de curage. Répétez ce x 2-3.
  4. Préparer des souris femelles enceintes de 2 à 6-mois pour la chirurgie en se rasant leur abdomen avec une tondeuse. Veillez à ne pas endommager les mamelons. Administrer les analgésiques par voie orale (par exemple, 100 µL de la suspension orale de 1,5 mg/mL meloxicam par souris).
  5. Commencez à remplir l’aiguille avec le matériau souhaité (cellules/vecteur/drogues) sur le volume souhaité. Veillez à ne pas briser la pointe de l’aiguille lors du remplissage de l’aiguille.
    Remarque : Le volume d’injection par foetus varie selon le protocole expérimental spécifique. 20 µL fonctionne bien pour les injecter un grand nombre de cellules (c'est-à-direjusqu'à 107 cellules, dans la veine vitelline. Par exemple, nous avons livré 1 x 107 toute la moelle osseuse des cellules isolées de C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 [« B6 Green Fluorescent Protein (GFP) "] souris via la veine vitelline dans gestationnel J14 foetus de souris Balb/c. Pour les injections de vecteur viral, une seule injection de 10 µL d’un vecteur dilué 1:1 avec du PBS fonctionne bien.
  6. Pour calibrer le temps d’injection, procédez comme suit.
    1. Appuyez sur le Mode bouton x 3 sur le microinjector pour accéder à l’écran de calibrage d’injection. Ajuster le temps d’injection en ajoutant des intervalles de 10 ou 100 ms et pousser le Mode bouton x 2.
    2. Appuyez sur le bouton Balance et appuyez une fois sur la pédale. Maintenant, appuyez à nouveau sur la pédale et évaluer combien volume est vidé de l’aiguille par pression. Si ne pas calibré pour le volume souhaité de 5-20 µL par pédale poussoir, répétez les étapes 2.6.1 et 2.6.2.
      Remarque : En règle générale, il est bon de calibrer chaque poussoir de livrer la moitié du volume total de cible à la fois. S’il est possible d’injecter plus de 30 µL ou même 40 µL du volume total, nous n’allons pas généralement plus de 20 µL par foetus, intraveineuse ou amniotique.
  7. Remplir l’aiguille jusqu’au niveau désiré.
  8. Commencer à livrer l’anesthésie à la souris en ajustant le débitmètre oxygène à 1 L/min et le vaporisateur isoflurane à 3 %.
  9. Confirmer si la souris est anesthésiée en vérifiant l’absence du réflexe pédale. Transférer la souris sur un coussin chauffant en position couchée.
  10. Appliquez le gel lubrifiant oculaire pour éviter la dessiccation cornéenne. Fixez la souris en place par du ruban adhésif les membres supérieurs et inférieurs au pad.
  11. Préparation de l’abdomen avec chlorhexidine gommage suivi d’alcool et d’injecter un anesthésique local (par exemple, 100 µL de bupivacaïne des 0,25 %) par voie sous-cutanée (Figure 3A).
  12. Avec des ciseaux, faire une incision cutanée de 1 à 2 cm de sorte que le bord inférieur est non moins de 1 cm de l’orifice vaginal ; le fascia sous est très mince et translucide.
  13. Identifiez la ligne médiane de l’aponévrose qui est plus transparente que la région environnante. Veillez à ne pas blesser les vaisseaux épigastriques qui se trouvent de chaque côté de la ligne médiane. Les vaisseaux épigastriques devraient se blessent, maintient la pression avec des applicateurs de coton-astuce pour arrêter le saignement.
  14. À l’aide de pince Adson, pincer le fascia sans attraper un des organes sous-jacents tels que les intestins, la vessie ou des foetus. Ouvrez le carénage avec des ciseaux, en veillant à ne pas endommager un des organes. Une fois en toute sécurité dans l’abdomen, de prolonger l’incision aponévrotique. S’il n’est plus que l’incision de la peau.
  15. Applicateurs de coton-Astuce permet de déplacer l’intestin dans la partie supérieure de l’abdomen, exposant ainsi l’utérus gravide. Livrer l’utérus hors de l’incision, identifier soigneusement les ovaires droit et gauche pour s’assurer que tous les fœtus sont comptés (Figure 3B).
  16. Remettre l’utérus gauche dans l’abdomen afin que seulement l’utérus droite est exposé ; Cela empêche le dessèchement de l’utérus et garde au chaud les foetus non injectées.
  17. Tenez le sac foetus/amniotique plus latéral entre le pouce et l’index des doigts de la main non dominante de l’opérateur (Figure 3C). Toujours être doux quant à ne provoque aucun dégât pour les foetus.
  18. Positionner le microscope de dissection (un grossissement de 10 X est idéal) et ajuster la mise au point afin que le fœtus est en vue. Régler l’éclairage pour une meilleure visualisation.
  19. Identifier la partie qui sera injectée (veine vitelline, amnios). Pour injections intraveineuses, visualiser les veines vitelline tant leur abouchement d’abord. Pour les injections intra-amniotique, orienter le fœtus avec la droite en vue.
  20. Rejoindre l’espace cible avec l’aiguille comme indiqué ci-dessous.
    1. Pour une injection intraveineuse, procédez comme suit.
      1. Faire pivoter l’utérus afin que la veine vitelline qui est en train d’injecter est parallèle à la pointe de l’aiguille ; n’oubliez pas que les injections doivent être accomplis dans l’anastomose des deux veines.
      2. Placez l’aiguille sur l’utérus à un angle de 5° et percer la paroi utérine. Maintenant que la pointe soit entre la paroi de l’utérus et la cavité amniotique, placez la pointe directement au sommet de la veine vitelline.
      3. À un angle presque tangentiellement, glisser l’aiguille sur la veine jusqu'à ce que le biseau perce et avance dans le vaisseau ; Cela est évident par un éclair de sang dans la pointe de l’aiguille (Figure 3D).
        Remarque : Accès à la veine peut prendre quelques essais que l’aiguille ne peut pas percer la veine avec la première glisse sur la veine.
    2. Pour une injection intra-amniotique, procédez comme suit.
      1. Tourner le sac amniotique et trouver un endroit dépourvu de vaisseaux pour percer.
      2. Pointer l’aiguille perpendiculairement à la paroi utérine et percer à travers l’utérus, le sac vitellin et puis le sac amniotique. Veillez à ne pas percer à travers les tissus fœtaux. Veillez à ce que l’aiguille s’est écoulé entre les membres, car cela confirme que l’aiguille est dans le sac amniotique. Puis procéder à l’injection.
  21. Injecter le volume approprié de matérial (habituellement 10-20 µL) en appuyant sur la pédale.
    NOTE : Parce que l’injecteur doit maintenir la visualisation de la pointe de l’aiguille à travers le microscope à tout moment, une seconde personne doit lire les marquages sur l’aiguille de quantifier la quantité injectée et d’informer l’injecteur combien volume qui reste à injecter. Une discussion avant l’injection entre l’injecteur et l’adjoint est importante pour éviter toute confusion et les retards. Ceci est particulièrement important pour les injections intraveineuses car une absorption retardée de l’aiguille permet un reflux du sang veineux dans l’aiguille et le résultat en une posologie inexacte.
  22. Retirer l’aiguille au site d’injection, une fois que le volume désiré est livré. Comme il peuvent y avoir des saignements de navire site avec injections intraveineuses de ponction, maintient la pression avec le côté de l’aiguille pendant 10 à 15 s arrêter le saignement.
  23. Passez à la prochain foetus. Continuez jusqu'à ce que tous les foetus de la corne utérine à droite ont été injectés.
  24. Enlever la corne utérine gauche de l’abdomen et remplacer la corne utérine à droite vers l’intérieur de la cavité péritonéale.
    Remarque : Parfois, l’aiguille doit être rempli avec la quelle.
  25. Une fois que tous les fœtus ont été injectés, remplacer l’utérus dans l’abdomen (Figure 3E). Veillez à éviter un volvulus utérin ou intestinal.
  26. Avec une pipette jetable, placer environ 2 mL de solution 1 PBS x dans l’abdomen pour remplacer toute perte insensible.
  27. Fermer le fascia et l’abdomen en une seule couche continue à l’aide de 910 sutures de polyglactin 4-0 pour ne pas blesser les organes sous-jacente lors de la fermeture (Figure 3F - 3 G).
  28. Enlevez le ruban et transférer la souris dans une cage sous une lampe chauffante. Veillez à ne pas mettre la lampe de chaleur trop près à la souris. Assurez-vous que la cage a literie, nourriture et eau.
    Remarque : Une chambre chaude thermostatée peut également être utilisée. La souris est réveillée quand il est debout et marche.
  29. Observer la souris tous les jours et de donner des médicaments contre la douleur selon les besoins.
    NOTE : Nous avons régulièrement donner meloxicam postopératoire jours 1 et 2 et parfois le jour 3 Si la souris montre des signes de douleur.
  30. S’agit d’une chirurgie de lot avec le même matériel d’injection, nettoyer l’aiguille d’injection avec du PBS stérile. Si en injectant un matériau différent, jeter l’aiguille dans un conteneur d’objets coupants et utiliser une aiguille Neuve.
    Remarque : Nous recommandons favorisant les chiots avec des mères porteuses immédiatement après la naissance, dans le cas où le barrage monte une réponse immunitaire aux anticorps quelle et transferts les chiots via lait maternel.

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Résultats

Survie et la greffe sont des mesures importantes de réussite pour les expériences IUHCT. Selon les paramètres spécifiques d’une expérience, foetus qui a reçu un IUHCT peuvent être analysés avant la naissance par une césarienne ou après la naissance. En moyenne, les taux de survie après injections intraveineuses vont de 75 à 100 %. Le taux de survie après injections amniotique tendance à fair mieux que des injections intraveineuses, aux alentours de 85 à 100 %.

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Discussion

In utero de transplantation est un traitement potentiel pour plusieurs maladies congénitales qui peuvent être diagnostiqués au début de la gestation. Le modèle murin pour l’IUT permet aux chercheurs d’explorer l’environnement foetal ou d’expérimenter avec différentes thérapies. Selon ce qui est en train d’injecter et ce qui est visé, par voie intraveineuse ou amniotique le dans l’utérus de la transplantation peut fournir une prestation fiable d’un quelle dans l’espace désiré.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GantsCardinal Health2D73DP65
Adson Forceps w/ teethFine Science Tools11027-12
Adson Forceps w/o teethFine Science Tools11006-12
Ciseaux courbésFine Science Tools14075-11
Ciseaux lourdsFine Science Tools14002-13
Needle DriverFine Science Tools12005-15
Vicryl 2.0EthiconJB945
Pipette de transfertMedlineGSI135010
Applicateurs à pointe de cotonMedlineMDS202000
50 mL Tube coniqueFischer Scientific14-432-22
Ruban3M1527-1
Lubrifiant pour les yeuxMajor LubriFresh0904-6488
Coussin chauffantK& H3060
StéréomicroscopeLeicaMZ16
InjecteurNarishigeHI01PK01
Verre Tubes capillairesKimble71900-100
Extracteur de micropipettes verticalSutter InstrumentsP-30
Biseauteur à microélectrodesSutter InstrumentsBV-10
IM-300 Micro-injecteur pneumatiqueNarishigeIM-300
Seringue à insuline  ;BD  ;
305935 FiltreGenesee Scientific25-244
Compac5 Appareil d’anesthésieVetEquip Compac5901812  ;
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
N2 gazAirgasNI 125
O2 gazAirgasOX 125
Ad-GFP vecteur viralPenn Vector CoreH5'.040.CMV.eGFP

Références

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