Summary
在这里, 我们描述了一个协议的生化特性的酵母 rna 修饰酶, Mod5, 并讨论如何将该协议适用于其他 RNA 修饰酶。
Abstract
n-6-isopentenyladenosine RNA 修饰在功能上是多样的, 在原核生物和真核生物中高度保守。其中最保守的 N6-isopentenyladenosine 修改发生在 A37 的位置在 tRNAs 的子集。通过增加 tRNA 对核糖体的亲和性, 这种修正提高了翻译效率和保真度。在真核生物中负责这种修饰的酶的突变与几种疾病状态有关, 包括线粒体功能障碍和癌症。因此, 了解这些酶的基底特异性和生物化学活性对了解正常和病理真核生物具有重要意义。使用了多种方法来描述 i6的修改。本文描述了 Mod5 检测 isopentenylation 的直接方法。该方法利用 rna 的孵化与重组 isopentenyl 转移酶, 其次是 RNase T1 消化, 1 维凝胶电泳分析, 以检测 i6的修改。此外, 还讨论了该协议对其他 RNA 修饰酶特性的潜在适应性。
Introduction
已确定至少163种不同的转录后水平 RNA 修饰, 这些修改赋予 rna 不同的上下文相关功能, 直接影响 rna 结构, 并影响 rna 与其他分子1,2。随着对 rna 修饰的数量和种类的认识的增加, 重要的是开发能够可靠地审问 rna 修饰和催化它们的酶的化验。
第一个 RNA 修改被发现发生在基37在 tRNAs, 毗邻反密码子在 3 ' 边3,4。isopentenyl 组从 dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) 转移到腺苷 37 (i6A37) 3,5的 N6 位置, 在细胞质和线粒体 tRNAs 的一个子集上。i6A37 提高翻译的保真度和效率通过增加 tRNA 的亲和性核糖体4,6和 i6A37 是重要的压力反应的细菌7。执行这种修饰的酶称为 tRNA isopentenyl 转移酶, 在细菌8、9、真菌10、蠕虫11、植物12和更高的真核生物13中高度保守., 包括人14。
人类 tRNA isopentenyl 转移酶基因TRIT1的突变与人类疾病有关。例如, TRIT1的突变与严重的线粒体疾病相关, 可能是由线粒体蛋白合成15、16的缺陷引起的。此外, TRIT1已被描述为肿瘤抑制基因17,18和涉及多种类型的癌症, 包括黑色素瘤19, 乳房20, 胃21, 肺癌22 ,23。最后, TRIT1 和 Mod5 (酿酒酵母) isopentenyl 转移酶是容易聚集的蛋白质, 形成朊蛋白样的淀粉样纤维24,25,26。这些观察可能牵连到神经退行性疾病中的 tRNA isopentenyl 转移酶, 尽管这方面的直接证据尚未显示出来。
考虑到 isopentenyl 转移酶在翻译和疾病中发挥的作用, 直接测量 i6isopentenyl 转移酶活性的方法对于在正常和疾病状态下对这些酵素的机械理解是重要的。越来越多的方法可用于检测 i6RNA 修饰, 包括体外isopentenylation 化验, 无 i6(PHA6) 化验, 薄层色谱 (TLC), 氨基酸的阳性杂交验收活动化验和质谱方法 (参考文献4)。
用14DMAPP 和未标记 tRNAs 对体外isopentenylation 进行了描述。在这项试验中, 放射性碳被 isopentenyl 转移酶从14DMAPP 的 RNA 转化为核糖核酸。虽然这种检测是高度敏感的, 通常很难确定的具体残留物, 修改9,20,27。PHA6 化验依赖于笨重的 i6的修改干扰杂交的32P 标记探针跨越改良残留。因此, 在没有 i6修改18,28,29的情况下, 杂交是更大的。PHA6 检测是高度敏感的, 能够分析从细胞裂解物提取的总 RNA。此外, 设计特定于感兴趣的 RNA 的探针的能力给这个方法坚固目标灵活性。然而, PHA6 化验仅限于对探针目标区域内残留物进行的修饰的表征, 因此不太可能发现新的修饰点。此外, 由于缺乏绑定指示修改, 其他影响 RNA 绑定的修改或突变将混淆数据分析。
另一种方法是将苄基 DEAE 纤维素 (BD) 纤维素色谱与氨基酸接受活性结合起来, 作为6tRNA30的一项修正。这种方法直接分析了 i6的功能修改, 但它是一种间接的方法来检测 i6的修改, 并缺乏解决方案, 以地图修改的特定残留在 RNA。采用薄层色谱法检测总 tRNA i6的修改。在这种方法中, 将内部32P 标记的 tRNAs 消化为单核苷酸, 并用二维薄层色谱分析来识别 isopentenylation。这种方法对于在给定的 RNA 样本中检测总 i6A 非常敏感, 但在消化时, 所有序列信息都丢失;因此, 调查员没有办法确定哪些残留物已被修改31。
最近, 液相色谱-串联质谱 (LC-ms) 方法已经发展, 定量比较的总 RNA 修改之间的物种, 细胞类型和实验条件32,33, 34。这种方法的一个局限性是, 它不太能确定在 RNA 中的身份和位置, 而改性核苷的来源是34。此外, 执行这些实验所需的专门知识和设备限制了这种方法的实用性。
此外, 还开发了几种下一代测序技术, 以绘制转录34的 RNA 修改图。免疫沉淀的 rna 与特定的修改 (RIP 序列) 的抗体, 使调查人员能够识别所有序列包含特定的修改35,36。此外, 基于逆转录酶的化学序列和非随机失配排序方法依赖于修正残留物37、38、39的反向转录反应的扰动。尽管这些技术的优势, 以地图 RNA 修改转录, RIP 序列和化学序列技术是有限的, 缺乏可靠的抗体或活性化学品, 每一个具体的修改, 分别为34。此外, 稳定的 RNA 结构可以阻碍执行化学序列和非随机失配测序技术所需的逆转录酶酵素。tRNAs 的高度修改和结构稳定的性质使他们特别难以用这些技术来审问。到目前为止, 基于下一代测序技术还没有被利用来映射 i6修改34。
在这里, 我们描述了一个简单和直接的方法来检测 i6tRNA 修改的体外。该方法利用 rna 的孵化与重组的酵母isopentenyl 转移酶 (Mod5), 其次是 RNase T1 消化, 1 维凝胶电泳分析映射 i6修改。这种方法是直接的, 需要很少的专门知识来分析数据。此外, 这种方法可以适应其他 rna 修饰酶, 包括酶, 共价键改变 rna 分子量或 rna 的流动性通过凝胶。
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Protocol
注: 该协议是根据参考文献24改编的。
1. 获得感兴趣的 RNA 和酵素
- 使用体外转录 rna 内部标记与32P, 重组 His6-Mod5 表达和纯化大肠杆菌, 如前所述24。
- 用 T7 RNA 聚合酶在未标记 ATP 的存在下, 引入体外转录 rna (3 节), 双绞线, CTP, GTP 和10µCi 凝胶纯化, 乙醇沉淀α ATP, 悬浮 1x TE (10 毫米三盐酸 pH 7.5, 0.1 毫米 EDTA), 并存储在-80 °c24。
- 或者, 获得商业上可用的荧光标记的 rna 感兴趣。在任何首选表达系统中产生感兴趣的酶。
注意: rna 中的内部荧光标记可以改变 rna 结构和酶的识别。
2. 制备20% 聚丙烯酰胺变性凝胶
注: 为了获得足够的分辨率的 RNA 片段, 建议40厘米长的垂直平板凝胶。所用凝胶的宽度取决于要分析的样品的数量。
- 彻底清洁玻璃板。首先, 用肥皂和水冲洗, 用去离子水冲洗好, 最后用异丙醇和无绒湿巾清洗干净。
- 组装板和垫片。
- 混合下列试剂, 使100毫升的20% 丙烯酰胺, 7.5 米尿素, 1x 的凝胶:80 毫升尿素凝胶精矿 (丙烯酰胺237.5 克/升, 亚甲基 bisacrylamide 12.5 克/升, 去离子水中7.5 米尿素), 尿素凝胶稀释剂10毫升 (在去离子水中7.5M 尿素), 10 毫升尿素凝胶缓冲液 (0.89 米 Tris-Borate-20 毫米 EDTA 缓冲 pH 8.3 和7.5 米尿素)。
注: 凝胶液的体积必须根据凝胶的尺寸进行调整。 - 添加40µL 的 n, n, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) 和800µL 新鲜制备的10% 硫酸铵 (APS)。
- 将凝胶溶液向上拉成一个大注射器, 并在玻璃板之间分配。在浇玻璃时用手指敲击, 以防气泡形成。
- 允许凝胶凝固30分钟。
- 用粘合剂夹子将凝胶固定在立式凝胶装置上。
- 用1x 填充上下缓冲室。
- 两小时前加载的凝胶, 预运行的凝胶在 20 mA, 2 小时, 以允许缓冲区边界, 以超越最小的寡核苷酸-否则最小的核苷酸和寡核苷酸往往崩溃在缓冲区前面。
3. RNA Isopentenylation 测定
- 准备17µL 的最后一卷反应, 含有58毫米的三盐酸 (pH 7.2), 1.2 毫米 ATP, 5.8 毫米氯化镁2, 0.2 毫米 DMAPP, 10 U RNase 抑制剂 (如SuperRNaseIn), 4万 CPM 内部32P 标记 RNA, 5.3 µM Mod5, 1.2 毫米 2-巯基乙醇.
- 孵育反应在37°c 为1小时。
- 乙醇沉淀 rna 使用2.5 容量 (42.5 µL) 100% 乙醇和1/10 容量 (1.7 µL) 3.5 M 乙酸钠 pH 值 5.5, 并且安置在-20 °c 为 1 h 或隔夜。
- 离心 RNA 样品为20分钟在 15400 x g 和4°c。
- 小心取出上清液, 用500µL 70% 乙醇清洗 RNA 颗粒。
- 离心机样品在5分钟 15400 x g 和4°c。
- 小心地清除上清和空气干 RNA 丸15分钟, 或直到所有的乙醇已经蒸发。
- 并用重悬 RNA 颗粒在10µL 8 米尿素。
- 添加 150 U 的 RNase T1 和孵化在37摄氏度过夜。
- 添加2µL 6x 加载缓冲器 (60% 甘油, 0.1% 二甲苯蓝)。
- 在一个预运行, 20% 聚丙烯酰胺, 7.5 米尿素凝胶上加载每个 RNA 样品的10µL (参见协议2条)。
注: 核素 RNA 大小梯子可以作为一个额外的移动标记被包括。 - 在 25 mA 上运行2小时的凝胶。
- 停止凝胶, 从仪器中取出。
- 在两个玻璃板之间折断密封, 取出其中一个玻璃板, 将凝胶留在 "底部" 板上。
注意: 在这一步中小心不要撕裂凝胶。 - 将一层塑料包裹在凝胶上, 并在荧光粉屏幕上曝光3小时. 或者, 在色谱纸上放置凝胶, 在荧光粉屏幕曝光前用凝胶干燥机干燥。
- 在荧光粉成像仪上的图像荧光粉屏幕。
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Representative Results
Mod5 在 DMAPP 存在或不存在的情况下, 用酪氨酸 tRNA 或丝氨酸 tRNA 孵化。继改性反应后, 产品被 RNase T1-digested, 它会将所有 guanosines 的 3 ' 末端, 留下 3 ' 鸟嘌呤 monophosphates (GMP)24 (图 1)。对 rna 的完全消化产生一个可预测的模式核素片段 (图 2a), 然后解决了20% 聚丙烯酰胺变性凝胶。将 isopentenyl 组从 DMAPP 转移到 RNA 会导致包含修改后残留物的片段的移动性转移 (图 1)。
该协议可靠地检测 Mod524修改的规范和非规范 tRNA 残滓的 isopentenylation。例如, 预计 Mod5 将修改 tRNAs 的子集, 其中包含先前描述的 AAA36-38序列要求10, 其中包括在本研究中使用的酪氨酸 tRNA 和丝氨酸 tRNA。Mod5 在 DMAPP 存在的情况下修改预测残留物, 如在酪氨酸 tRNA 中包含片段的移位 10 nt AAA36-38所示 (图 2B)。同样, 当丝氨酸 tRNA 与 Mod5 和 DMAPP 孵化时, 观察到 10 nt AAA36-38包含片段的完全移位 (图 2C)。有趣的是, 7 nt 片段的部分移位被观察到不包含 AAA36-38 (图 2C)。这些数据表明, Mod5 的体外活动不需要 AAA36-38序列和结构;然而, 未来的研究使用 LC ms/ms 或其他方法, 以确认确切的化学性质的修改。
图 1: isopentenyl 转移酶测定的例证.tRNA, 内部标记的32P adeonsine, 是孵化与S. 酵母tRNA isopentenyl 转移酶 (Mod5), ATP 与或不 DMAPP。位置 A36-A38 在 anticodon 区域附近被表明。红色星号代表核素核苷酸。在孵化后, rna 被 RNase T1 消化, 提取, 并由20% 变性页解决。在电泳过程中, isopentenyl 组从 DMAPP 到 tRNA 的转移由减速带表示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: RNase T1 消化图和 isopentenyl 转移酶测定的代表性结果.(A) 黑色三角形代表 RNase T1 解裂点, 而三角形上方的黑色线表示至少含有32p-标记腺苷的碎片。灰色突出显示的残滓预计我6一个修改网站 (即, A37)。(B) 酪氨酸 tRNA 和 (C) 丝氨酸 tRNA 内标有32p-腺苷。酵母isopentenyl 转移酶, Mod5, 在存在或没有 DMAPP 的情况下与每个 RNA 一起孵化。rna 然后被消化与 RNase T1 和解决在变性页。转移的带依赖于 DMAPP 表明存在的改良 RNA 残留。预测的修改站点, A37, 带下划线, 修改后的 A37 残留物用星号表示。一个意想不到的和新的修改站点被确定并且被表明作为 "i6？？这个数字已经被修改了从读等。24以允许。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
RNA 的修饰继续被证明在细胞和生物体功能中扮演越来越重要和不同的角色。因此, 研究 RNA 修饰酶的检测的发展对于更好地理解生物学的基本方面是至关重要的。本协议描述了一种高分辨率的体外检测, 以表征 Mod5 的 tRNA 修饰活性。
该协议具有提供直接且容易解释的 isopentenylation 读数的明显优势。所述协议允许对 isopentenyl 转移酶进行健壮的生化表征。此外, 该系统可用于酶变体或改良的 RNA 基质, 允许直接确定特定残留物或域对修改的作用。为了获得更大的分辨率, 该协议可以很容易地被改编为包括与其他 RNases 的平行消解, 如 RNase P1 和/或 RNase A, 它们分别在所有四核苷酸或 C 和 U 上进行切割。
这一分析的局限性是, 它是相对较低的吞吐量, 从而更少的 rna, 可以实际分析比较 rna 测序和质谱方法34。因此, 不建议将此协议用于那些旨在识别转录的 RNA 修改站点的人。这个协议是最有用的调查者谁感兴趣的研究特定 rna 修饰酶与特定的 rna 感兴趣。然而, 许多转录广泛的方法用于识别 RNA 的修改要求共价增加一个化学基团的修饰核苷酸。这种方法提供了一种廉价和高效的分析, 在那里, 人们可以测试在一个单独的基板上的修改协议, 以优化化学修改, 然后提交到转录范围的努力40。虽然本协议提供了一种简单直接的检测 isopentenyl 转移酶活性的方法, 正如这里所描述的, 只有对总 RNA 片段的修改百分比可以计算和比较组之间。对进行定量酶活性比较感兴趣的研究人员必须首先计算每种酶浓度的活动单位。
此方法的成功依赖于几个关键步骤。重要的是, 在 isopentenylation 之前确认感兴趣的 RNA 的完整性。rna 样品在 isopentenyl 转移酶测定前的降解对 rna 的修饰和混淆数据的解释有重要的影响。此外, 在 RNase T1 消化后, 这种降解很难发现。因此, 建议使用变性页检查 RNA 完整性。此外, 为了充分和准确地描述 RNA 修饰的程度, 必须确保 RNase T1 消化已经完成。额外的 RNases, 如 RNase P1 和/或 RNase A, 可用于与 RNase T1 平行消化 rna, 以增加该化验的分辨率。核素寡核苷酸阶梯的已知长度和序列和未消化的 RNA 样品可以用来评估消化。最后, 对于某些酶, 修饰的特异性取决于 RNA 处于 "正确的" 折叠状态。大多数 tRNAs体外合成的结构类似于其体内结构, 但对于其他类 rna 来说, 这是不确定的, 特别是长 rna41。
虽然所描述的协议是特定于 Mod5 isopentenylation 的 tRNAs, 这种方法可以很容易地适应, 以表征其他 RNA 修饰酶, 共价键添加化学基团, 显著改变分子量或凝胶流动性的RNA。
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Disclosures
没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢大卫 Engelke 博士对这篇手稿的指导和有益的评论。睡衣州立大学实验室启动基金;民建联1R15AI130950-01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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