Summary
Этот метод позволяет decellularization комплекс твердых органа с использованием простой протокол, основанный на осмотическим шоком и перфузии ионных моющих средств с минимальными орган матрица нарушения. Она включает в себя Роман decellularization техника для человеческого сердца внутри под давлением мешочек с мониторинг в реальном времени динамику и сотовых оттока потока мусора.
Abstract
Идеальное решение для пациентов с терминальной стадии сердечной недостаточности — пересадка. Но доноров сердца ограничены, иммуносупрессия не требуется, и в конечном итоге может произойти отказ. Создание функциональных, аутологичные био искусственное сердце может решить эти проблемы. Одним из вариантов является Biofabrication сердца состоит эшафот и клеток. Естественный леску с состав ткани конкретных, а также микро - и макро архитектуры могут быть получены путем decellularizing сердца людей или крупных животных, таких как свиньи. Decellularization включает в себя мытье сотовой мусора при сохранении 3D внеклеточного матрикса и сосудистую и позволяет «cellularization» в более поздних timepoint. Опираясь на наш роман, найти что Изотопное decellularization сложных органов возможно, мы разработали более «физиологические» метод decellularize не-которые спасаютжизньпритрансплантации человеческие сердца, помещая их внутри под давлением мешочек, в Перевернутый ориентация, под контролируемого давления. Цель использования в герметичный мешок является создание градиентов давления через клапан аорты, держите его закрытые и улучшения перфузии миокарда. Одновременной оценки динамики потока и сотовой мусора во время decellularization, позволили нам контролировать жидкости приток и отток мусора, создавая тем самым эшафот, что могут быть использованы либо для простой ремонт сердца (например как патч или клапан леса) или в целом орган леску.
Introduction
Сердечная недостаточность приводит к высокой смертности больных. Параметр конечной лечения для конечной стадии сердечной недостаточности — Алло трансплантация. Однако существует длинный лист ожидания для трансплантации из-за нехватки донорских органов, и больные лица после трансплантации препятствия диапазоне от непрерывного иммуносупрессии хронической орган отклонение1,2. Функциональные сердца биоинженерии, заселив decellularized человеческого размера сердца пациента клетки могут обойти эти препятствия3.
Крупный шаг в «Инжиниринг» сердце является создание леску с соответствующим сосудистой и Паренхиматозный структуру, состав и функции для руководства выравнивание и организации поставленных клеток. При наличии надлежащих рамок клетки посеян на эшафот следует признать окружающей среды и выполнять функцию ожидаемых в рамках этого органа. По нашему мнению decellularized орган внеклеточного матрикса (dECM) включает в себя необходимые характеристики идеального эшафот.
Используя встроенные сосудистую, сложные decellularization целом орган может быть достигнуто через антеградная или ретроградным перфузии4 для удаления клеточных компонентов при сохранении деликатный 3D внеклеточного матрикса и сосудистую2, 5,6,7. Функциональный сосудистую имеет важное значение в биоинженерии целые органы просто как в естественных условиях, для распределения питательных веществ и удаление отходов8. Decellularization коронарной перфузии доказано, чтобы быть эффективным в создании decellularized сердца от крыс4, или свиней4,7,9,10,11 ,12,13и люди5,7,14,,1516. Тем не менее могут страдать от целостности клапанов, предсердиями и других «тонких» регионов.
Сердце человека размер decellularized леса могут быть получены из свиней, используя давление управления7,9,10,11,12 или настой потока скорость управления13, 17 и от человека доноров, используя давление управления5,7,14,15. Decellularization человеческих донорских сердец происходит в течение 4-8 дней под давлением, контролируемых на 80-100 мм рт.ст, в вертикальной ориентации5,,1516 или более 16 дней под давлением, контролируемых на 60 мм рт.ст14 . Под антеградная, под контролем давления decellularization, аортальный клапан компетентности играет решающую роль в поддержании эффективности коронарной перфузии и стабильное давление на корню аорты. Наши предыдущие работы показали, что ориентация сердца зависит его эффективность коронарной перфузии во время процедуры decellularization и, следовательно, эшафот целостность в конце9.
Как продолжение нашей предыдущей работы9мы вводим новые концепции, которой добавляется сумке перикарда как улучшить целом сердце decellularization. Мы описываем decellularization человеческих сердец, размещенных внутри под давлением Чехлы, обратно ориентированной и под давлением, контролируемых на 120 мм рт.ст на корню аорты. Этот протокол включает в себя мониторинг профиля потока и сбора отток средств массовой информации во всем decellularization процедуры для оценки эффективности коронарной перфузии и удаление остатков клеток. Биохимические анализы затем выполняются для проверки эффективности метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты соблюдать руководящие принципы Комитета этики от института сердца Texas.
1. орган подготовка
Примечание: В сотрудничестве с LifeGift, некоммерческой органа Организации закупочной деятельности в Техасе (http://www.lifegift.org), дар человеческих сердцах не подходит для пересадки были использованы для исследований с утвержденными согласия.
- Для приобретения сердца, внутривенно настаиваться 30 000 U гепарина в сердцах. Надежно шовные Кардиоплегия канюли в аорте и прикрепить зажимается перфузии линию. Перфорировать нижней полой вены (IVC) вентиляционные правых отделов сердца. Вырежьте Улучшенный левой легочной вены или левого предсердий придаток провентилировать левой камеры сердца.
- Влить 1 Л Кардиоплегия или гепаринизированным физиологическим. Вскрыть ветвей дуги аорты, верхней полой вены (SVC) и другие легочные вены освободить сердце от привязанности сосудов или окружающих тканей. Опускайте хорошо гепаринизированным сердца в холодный солевой раствор.
- Осмотрите пожертвовано человеческого сердца (кпереди и кзади, рис. 1). Место сердце на подносе рассечения и инспектировать любые структурные повреждения или анатомических аномалий. Если печень или легкие были закуплены для трансплантации, сердце может представлять с короткой нижней полой вены и/или отсутствие левого предсердий задней стенки.
- Выполнение внутренней инспекции для возможных дефектов - Дефект межпредсердной перегородки (ASD), дефект межжелудочковой перегородки (VSD) или мальформация клапан (трехстворчатого аортального, митрального,-легочной).
- Если присутствует дефект межпредсердной перегородки, исправьте ее с соответствующей швов (рисунок 2A, 2B). Коррекция дефектов межпредсердной перегородки необходима для мониторинга прогресса decellularization через легочной артерии (PA) отток мутности. Коррекция дефекта межжелудочковой перегородки удаляет слева в правый шунта, следовательно, отток от ПА представляет собой отток от коронарного кровообращения через коронарного синуса.
- Перевязать верхней и нижней полой вены с 2-0 Шелковый шов (рис. 2 c).
- Вскрыть вдали от главных ПА (Рисунок 2D) для последующего катетеризации аорты (Ao).
- Вставьте разъемы, основанный на диаметр сосуда, (рис. 3) в Ao и ПА и закрепите их с 2-0 шелковые швы (рис. 4A).
- Вставка линии труб через левое предсердие (рис. 4B) и к левого желудочка (LV) (рис. 3), используя один из отверстия легочной вены.
- Подсоедините линию настой к разъему в Ao и отток линии в ПА (рис. 3).
- Поместите подготовленные сердца в полиэфирных мешочек в Перевернутый ориентации (вверх ногами).
- Поместите мешочек с сердцем в контейнер перфузии и закройте крышку (рис. 4 c).
- Подключите каждой из линий в соответствующие порты в резиновую пробку (основанный на диаметр контейнера) и вставить его на крышке контейнера перфузии для герметизации полиэстер мешочек (Рисунок 4 c и Рисунок 5B).
- Perfuse 1 x фосфатный буфер (PBS) (136 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4 и 1,8 мм х2PO4 в дистиллированной воде, рН 7,4) через порт настой резиновую пробку для проверки отток из ПА и линии вставляется в LV.
- Используйте этот поток для очистки орган каких-либо остаточных следов крови в сосудистую. Если поток не наблюдается, затяните линий связи, как они могут быть свободными.
2. системы установки и органа Decellularization процедура
- Соберите биореактор и место в вертикальном положении (рис. 5). Перфузии система включает в себя персональный компьютер (ПК), пропорционального интеграл производная (PID) контроллер, Перистальтический насос для инфузии Ao, биореактор перфузии, давление головы контейнер для LV perfusate крепления (бутылка 2 Л Аспиратор с дном пистолет) и насос перистальтический слейте лишнюю жидкость из головы контейнера давление и собирать отток от ПА.
- В резиновые септум Подключите настой линии, -напорные линии, линия ПА отток и биореактор сливной линии в резиновый колпачок поверхности порты поверх перфузии биореактор (Рисунок 5A).
- Decellularize сердца под постоянным давлением 120 мм рт.ст, измеренных в корня аорты. Среднее давление LV должна быть в течение 14-18 мм рт.ст на протяжении всего процесса весь decellularization.
- Decellularize сердца следующим: 4 h гипертонический раствор (500 мм NaCl), 2 h гипотонический раствор (20 мм NaCl), 120 h натрия Додециловый сульфат (1% SDS) решения и окончательный промыть 120 L ПБС (рис. 6A).
- Decellularize сердца под контролем постоянного давления (120 mmHg). Скорость потока вливания в Ao зависит от сердца и составляет, в среднем, 98.06±16.22 мл/мин для гипертонический раствор, 76.14±7.90 мл/мин для гипотонический раствор, 151.50±5.76 мл/мин на SDS и 185.24±7.10 мл/мин для PBS. Общий объем потребления каждого реагента в среднем 23.36±5.70 для гипертонический раствор и 9.13±1.26 Л для гипотонический раствор.
- Разослать окончательный 60 Л 1% SDS (1 Л на грамм веса сердца) до конца SDS перфузии. Рисунок 6A показывает график для процесса decellularization, вызывая конечных точек для сбора данных: потока скорость контроля (Ao и ПА) и отток коллекции (ПА и -PA) от давления во время decellularization.
- Так как лигируют SVC и IVC, это разумно предположить, что все жидкости, собранные из ПА является результатом фактических коронарной перфузии (Рисунок 5B). Определите эффективность коронарной перфузии разделив непосредственно скорости потока perfusate из ПА, скорость потока проникнуты решения Ao:
Эффективность коронарной перфузии =
(%). - Выполнить сравнительный анализ perfusate, полученные от ПА и LV и проникнуты решения в двух экземплярах, Загрузка 200 мкл на скважину в четких днище 96-луночных и читая поглощения на 280 nm. Значение поглощения, эмпирически выбран после попытки различных значений, было установлено, чтобы дать лучшее нормализованные значения.
- Используйте помутнение чистой проникнуты реагента в качестве элемента управления. Мутность отток perfusate представляет размыва клеток мусора и может быть определена количественно мгновенно во время decellularization как инструмент отслеживания процесса.
- Во время окончательной стирки с 10 Л ПБС добавьте 500 мл раствора стерильную нейтрализованы 2,1% надуксусной кислоты, нейтрализованы с 10N NaOH, ведущих к 0,1% надуксусной кислоты раствор (v/v) в PBS. Это решение используйте для стерилизации на эшафот.
(%).3. Оценка Decellularized сердец
Примечание: После decellularization, представитель сердца будет использоваться для коронарной Ангиограмма изображений и биохимических анализов.
- Выполняйте коронарография представитель decellularized человеческого сердца для изучения целостности коронарного сосудистую. Кратко изображение с помощью флюороскопа, decellularized сердце человека после инъекции контрастного вещества через коронарного Лютая канюли в основной правый и левый коронарных артерий.
- Вскрыть decellularized сердце, чтобы получить образцы из 19 районов для оценки оставшихся дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), Глюкозаминогликан (GAG) и уровни SDS в decellularized тканях. Снимите основание сердца из желудочков и вскрыть желудочков на 4 равные части (рис. 6 c). Каждый раздел разделите на передний и задний правый желудочек (RV), передний и задний LV и межжелудочковой перегородки (ИВС). Ткани, содержащие Апекс тренированное в LV и RV для отбора проб.
- Вырежьте образцы тканей для анализов ДНК, кляп и SDS (~ 15 мг живого веса).
- Добывать двуцепочечной ДНК (dsDNA) переваривать образцов в 1 М NaOH за 3 ч при температуре 65 ° C и скорректировать рН 7, используя 10 x буфер Tris-ЭДТА (TE) и 1 М соляной кислоты (HCl).
- Количественно dsDNA с помощью dsDNA Assay комплект с теленка тимуса стандарта (см. Таблицу материалы). Прочитайте образцы в двух экземплярах с помощью Считыватель микропланшетов флуоресцирования (возбуждения в 480 Нм и выбросов на 520 Нм). Вычислить процент остаточной dsDNA в decellularized сердца, сравнивая dsDNA концентрация в каждой ткани, трупной (% трупных).
- Получения сульфатированных приколов в раствор переваривания образцы тканей в решении добыча папаин (буфер фосфат натрия 0,2 М с ЭДТА динатриевая соль, хвоща HCl, натрия ацетат и папаин) при температуре 65 ° C для 3 часов. Измерить с помощью комплекта Assay Глюкозаминогликан кляп содержание (в двух экземплярах).
- Lyophilize образцы для assay SDS в подогревом вакуума и мера сухого веса. 200 мкл ультрачистая вода для каждого образца сушеных и гомогенизации для извлечения остаточных SDS в раствор. Смешайте это решение SDS хлороформа и раствором метиленового синего (12 мг метиленового синего в 1 Л 0,01 М HCl). ПБ будет отделять в органическом слое путем привязки к красителя метиленового синего.
- Использование Считыватель микропланшетов флуоресценции, читать поглощения (655 нм) стандартов и образцы в двух экземплярах для вычисления остаточного ИКБ. Нормализовать это значение SDS ткани сухого веса.
- Примеры изображений из толстых регионов (то есть, LV, RV и перегородки) человеческого сердца с нелинейной оптической микроскопии (NLOM) для подтверждения удаления сотовой после decellularization. Установки NLOM подробно в наших предыдущих публикациях18,19,20. NLOM позволяет нам изображение клетки, эластин, коллаген и миозина волокна через свои две Фотон флуоресценции (ВПС) и второй гармоники поколения (SHG) каналов без использования каких-либо внешних пятно или краситель21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После 7-дневного decellularization с антеградная аорты перфузии под постоянным давлением 120 мм рт.ст. сердце человека оказалось полупрозрачный (Рисунок 6B). Сердце было грубо расчлененный 19 разделов для биохимического анализа (ДНК, кляп и SDS) (рис. 6 c) для оценки конечного продукта decellularized.
На протяжении всего процесса decellularization скорость потока настой разных решений, разнообразны, как давление было неизменным. Скорость потока в Ao (рис. 7A) постепенно снизился с 96.68±23.54 до 80.59±12.41 мл/мин (16,64%) как перфузии решение изменено гипертонический гипотонический. Напротив скорость потока увеличен с 71.68±10.63 до 110.61±14.40 мл/мин (54,31%) при перфузии решение с гипотонический на SDS. Во время SDS перфузии настой потока колебались между 110±14.40 и 176.31±44.03 мл/мин. Уровень оттока от ПА (рис. 7B) первоначально показали аналогичную тенденцию (рис. 7A). Однако уровень оттока во время 1% SDS перфузии снизился с 35.77±9.07 до 27.08±4.09 мл/мин коронарной перфузии эффективности был использован для оценки проходимости клапана аорты и аналогичные тенденции. Эффективность снизилась с течением времени как различные реагенты, увлажненную через сосудистую (рис. 7 c). В течение первого часа 1 мыть ПБС, перфузии эффективность было восстановлено исходное значение предварительно гипотонический раствор (28.39±3.61% в 1-h PBS против 31.02±7.16% в 1-h гипотонический). Эффективность означает коронарной перфузии были 46.08±9.89%, 28.08±7.12%, 25.70±5.30% и 28.39±3.61% с гипертонический раствор, гипотонический раствор, 1% SDS и ПБС, соответственно (рис. 7 d).
Поскольку perfusate оттока от ПА и LV одновременно были собраны, их содержание мусора может быть сравнить (рис. 8A), спектроскопии поглощения, измеренных в 280 Нм (Рисунок 8B). Мутности сточных вод от ПА и LV уменьшилось со временем во время перфузии каждого решения; Однако мутности от ПА показали более резкие изменения цвета по сравнению с наблюдаемой от LV в период начальной перфузии. После переключения с гипертонической гипотонический раствор, мутность ПА отток от 1.15±0.03 до 1.40±0.07 (увеличение 21,73%) и LV изменено с 1.13±0.05 1.24±0.07 (9,73 процента). В течение первого часа 1% SDS перфузии мутность изменилась от 1.17±0.04 до 2.77±0.15 (136,75% увеличение) для ПА и 1.11±0.04 к 1.75±0.26 (56.65% увеличение) для LV стоков. Корреляция между отток мутность и ячейки мусор размыва оценивалась с использованием bicinchoninic кислоты assay протеина (BCA), когда концентрация белка был количественно в образцах отток. Результаты, полученные от decellularization 6 человеческие сердца выявлено линейной корреляции между концентрацией белка и мутности сточных вод с R2 = 0,95 (Рисунок 8 c).
После завершения всего сердце decellularization коронарный Ангиограмма подтвердил сохранение неповрежденными коронарного сосудистую (рис. 9). Нелинейные оптические изображения слоев миокарда с толщиной областей (т.е., RV, LV и перегородки) в decellularized сердце человека подтвердила удаление клеток, как отсутствие клеток наблюдалось в ВПС каналов (рис. 10). Клетки (то есть, кардиомиоцитов или сердечной фибробластов) с их аутофлюоресценция могут быть легко идентифицированы в канала ТПФ их морфологии овальные и удлиненной формы. Для обеспечения эффективности процесса decellularization и сотовой мусора, decellularized человеческие сердца были далее собрал в 19 регионах (рис. 6 c) для количественного определения уровней ДНК, сульфатированных приколами и SDS, остающихся в этих регионах. ДНК во всех регионах был меньше, чем 10% трупных сердца. ДНК в правое предсердие (8.39-10.38% по отношению к трупной) и слева Атриум (5.11-7,60%) был высоким (рис. 11А).
Рисунок 1: трупной человеческого сердца от агентства закупок орган. Передний и задний вид трупной человеческого сердца. Нижней полой вены и часть правого предсердия отсутствуют, как отмечено в пунктирной региона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: проверка для межпредсердной перегородки или клапана анатомические аномалии. (A) проверить если патент овальное отверстие (PFO) присутствует (связь между правое и левое предсердие). (B) 5-0 полипропилен шов применяется в непрерывной моды закрыть PFO. (C) правое предсердие закрыт с работающей швом 5-0 полипропилен. (D) легочной артерией рассечена от восходящей части аорты тупым рассечение. FO: овальное отверстие; ПА: легочной артерии; АО: аорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: компоненты вливания биореактор. Система decellularization состоит из (A) резиновый колпачок с 4 портами; (B) отток линия подсоединяется к легочной артерии (ПА); (C, F) разъемы с замком luer для ПА и аорты (Ao), (D) линия вставки для левого желудочка (LV), (E) инфузии линия подсоединяется к аорты, полиэстер мешочек (G) и (H) перфузии контейнера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: сердце человека катетеризации и настой биореактор Ассамблея. (A) спереди сердца, показывая легочной артерии (ПА) и индивидуально канюлированной аорты (Ao). (B) задней зрения сердца показаны канюля направлены левого желудочка (LV) через легочную Вену (PV). (C) человеческое сердце внутри биореактора инфузии после сборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Настройка системы Перевернутый ориентированной decellularization с напорные. (A) полный decellularization система состоит из: компьютер, контроллер пропорционального интеграл производная (PID), насосы, биореактор и водоемов для сбора стоков от легочной артерии (ПА) и левого желудочка (LV). АО: аорты. Стрелки показывают направление потока. (B) схемы установки человеческого сердца внутри биореактора перфузии и пути связанного потока perfusate/сточных вод во время decellularization. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Схематическое изображение decellularization процедуры и после decellularization изучения человеческого сердца. (A) схема процедуры decellularization. (B) передней и задней экспертиза decellularized человеческого сердца. (C) валовой рассечение человеческого сердца в четыре поперечные сечения (раздел A раздела D) для биохимических пробирного анализа. Колорит в сердцах людей обусловлено осаждением остаточных lipofucin. Окраска обычно представляет в внутренней поверхности желудочков или граница между epicardium и миокарде. LA: левое предсердие; RA: правое предсердие; LV: левого желудочка; RV: правый желудочек; Муравей: Передняя; Сообщение: задняя; Hyper: гипертонический; Гипоаллергенные: гипотоническая; SDS: лаурилсульфат натрия; PBS: фосфат буфер солевой раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: динамика промежуток времени потока во время decellularization. (A) скорость потока инфузионных растворов decellularization в аорте во время процедуры. (B) расход сточных вод от ПА во время decellularization. (C) эффективность коронарной перфузии во время decellularization. (D) означает эффективность коронарной перфузии при перфузии различные решения/реагентов. N = 6. Данные представляют собой mean±SEM. ПА: легочной артерии; Hyper: гипертонический; Гипоаллергенные: гипотоническая; SDS: лаурилсульфат натрия; PBS: фосфатный буфер; SEM: Стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: промежуток времени ячейки мусор смыв во время decellularization. (A) отток средств массовой информации коллекции от ПА и не PA (левый желудочек). (B) результат измерения мутности в 280 Нм. (C) линейная корреляция существует между концентрацией белка и мутность. n = 6 человеческие сердца. Контроль был чистый decellularization решения. Данные представляют собой mean±SEM. ПА: легочной артерии; Hyper: гипертонический; Гипоаллергенные: гипотоническая; SDS: лаурилсульфат натрия; SEM: Стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: коронарного Ангиограмма decellularized человеческого сердца подтверждает проходимость thevascular после decellularization. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: изображения, полученные с помощью нелинейных оптической микроскопии из трупной и decellularized миокарде показать не наличие клеток (то есть, кардиомиоцитов или сердечной фибробластов) с овальной или удлиненной формы морфологии в decellularized LV, RV и перегородки. LV: слева желудочка; RV: правый желудочек; ВПС: два фотона флуоресценции; SHG: второе поколение гармоник. Некоторые сердечные клетки обозначаются стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11: результаты биохимического анализа. (A) оставшиеся ДНК относительно трупной сердца в decellularized тканях. (B) оставшиеся кляп относительно трупной сердца в decellularized тканях. (C) оставшиеся SDS в decellularized тканях. n = 6 человеческие сердца. Данные представляют собой mean±SEM. Ла: слева Атриум; RA: правое предсердие; LV: левого желудочка; RV: правый желудочек; Муравей: Передняя; Сообщение: задняя; SDS: лаурилсульфат натрия; SEM: Стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Метод | Про | Con |
| Обычные вертикально Langendorff перфузии | · Легкий доступ к сердца, чтобы восстановить во время decellularization | · Чрезмерное напряжение на аорте за вес сердца |
| · Скорость потока высокая вливания во время SDS перфузии под контролем постоянного давления | ||
| · Низкая коронарной перфузии эффективность во время SDS перфузии | ||
| · Часть аорты/легочной артерии выше линии перевязки канюля может получить обезвоженной и легко загрязненных | ||
| Перевернутый Langendorff перфузии внутри под давлением мешочек | · Свести к минимуму нагрузке на аорте за вес сердца | · Трудно доступа необходима сердце если ремонт. |
| · Скорость потока низкого вливания во время SDS перфузии под контролем постоянного давления | ||
| · Улучшена эффективность коронарной перфузии во время SDS перфузии | ||
| · Не ткани будет высохли, поскольку всем сердцем, погруженной увлажненной. |
Таблица 1: Резюме плюсы и минусы целом сердце decellularization с использованием обычных вертикально перфузии против Перевернутый Langendorff перфузии внутри под давлением мешочек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Насколько нам известно это первое исследование доклад Перевернутый decellularization человеческих сердец внутри под давлением мешочек с покадровой мониторинг потока скорость и ячейки удаления мусора. Сумке перикарда как сохраняет ориентацию сердца стабильной на протяжении всей процедуры decellularization. Погружение и инвертирование всего сердца внутри мешок предотвращает обезвоживание и минимизирует чрезмерную нагрузку на аорте (от веса сердца), когда по сравнению с обычными вертикально Langendorff перфузии decellularization метод9. Это, в свою очередь, сохраняет компетенцию аортального клапана.
Для достижения максимальной decellularization эффективности, коронарного сосудистого сопротивления должны быть низкими для обеспечения надлежащего и последовательного перфузии жидкости через весь миокард. В целом сердце decellularization модели с помощью Ретроградная перфузии жидкость накапливается в желудочках и поднимает внутрижелудочкового давления, которое, в свою очередь, увеличивает сопротивление коронарных сосудов и ограничивает поток жидкости. Хотя аортальный клапан нетронутыми, полости желудочков заполняет среднего физиологического утечки и в свою очередь сжимает стенке желудочка.
Наша методика decellularizing сердце внутри под давлением мешок предназначен для смягчения остроты этой проблемы и повышения эффективности decellularization. На протяжении всего процесса decellularization поддерживается давление 120 мм рт.ст на корня аорты и 14 мм рт.ст, в футляре. Эти значения давления очень близки физиологического диапазона (80-120 mmHg в аорте) и 15 мм рт.ст, для левого желудочка конечного диастолического давления22. По словам Мурти и др. 23, миокарда кровь потока скорость колеблется от 0,61 до 1,10 мл/мин/g и сердце человека вес24,25 около 245 до 308 g; следовательно уровень физиологических коронарный кровоток составляет около 149.45 к 338.80 мл/мин, но зависит от веса сердца. Наши темпы оттока от ПА варьировал от 20 до 50 мл/мин, которая является меньше, чем значение коэффициента физиологических коронарный кровоток и могло бы привести от 2 различных ситуаций: 1) инфузионных растворов в сердце производят отек и есть также нормальных анатомических дренаж коронарной системы в полость левого желудочка; 2) как decellularization происходит, жидкость также теряется через decellularized стены из-за естественного прироста их проницаемости. Этот перепад давления предотвращает сплющивание судов и позволяет им оставаться патент. Кроме того эта система поддерживает сердце в относительной анатомических условий без сжатия миокарда стены, которая повысит сопротивление коронарных сосудов и ухудшить внутрисосудистого тираж decellularization решений. Профиль скорость инфузии потока человеческих сердец (рис. 7A) очень похож на то, что мы наблюдали в нашей Перевернутый decellularization свинину сердца9, с низкой скорости потока инфузии, происходящих при гипотонических перфузии и небольшое увеличение потока, скорость (110.61±14.40 мл/мин до 176.31±44.03 мл/мин) происходит во время 1% SDS перфузии. Наша скорость потока инфузии (среднее значение = 151.50±3.71 мл/мин) в течение 1% SDS перфузии была сопоставима с, или даже меньше, чем для decellularization человеческого сердца, сообщает Guyette et al. 14 однако, наш метод выполняется с контролем давления 120 мм рт.ст и их метод используется 60 мм рт.ст. Эта разница в перфузионного давления предлагает превосходной эффективности закрытия клапана аорты в нашей технике, поскольку ниже скорости потока настой может поддерживать высокое давление. Другая возможность заключается, что увеличенное сопротивление коронарных обусловлено приложенное давление 14 мм рт.ст, внутри мешок. Кроме того наши сердца человека метод показал аналогичная тенденция снижения эффективности коронарной перфузии (~ 30%, рис. 7 c, 7 D) от гипер гипотонический раствор изменения по сравнению с нашей Перевернутый свинину сердце decellularization (~ 10% в Перевернутый ориентации9против 1-2% в вертикальной ориентации). Однако этот новый метод может сохранить эффективность коронарной перфузии во время SDS перфузии сопоставимые решения перфузии и таким образом появляется выше нашего предварительного метода выборки инверсии. В таблице 1 перечислены плюсы и минусы обычных вертикально перфузии против Перевернутый Langendorff перфузии внутри под давлением мешочек.
В дополнение к скорости потока отток мутность мониторинг может быть еще одним полезным инструментом для оценки decellularization прогресса и эффективности. Во время decellularization мутности сточных вод от ПА был выше, чем в сточных водах от сайтов-PA (Рисунок 8B). Это свидетельствует о том, что большая часть перфузии решение шел через сосудистую для «правильный» decellularization. Тем не менее для этого быть действительными, должны решаться следующие: между камеры шунтов или проходимости аортального клапана. Поэтому тщательно и скрупулезно осмотр необходим для предотвращения сбоя метода из-за анатомических несоответствий. Мутность профиля (Рисунок 8B) процесса всем сердцем decellularization продемонстрировал схожие тенденции показанное ранее, с резким мутность изменения первоначального переходный период различных перфузатов9.
Главная цель для decellularized тканей заключается в том, чтобы иметь возможность повторно заполнить их с клетками и достижения высоких клеток вложений, распространения, созревания и функциональность. Наши decellularized ткани были успешно cellularized для различных приложений26,27, где ткани были успешно cellularized и достигнуто ниже thrombogenicity. В наш биохимический анализ decellularized человеческих сердец мы оценивали 19 областей с толщины различных тканей. ДНК и SDS в decellularized тканях разнообразны, с самым высоким значением, полученные в правое и левое предсердие. Это может быть вызвано ориентации сердца в конфигурации вверх вниз, котором ячейки мусор был пойман в ловушку в нижней части сумке или где внешнее давление снижается поток. Decellularization перфузии опирается на неповрежденных сердце структур, включая нетронутыми coronaries и притоки. Как эти органы закупаются из нескольких доноров, эти сердца, как правило, имеют большую часть их предсердия удалены. В ходе подготовки этих органов и ремонт предсердий стены был срыв в орошения этих регионов, ставя под угрозу приток decellularization решений. Для не перфузия сердца decellularization других исследовательских групп сообщили 2-6% оставшихся ДНК в крыса28, свинину29,30 и31 человека по сравнению с соответствующими трупной сердце. Однако, они использовали замораживания оттаивания28,29,30, фермент29,30 и сыворотки31 в их decellularization протокол, который может повредить ECM в большей степени, чем Наша техника на базе перфузии. Решающее значение будет иметь разработка методов адекватно решать эти ограничения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Тейлор является учредителем и акционером в Miromatrix Medical, Inc. Эта связь управляется в соответствии с политикой конфликта интересов университета Миннесоты и Техас институт сердца; другие авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Хьюстон Дотационный Грант и Техас Фонд для новых технологий. Авторы признают агентство по закупкам орган LifeGift, Inc. и семьями донора для изготовления этого исследования возможных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al.
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al.
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
