Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

Résumé

Une méthode de microscopie corrélative électron (CLEM) est appliquée aux structures intracellulaires Viro-induite d’image par microscopie électronique (EM) dans les cellules qui sont préalablement sélectionnés par microscopie photonique (LM). LM et EM sont combinés en une approche d’imagerie hybride pour obtenir une vision intégrée des interactions virus-hôte.

Résumé

En raison de sa haute résolution, microscopie électronique (me) est un outil indispensable pour les virologues. Cependant, une des principales difficultés lors de l’analyse de cellules transfectées ou infectés par un virus par l’intermédiaire de EM sont les gains d’efficacité faibles d’infection ou de transfection, empêchant l’examen de ces cellules. Afin de surmonter cette difficulté, microscopie photonique (LM) peut être effectuée tout d’abord pour allouer la sous-population de cellules transfectées ou infectés. Ainsi, en profitant de l’utilisation des protéines fluorescentes (FPs) fusionnée à protéines virales, LM est utilisé ici pour enregistrer la position des cellules transfectées « positif », exprimant un FP et ça grimpe sur un support avec un modèle alphanumérique. Par la suite, les cellules sont traitées ultérieurement pour EM par haute pression gel (HPF), gel de substitution (FS) et l’incorporation de résine. L’étape de congélation ultra rapide assure membrane excellente préservation des cellules sélectionnées qui peuvent ensuite être analysées au niveau ultrastructural par microscopie électronique à transmission (TEM). Ici, un flux de travail étape par étape microscopie lumineuse corrélative (CLEM) est fourni, qui décrit la préparation de l’échantillon, l’imagerie et corrélation en détail. Le dispositif expérimental peut être également appliqué pour résoudre de nombreuses questions de biologie cellulaire.

Introduction

L’idée de combiner les deux modalités de microscopie pour obtenir une meilleure image d’un processus biologique spécifique est plutôt vieux. Ainsi, la toute première étude sur les virus « microscopie corrélative » a été publiée en 1960 comme deux publications distinctes^1,2. Dans cette étude, les auteurs ont analysé les changements dans la morphologie du noyau induite par adénovirus au moyen de deux techniques de microscopie. Dans la première publication, les observations au microscope électronique (EM) décrivant les détails morphologiques associés à l’infection à adénovirus ont été signalés¹. Dans une seconde publication, les différentes structures observées par EM étaient corrélés avec des images de microscopie photonique (LM) de colorations histochimiques, à définir la nature des structures observées précédemment par EM².

Dans ces premières études, cependant, leurs observations ont été effectuées à l’aide de différentes cellules infectées préparés comme expériences indépendantes. La « corrélation » était, en effet, signifiait que la combinaison des informations provenant des deux modalités d’imagerie pour comprendre un certain phénomène, en comparant toutes les constatations qui ont été obtenues avec différentes épreuves afin de comprendre une donnée biologique processus.

De nos jours, la microscopie corrélative de terme, également connu sous le nom corrélatif microscopie photonique et électronique (CLEM), est appliquée à un nombre croissant de méthodes (révisé dans les références^3,4,,⁵), avec les composants communs que les deux techniques d’imagerie (LM et EM) sont réalisées sur le même échantillon. La combinaison de ces deux méthodes entraîne, par conséquent, une analyse multimodale, multi-échelle et multidimensionnelle de cet échantillon³. Les avantages sont que LM peut fournir une vue d’ensemble de plusieurs cellules différentes, permettant d’identifier les sous-populations de cellules exprimant une protéine ou des protéines d’intérêt au sein d’une population hétérogène de cellules. EM permet de surmonter la limite de résolution de LM, fournissant une image de résolution plus élevée d’un événement particulier intracellulaire. En outre, EM permet la visualisation du contexte subcellulaire non fluorescent, y compris tous les organites liés à la membrane, grands complexes macromoléculaires (p. ex., ribosomes, centrioles, etc.) et des éléments du cytosquelette, ainsi fournissant des informations spatiales supplémentaires, le soi-disant « espace de référence »⁶et donnant le contexte à la tache fluorescente détectée par LM.

Au cours de ces dernières années, CLEM est devenu un outil puissant, non seulement pour la cellule biologistes⁵, mais aussi pour les virologues (revus en référence⁷) désireux de comprendre les interactions virus-cellules complexes qui conduisent à une propagation de virus avec succès. Ainsi, comprendre comment les virus modifient les membranes cellulaires et des organites à leur profit est essentiel de développer des médicaments antiviraux pour éradiquer les virus pathogènes.

Ici, CLEM on décrit une méthode qui permet la détection par LM de cellules exprimant des protéines virales fusionnés à une protéine fluorescente (FP). Ces cellules sont par la suite cryo-immobilisé et autrement préparés pour les analyses ultrastructurales par microscopie électronique à transmission (TEM) à acquérir de nouvelles connaissances dans l’expression de ces protéines Comment réorganiser les membranes intracellulaires (Figure 1). CLEM a été exécuté avec les cellules chimiquement fixes dans la plupart des études virologie publiées à la date^{8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19}. C’est principalement en raison de la nécessité d’inactiver les matières infectieuses pour des raisons de biosécurité de niveau de biosécurité-2 et -3 (BSL-2 et niveau de biosécurité 3) laboratoires, où la cryo-immobilisation des cellules n’est généralement pas possible. Pour ces questions qui nécessitent une conservation optimale des membranes cellulaires, vitrification par haute pression gel (HPF) est, cependant, fortement recommandée de²⁰. Dans ces cas, le protocole de CLEM décrit ici peut être appliqué. Fait intéressant, surtout si vous travaillez avec des échantillons infectieux, HPF peut être pratiquée sur les échantillons qui ont été précédemment chimiquement inactivés, par exemple dans les laboratoires BSL-2 et de niveau de biosécurité 3. La combinaison de fixation chimique suivie d’HPF est une possibilité de tirer profit au moins en partie des avantages de cryoconservation méthodes^21,22.

Figure 1 : Représentation schématique du flux de travail pour l’analyse des cellules via CLEM. Cellules qui croissent sur des disques saphir à motifs sont d’abord analysés par LM de localiser les cellules exprimant FPs avant leur traitement pour EM. Une fois localisé, les cellules sont immédiatement fixés par HPF et FS pour être par la suite incorporé dans la résine. Lors de la polymérisation de la résine, l’appui où sont développaient des cellules (= disques saphir) doivent être enlevés du bloc de résine. Le bloc contenant les cellules embarqués est réduit à un petit trapèze dont les cellules restantes, exprimant des FPs, sont sectionnés avec un couteau de diamant. Ultraminces sont recueillies sur des grilles de fente et examinées par TEM se renseigner ultrastructurale de ces cellules. Ce chiffre est adapté et modifié avec la permission de référence²⁹. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. préparation du saphir à motifs disques pour Culture cellulaire

1. Transférer les motifs disques saphir (voir Table des matières), avec un modèle alphanumérique gravé sur l’une de leurs surfaces, dans un tube de centrifugation conique de 15 mL.
   Remarque :, Disques de saphir épaisseur conventionnelle de 0,05 mm sans modèle alphanumérique montér dans laquelle un modèle de référence est créé par carbone revêtement avec une grille de finder sur le dessus. Dans ce but, ils doivent être nettoyés avec de l’éthanol avant d’applique le modèle de carbone.
2. Laver soigneusement avec de l’éthanol. Étalez-les dehors dans une boîte de Pétri avec papier filtre et laissez-les sécher. Placez-les sur une plaque en verre séparés les uns des autres à l’aide de la pince à épiler longue slim.
3. Vérifier avec un microscope inversé (grossissement de X 4) si le modèle de coordonnées est lisible sur chaque disque saphir.
   Remarque : Si ce n’est pas le cas, mettez les disques saphir avec l’aide de la pince à épiler.
4. Stockez les disques saphir dans une boîte de Pétri.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

2. cellule Culture avec motifs disques saphir

1. Stériliser les disques saphir à motifs avec une reticulation de rayons ultraviolette (UV) pendant 5 min.
2. Prendre les disques saphir à la biosécurité de culture cellulaire du cabinet. Stériliser les pinces longues avec de l’éthanol dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
3. Ajouter la moitié de la milieu de culture cellulaire (voir Table des matières) dans un plat à la culture cellulaire. Transférer les disques saphir délicatement avec la pince à épiler longue dans le récipient de culture cellulaire.
4. Cellules de⁵ Huh7-Lunet graine 1 x 10, exprimant de manière stable la polymérase T7 resuspendue dans l’autre moitié de la milieu de culture cellulaire, sur la boîte de Pétri.
   Remarque : Calculer le nombre de cellules pour l’ensemencement de telle sorte que, à la fin de l’expérience, la confluence de la cellule doit être pas plus de 20 à 30 %. Haute densité cellulaire va entraver le déplacement des cellules à un stade ultérieur par EM. En outre, over-confluence pourrait entraîner le détachement des cellules à partir des disques saphir.
5. Vérifiez que les disques saphir restent au bas de la boîte de Petri et que les coordonnées alphanumériques sont encore lisibles avec le microscope inversé.
   Remarque : Si les disques flottent dans le milieu de culture de cellules, utilisez la pince à épiler longue à pousser les disques vers le bas et finalement à retourner vers la bonne orientation.
6. Transfecter les cellules le lendemain comme indiqué précédemment dans références^21,23 selon les instructions du fabricant de l’agent de transfection.

3. LM imagerie de cellules qui croissent sur des disques saphir à motifs

1. Transférer les disques saphir à la fin de l’expérience sur un plateau d’imagerie métallique contenant 30 à 50 µL / position de milieu de pH sans indicateur de fluorescence de fond non spécifique de réduire.
   Remarque : La plaque de métal ici (Figure 2) a été conçue à l’atelier du laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL). En l’absence de cette plaque ou un semblable, Pétri de fond en verre cellulaire pourrait être également utilisée pour LM. Il est important de changer le milieu de culture de cellules normales pour les moyennes sans indicateur de pH. Notez également que les longs temps d’exposition doivent être évitées car cela pourraient provoquer des photobleaching, conduisant à l’accumulation réactives de l’oxygène (DRO) et des dommages physiologiques des cellules^24,25.
2. Les cellules sous un microscope à fluorescence widefield inversée de l’image.
   Remarque : Lorsque vous utilisez une protéine fluorescente verte (GFP)-protéine marqué, comme le montre les résultats représentatifs, de 450 à 490 nm et de 500 à 550 nm d’excitation et d’émission filtres, respectivement, doit être utilisé.
3. Acquérir tout d’abord une image de faible grossissement (10 à 20 X) des cellules d’allouer les cellules exprimant Record FPs. les coordonnées des disques saphir à motifs où les cellules d’intérêt sont trouvent à l’aide de la microscopie (DIC) de contraste interférentiel différentiel.
   NOTE : Piquer plusieurs domaines peut permettre d’avoir un meilleur aperçu de l’emplacement des cellule/cellules d’intérêt. Notez que également que la microscopie à contraste de phase peut être éventuellement utilisée ici.
4. Acquérir des images à fort grossissement (fluorescence et DIC) (63 – 100 X, objectifs immersion dans l’huile) des mêmes cellule/cellules de mieux discerner la localisation intracellulaire de la protéine d’intérêt au sein de l’espace intracellulaire.
   NOTE : DIC images fournissent des informations contextuelles. Cette information est souvent critique de corréler les images LM avec les micrographies EM plus tard parce que la corrélation finale est plus précise avec des points de repère « anatomique » de la cellule. Comme certains disques saphir pourraient briser au cours de la cryo-immobilisation, il est fortement recommandé de préparer réanalysés par État. En outre, certaines cellules détachement les disques pendant HPF et les étapes ultérieures du présent protocole, tandis que l’ultrastructure des cellules d’autres peut-être contenir des artefacts par suite de dommages de congélation. Donc, au moins deux domaines des disques doit être photographié via LM pour s’assurer qu’au bout du compte, il y aura suffisamment de cellules à analyser. Ce qui est important, ces deux zones devraient être sur les côtés opposés du disque. De cette manière, le bloc de résine, où les cellules sont intégrés peut être découpé en deux moitiés et sections de ces zones peuvent être obtenues.

Figure 2 : Schéma pour l’imagerie de cellules qui croissent le LM à motifs disques saphir. (A) les disques saphir sont transférés avec l’aide de pinces fines à une plaque d’imagerie. (B-C) Cette plaque a été spécialement conçue à l’atelier de l’EMBL à Heidelberg pour s’insérer dans le microscope photonique, où les disques saphir peuvent être photographiées avec un milieu de culture cellulaire sans indicateur de pH. Il se compose d’une lame de métal, 75 mm x 25 mm x 1 mm, avec quatre ou cinq trous fraisés dedans avec une mèche de 3 mm à la taille des disques saphir. En outre, les petites rainures étaient usinées sur chaque côté des trous à un angle de 90°. Ces trous rendent plus facile d’accéder aux disques avec une pince lors de leur manipulation. Afin de permettre des conditions optimales d’imagerie couvre-objet en verre no 0 (0,085 à 0,13 mm d’épaisseur) était collées sous les trous avec de la colle UV et placé sous la lumière UV à durcir. Image de fort grossissement (D) du disque saphir à motifs représentant les coordonnées alphanumériques qui sont gravées sur sa surface. Les disques saphir à motifs sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. Cryo-immobilisation des cellules qui croissent sur Sapphire à motifs disques via HPF

1. Placer la porte en aluminium « A » et « B » pour HPF (voir Table des matières) dans une boîte de Pétri avec papier filtre imbibé de 1-hexadècène. Immerger les disques saphir à motifs contenant les cellules dans une boîte de Pétri avec 1-hexadècène.
   Remarque : Déplacer les disques un peu pour laver le milieu de culture cellulaire.
2. Assembler les disques saphir entre un « A » et le « B » aluminium transporteur dans le support de HPF comme suit (Figure 3B). Sur le fond, placez un transporteur « B » avec le côté plat vers le haut. Placer les disques saphir ce côté plat avec les cellules vers le haut. Ajouter un « A » transporteur avec sa profondeur de 0,1 mm vers les cellules.
   Remarque : Les disques saphir à motifs étant plus épais que les traditionnels disques saphir, le transporteur disponible dans le commerce « A » (conçu pour être utilisé avec disque saphir de 0,05 mm, non texturés) a dû être coupé jusqu'à 0,05 mm à ce côté de 0,2 mm de profondeur à l’EMBL atelier pour monter dans le porte-HPF (Figure 3A). Dans ce but, le « porteur » est insérée dans l’extrémité d’un tube métallique pour que son côté de 0,2 mm est exposée et reste toujours tout en coupant vers le bas. La coupe sur le flanc est ensuite poncée afin qu’il soit plat. Alternativement, un transporteur spécial en aluminium peut être utilisé sur le dessus du disque saphir à motifs (disponible dans le commerce, voir Table des matières), comme en l’espèce le HPF « sandwich » composé uniquement du disque saphir et ce porte-vélos.
3. Fermer la porte de la machine de HPF et geler les cellules.
   Remarque : Ce protocole est spécifique pour une machine particulière de HPF. Autres machines de HPF pourraient être alternativement utilisé^6,26. Dans tous les cas, s’il vous plaît être conscient de l’existence de machines de nouvelle génération auprès des fournisseurs.
   ATTENTION : Utiliser des lunettes et casque de protection auditive.
4. Placer le « sandwich » congelé dans une boîte en polystyrène avec de l’azote liquide pour le stockage temporaire.
   ATTENTION : Utiliser des lunettes et obtenir en contact avec les agents de sécurité locaux d’être informés sur les dangers potentiels lors de la manipulation de l’azote liquide.
   1. Pour éviter toute confusion, placez chaque « sandwich » dans un tube de microcentrifuge séparé 0,5 mL (à l’intérieur de la boîte en polystyrène) marqué d’un numéro.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Si cryo-substitution (FS) ne peut pas être effectuée immédiatement, les échantillons peuvent être stockés en cryo-tubes (avec un trou perforé sur le dessus) à l’intérieur des boîtes, qui se trouvent dans un rack dans un azote liquide cryogénique dewar (voir Table des matières). Ce contenant de l’azote liquide doit être placé dans une pièce avec capteurs de gaz oxygène, pour éviter l’étouffement dans le cas d’un manque d’oxygène.
      ATTENTION : Toutes les procédures décrites ci-dessous (étapes 5 et 6) doivent être effectués dans une armoire de sécurité biologique. En outre, la plupart des réactifs utilisés sont dangereuse. Avant de les utiliser, il est obligatoire de lire attentivement les fiches signalétiques fournies par les fabricants, mais aussi de poser les officiers de la sécurité sur les règles locales pour assurer une manipulation sûre. Pour l’élimination correcte de ces matériaux utilisés, ainsi que pour la bonne utilisation du matériel décrit ci-dessous, il est également nécessaire de consulter santé de l’Institut local et procédures de sécurité.

Figure 3 : Schéma de l’Assemblée du saphir à motifs disques entre deux porte en aluminium pour HPF. (A) vues écorché d’un transporteur traditionnel « A », qui doit être coupé sur le côté profond de 0,2 mm à 0,05 mm. (B) le disque saphir épaisseur 0. 16 mm avec le modèle alphanumérique gravé sur la surface est assemblé en deux porte en aluminium pour HPF , comme suit : le disque saphir est placé sur le côté plat d’un transporteur « B » avec les cellules vers le haut. Un haché « A » transporteur avec sa profondeur de 0,1 mm face à des cellules est placé sur le dessus pour fermer le « HPF "sandwich" ». La porte en aluminium et les disques de saphir à motifs sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

5. FS des cellules Cryo-corrigé

1. Remplissez la machine FS (voir Table des matières) à l’azote liquide. Régler la température à-90 ° C et attendre jusqu'à ce que l’appareil atteigne cette température.
2. Préparer le milieu FS contenant le tétroxyde d’osmium (OsO₄) 0,2 % (v/v), l’acétate d’uranyle de 0,1 % (UA) (p/v) dans l’acétone distillée verre tandis que la machine FS refroidit.
   Remarque : Pour préparer, (par exemple) de 12 mL de milieu de FS, mélanger 600 µL de 4 % OsO₄0,012 g d’agriculture urbaine dans un petit contenant. Dissoudre ce mélange dans un appareil à ultrasons pour 5 min. Ajouter 11,4 mL d’acétone verre distillée avec une pipette et bien mélanger.
3. Remplir les tubes de microcentrifuge de 1,5 mL avec 200-500 µL de milieu FS, fermer le couvercle et les transférer sur la machine de la FS. Attendre 10 min pour le milieu FS se refroidir.
4. Transférer les surgelés « sandwichs » contenant les disques saphir avec des cellules dans l’azote liquide, utilisez des pinces longues refroidis pour les tubes contenant le milieu de la FS.
   ATTENTION : Utiliser des lunettes et des gants cryo-protectrice.
   Remarque : Le HPF « sandwichs » pourrait être démonté spontanément lors de leur manipulation. Dans ce cas, assurez-vous que les disques congelés saphirs sont transférées vers les tubes de microcentrifuge. La porte en aluminium peut être mis au rebut.
5. Exécutez le FS comme suit jusqu’au prochain jour²⁷: de-90 ° C à-80 ° C pendant 8 h ; de-80 ° C à-50 ° C pendant 8 h ; de-50 ° C à-20 ° C pendant 2 h ; de-20 ° C à 0 ° C pendant 2 h.

6. résine incrustation du gel substitués des échantillons

ATTENTION : Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectués dans une armoire de sécurité biologique. En outre, la plupart des réactifs utilisés sont dangereuse. Avant de les utiliser, il est obligatoire de lire attentivement les fiches signalétiques fournies par les fabricants, mais aussi de poser les officiers de la sécurité sur les règles locales pour assurer une manipulation sûre. Pour l’élimination correcte de ces matériaux utilisés, ainsi que pour la bonne utilisation du matériel décrit ci-dessous, il est également nécessaire de consulter santé de l’Institut local et procédures de sécurité.

1. Retirez les spécimens substitués de la machine FS et placez-les sur la glace pendant 20 min.
2. Conserver les échantillons à la température ambiante pendant 20 minutes et laver soigneusement (3 fois 10 min chacun) avec de l’acétone distillée à verre. Jeter la porte en aluminium avec la pince à épiler longue si elles sont encore dans les tubes de microcentrifuge après la FS.
3. S’infiltrer dans les cellules (sur les disques restants de saphir) dans une série de résine époxy de quatre étapes en utilisant des incubations de 1 h en résine de 25 %, 50 % et 75 % dans l’acétone distillée à verre, suivie d’une nuit d’incubation avec 100 % de résine. L’échange de la résine 100 % le lendemain pendant 1h.
4. Placer soigneusement les disques saphir en cheminement anneaux montés dans des bains de réactif rempli de résine 100 %. Ces anneaux est utilisées comme moules de polymérisation pour 10 disques saphir.
   Remarque : Les disques saphir doivent être complètement poussés vers le bas avec les coordonnées vers le haut de façon lisible. Ceci peut être vérifié avec l’aide de jumelles attaché à un extracteur de fumées. Alternativement, jumelles à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique pourrait être utilisé à la place. Ce qui est important, il y a des nombres (1-10) gravée sur le fond des réactifs qui aident à identifier les échantillons.  En outre, pour l’identification des échantillons une étiquette en papier pourrait figurer dans le bloc de résine.
5. Polymériser les échantillons au four à 60 ° C pendant 48 h.

7. suppression de disques saphir à motifs à partir des blocs de résine polymérisée

1. Retirer les blocs de résine dure contenant les cellules du four.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Si non, laissez le refroidir de blocs à température ambiante avant de les couper.
2. Couper les moules encastrement avec une lame de rasoir, d’avoir accès à des blocs de résine. Retirer les blocs de résine cylindrique à l’aide de la pince à épiler.
   Remarque : Si une étiquette en papier n’a pas été incluse dans la résine bloquer avant polymérisation, nombre des blocs avec un marqueur permanent et rangez-les dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. Le protocole peut être suspendu ici.
3. Plonger l’extrémité du bloc résine contenant le disque saphir dans une boîte en polystyrène contenant de l’azote liquide jusqu'à l’arrêt « bulles ». Ensuite, plonger l’extrémité du bloc de résine en ébullition H₂O.
4. Répétez les deux étapes précédentes autant de fois que nécessaire jusqu'à ce que le disque saphir tombe hors du bloc de résine.
   ATTENTION : Utiliser des lunettes et des gants cryo-protectrice.
   Remarque : Si cela ne fonctionne pas, utiliser une lame de rasoir pour retirer un peu de la résine polymérisée autour des disques avant de réessayer. Le protocole peut être suspendu ici.

8. ciblées parage et coupes ultraminces pour TEM

1. Identifier la région, sur la face du bloc résine, où les cellules d’intérêt sont trouvent en examinant la face du bloc avec les jumelles d’un ultramicrotome.
   Remarque : L’empreinte négative du modèle de coordination depuis les disques de saphir à motifs est conservé sur la face du bloc. Cela permet l’identification de la zone où se trouvent les cellules d’intérêt pour dégrossir ciblée. Les images de la LM doivent être retournées verticalement afin de faciliter la conclusion de la même position de la face du bloc.
2. Garniture de la monocouche cellulaire intégré contenant les cellules/cellules d’intérêt pour une petite pyramide plate avec la forme d’un trapèze (~ 200 µm × 250 µm taille moyenne) avec une lame de rasoir propre.
3. Obtenir des coupes ultrafines de 70 nm des cellules incorporés avec un couteau de diamant de 35°.
4. Déposer les sections sur les grilles de fente EM avec l’aide de pincettes ultra-fin.
   Remarque :: l’utilisation de mesh grilles doivent être évitées car les sections peuvent être masquées par les barreaux de la grille.
5. Rangez les grilles dans une maille.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

9. TEM analyse des coupes ultrafines

1. Placez la grille de la fente dans le support du microscope électronique à transmission. Acquérir des images à faible grossissement (aperçu), où le profil de cellule complète de la cellule d’intérêt est visible.
   Remarque :: les cellule/cellules d’intérêt peuvent être trouvées retour en utilisant les profils de la cellule et les emplacements des cellules à l’autre comme références, comparant les opinions de DIC acquis avant par LM.
2. Acquérir des images à fort grossissement des cellules ou cellules d’intérêt, pour essayer de trouver, au niveau ultrastructural, fonctionnalités qui correspondent aux signaux fluorescents observées plus tôt par LM.
   NOTE : Les images de Montage peuvent être obtenues à fort grossissement pour avoir une vue d’ensemble à haute résolution des cellules ou cellules d’intérêt. En outre, il est souvent nécessaire d’acquérir des images de la même cellule dans des coupes sériées consécutifs pour pouvoir reconstruire la cellule en 3D avant de comparer les images de fluorescence.

Résultats

À l’aide de la procédure présentée ici (Figure 1), Huh7-Lunet cellules exprimant de manière stable la-ARN polymérase T7 ont été ensemencés sur des disques de motifs saphirs et ensuite transfected avec un plasmide exprimant deux domaines de l’hépatite C (VHC) les protéines non structurales NS5A, tag GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Figure 4). Le lendemain, les motifs disques saphir, où les cellules sont développaient, étaient sortis les récipients de culture cellulaire et imagés par LM (Figure 4, Figure 2). Les cellules exprimant le AH-D1-GFP ont été identifiés par la présence d’une fluorescence verte dans le cytosol et enregistrés pour enregistrer leurs positions dans le motif de coordonnées des disques saphir (Figures 5 a, 5 b). Immédiatement après leur examen de LM, les disques saphir contenant les cellules d’intérêt ont été assemblés entre deux porte en aluminium (Figure 3) et soumis à la cryo-immobilisation par HPF. Les cellules ont été ensuite geler substitués et par la suite intégrés dans une résine époxy.

Lors du retrait des disques saphir partir des blocs de résine polymérisée, l’empreinte du modèle alphanumérique était visible sur la face du bloc, qui a permis de récupérer les zones où se trouvaient les cellules d’intérêt. Le reste du bloc de résine a été réglé de suite pour générer un petit trapèze hébergeant les cellules d’intérêt. Sériées ultraminces ont été obtenues à partir de ce trapèze, recueillies sur les grilles de fente EM et davantage analysées par TEM (Figure 5C). À noter qu’obtenir manuellement sériées consécutives, bien que faisable²⁸ est forte intensité de main de œuvre et nécessite du personnel bien formé et compétent. Il est également important que les cellules ont une confluence faible lorsqu’elles sont soumises au présent protocole CLEM (Figure 5A) afin de garantir une reconnaissance rapide de la même cellule précédemment identifiée par LM. Dans le cas contraire, ayant plu confluence cellulaire pourrait considérablement ralentir la localisation réussie des cellules au niveau de l’EM.

Analyse TEM de plusieurs coupes ultrafines de la cellule d’intérêt (Figures 5, 5E), exprimant l’AH-D1-GFP, révèle la présence dans son espace intracellulaire de fortes accumulations de vésicules de morphologie variable délimitées de la cytosol entouré d’une double couche lipidique unique (Figure 5E).

Figure 4 : Représentation schématique du flux de travail suivies pour exécuter l’exemple de CLEM représenté dans Figure 5 . Huh7-Lunet cellules exprimant de manière stable la-ARN polymérase T7 ont été transfectées avec un plasmide d’ADN codant l’hélice amphipathique (AH) et du domaine 1 (D1) de la protéine NS5A VHC, étiquetée à son C-terminal avec GFP (pTM_AH-D1-GFP). L’expression de cette partie de la protéine NS5A est transcriptionnellement contrôlée par un promoteur T7 (T7 MP) et translationnelle par un élément IRES (site d’entrée de ribosome interne) du virus (EMCV) encéphalo, indiquée par une structure secondaire. Les cellules de 24 h après transfection (hpt 24) qui poussent sur les disques saphir à motifs et exprimant le AH-D1-GFP ont été détectées par LM et immédiatement soumis à HPF-FS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Exemple d’une procédure de CLEM. (A) Huh7-Lunet de cellules exprimant de manière stable la polymérase T7 analysée par microscopie à fluorescence pour allouer des cellules positives GFP cultivées sur des motifs disques saphir, 24 h après la transfection avec le plasmide pTM_AH-D1-GFP. Image de grossissement plus élevé (B) d’une seule cellule sélectionnée dans le rectangle en pointillé blanc à analyser par CLEM. Image TEM (C) d’une section ultra-mince de la même cellule après HPF, FS et incorporation de la résine. (D) représentation schématique des coupes ultrafines de série 70 nm sur une grille de fente EM contenant la cellule d’intérêt. (E) sur la gauche : aperçus TEM de deux tronçons de la cellule d’intérêt. À droite : images TEM fort grossissement des domaines intracellulaires sélectionnés dans des rectangles jaunes sur la gauche, révélant un nombre élevé de vésicules délimités du cytosol via une membrane unique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La méthodologie de CLEM présentée ici pour étudier l’impact d’une expression de la protéine virale sur les membranes cellulaires a été utilisée avec succès avant afin d’élucider le VHC réplication associées aux structures, principalement double membrane des vésicules (DMV)²¹, ainsi que pour déterminer les blocs de construction essentiels nécessaires à la formation de ces structures induite par le VHC²³. Notez que dans notre premier travail à l’aide de CLEM pour étudier le VHC réplication²¹, une version légèrement modifiée du protocole décrit ici a été appliquée. À cet étude, épais disques saphir classique de 0,05 mm, sans modèle alphanumérique, servaient, dans laquelle un modèle de référence a été créé par carbone revêtement avec une grille de finder sur le dessus (voir Table des matières). Cette version du protocole actuel peut être éventuellement appliquée, avec l’avantage que le « A » transporteur pour HPF peut servir directement, sans avoir besoin de le couper vers le bas comme dans la Figure 3A. Sinon, comme mentionné dans le protocole, un épais « A » transporteur peuvent être utilisé (voir Table des matières) avec motifs disques saphir, sans avoir besoin d’un transporteur « B ».

Fait intéressant, ce protocole peut être appliqué non seulement d’étudier des échantillons de BSL-1, tels que les cellules transfectées avec des protéines virales comme décrit ici et d’ailleurs^19,23, mais aussi pour étudier les cellules infectées par le virus. Bien que travailler avec des agents pathogènes humains est habituellement limitée aux laboratoires BSL-2 et de niveau de biosécurité 3, dans certains pays, il est toujours possible d’effectuer la cryo-immobilisation dans ces conditions de biosécurité. Dans ces BSL-2 et les laboratoires de niveau de biosécurité 3 où la vitrification n’est pas possible, en raison de la réglementation locale ou de l’absence d’une machine de HPF, les cellules infectées par le virus peuvent être toujours préparés en utilisant cette méthode, si la fixation chimique avec des aldéhydes est effectuée à l’avance, à savoir avant de quitter les installations BSL-2 ou de niveau de biosécurité 3. Par ailleurs, aldéhydes doivent être éteint immédiatement après fixation de garder la fluorescence, tandis que le reste du protocole est identique à celle décrite ici. Cette technique peut être considéré comme superflue parce que les cellules sont fixées deux fois, chimiquement et par l’intermédiaire de vitrification. Toutefois, ce protocole de double fixation entraîne en effet une bien meilleure conservation des DMV induite par le VHC en comparaison des DMV trouvés chez les cellules soumises à fixation chimique seul²¹.

Des modifications supplémentaires et dépannage le lecteur est renvoyé aux notes tout au long de la partie du protocole de ce manuscrit. Ces notes décrivent les pièges à éviter, ainsi que des solutions de rechange pour surmonter des difficultés qui pourraient surgir lors de l’exécution de cette méthode.

La condition principale pour l’application de cette technique est une machine de HPF. Cryo-immobiliser les cellules par l’intermédiaire de HPF n’est pas possible (à cause de l’absence d’une machine de HPF) ou n’est requise (pour la préservation de la membrane n’a pas besoin d’être optimale), lorsque les cellules peuvent être chimiquement fixe et par la suite préparé et analysés par EM^{8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,},¹⁹. Cette option ne requiert pas l’utilisation de disques saphir, mais Pétri de cellules avec des motifs maillées pour le déplacement de cellules ou agrégats cellulaires. Le principal avantage de l’utilisation de ces plats est leur plus grand diamètre par rapport aux disques saphir, permettant la projection de plus grandes surfaces. Ainsi, l’application du présent protocole de CLEM a été appliquée avec succès pour étudier l’effet d’un composé antiviral contre le VHC¹⁵ ou pour visualiser les réarrangements de membrane induites par les protéines non structurales du Norovirus¹⁹. Une autre question qui peut limiter les performances de cette méthode est l’absence d’un appareil commercial de FS. Dans ce cas, systèmes FS de base fait maison peuvent être utilisés à la place. Bien que les automatismes FS pourraient réduire les accidents de manutention, des dispositifs sont utilisés avec succès par exemple à^{30 de Kent McDonald} et laboratoires de Paul Walther.

En ce qui concerne la fixation chimique, le protocole décrit ici garantit une conservation optimale des structures intracellulaires²⁰. Par conséquent, dans le cas où les dispositifs HPF et FS susmentionnées sont disponibles, vitrification les cellules d’intérêt serait préférable.

Les alternatives à cette approche de CLEM incluent la possibilité d’utiliser cette méthode non seulement d’acquérir des informations 2D au niveau ultrastructural, mais aussi pour obtenir des informations sur l’architecture 3D d’altérations membranaires et organelle causées par des virus. Les méthodes 3D-EM, y compris la tomographie électronique (HE) et ionique focalisé faisceau-microscopie électronique (FIB-SEM) (largement décrit dans²⁹), pourraient être également appliqués à des cellules qui ont été préparés en suivant ce protocole actuel^{21, 31}. En outre, des informations 3D pourraient être également obtenues au niveau LM, lorsque vous utilisez un microscope confocal, qui permet l’acquisition de z-piles. En fait, cette option est fortement recommandée quand une corrélation précise entre les ensembles de données LM et EM est souhaitée (voir par exemple¹⁷). L’information incluse dans 3D z-piles du sida afin d’améliorer la corrélation avec les images 2D de TEM. Ainsi, dans un tel scénario, le meilleur montage images LM et EM peut être sélectionné et ensuite soumis à l’un des logiciels disponibles, comme le plugin d’ec-CLEM ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² ou le plugin de Landmark correspondances de corrélation Image J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), ayant pour résultat la génération de chevauchement des images LM-EM.

Lorsque l’information temporelle est nécessaire pour comprendre la cinétique d’un certain événement, Time-lapse imagerie peut être utilisé pour surveiller la dynamique de cellules vivantes en combinaison avec EM. Durant la manifestation d’intérêt, les cellules sont fixées immédiatement, générant un « instantané congelé » qui peut être analysé par la suite via EM, fournissant des informations détaillées et ultrastructurales sur ce moment particulier au moment de l’immobilisation. Afin d’obtenir cet « gelé instantané », après l’observation en temps réel, les cellules peuvent être chimiquement fixe³³ ou cryo-immobilisé⁶. Puisque de nombreux processus cellulaires se produisent plus rapidement que les processus de diffusion de fixation chimique, si possible, la congélation ultra rapide doit être effectuée. Cependant, il est important de tenir compte du fait que les machines de HPF se différencient dans leur temps effectif résolution³⁴.

En outre, bien que ce protocole a été conçu pour l’intégration des cellules dans une résine époxy, les cellules peuvent être incorporés aussi dans les résines de faible viscosité, tels que Lowicryls, LR blanc ou or LR. L’utilisation de ces médias encastrement permet de préserver l’antigénicité^35,36, ainsi que de^37,de fluorescence³⁸ et, par conséquent, sont surtout utilisés pour l’enrobage après immunomarquage sur-section^{39 , 40} et sur-section CLEM^41,42,43,44, où le LM s’effectue après l’incorporation. Les deux approches (immuno-EM et sur-section CLEM) doivent être cruciales pour ces expériences dans lesquelles des structures non caractéristiques peuvent être facilement trouvés via TEM et/ou comme témoin contre miscorrelation entre LM et EM signaux. De même, marquage avec des anticorps qui peuvent être visualisées par les deux modalités d’imagerie (LM et EM) peut être effectué⁴⁵ afin, par exemple, identifier les cellules transfected dans LM (enrobage préalable d’étape) et d’atteindre une localisation plus précise de la Signal GFP via son étiquetage spécifique par immuno-EM (stade post-encastrement). Il doit être pris en compte, toutefois, cette perméabilisation a lieu avant LM pour permettre l’accès des anticorps à l’espace intracellulaire, ce qui pourrait entraîner une préservation optimale de l’architecture cellulaire au niveau de l’EM. Fait intéressant, ce protocole est également bien adapté pour multicolore des expériences qui peuvent être obtenus avec l’utilisation d’autres étiquettes fluorescentes, autre que GFP (comme illustré ici). En conclusion, il y a beaucoup de possibilités putatif d’adapter ce protocole, tant sur le LM, et/ou sur les côtés de l’EM, selon les questions qui sont abordées. Pour une description complète des autres protocoles alternatifs se reportera à^5,46. Quelle que soit la façon dont les modalités de microscopie sont combinées, ensemble le résultat est un gain d’information, ce qui nous permet de mieux comprendre comment les virus et leurs protéines interagissent avec leurs hôtes dans la vraie vie.

L’étape la plus importante au sein de cette méthode est la collection de coupes sériées des cellules d’intérêt. Comme l’a souligné dans la section résultats représentatifs, cela nécessite de personnel spécialisé, ainsi que beaucoup de patience. Ce qui est important, cette étape est essentielle pour trouver les cellules retour au niveau de l’EM pour deux raisons. Tout d’abord, dans ce genre de protocole de CLEM avec incorporation des LM, les coordonnées ne sont visibles au niveau du LM et sur la face du bloc résine après l’incorporation. Toutefois, ils ne seront pas visibles sur les sections de TEM. Par conséquent, parage ciblée sur la face du bloc vers le bas aux régions d’intérêt (ROIs) doit être effectuée soigneusement avec une lame de rasoir pour s’assurer que les sections que l'on obtient par la suite contiennent les cellules exprimant un FP donnée. Deuxièmement, la « numérisation » plusieurs sections est nécessaire de trouver la meilleure superposition entre le LM et les acquisitions de l’EM. Contrairement aux méthodes où LM est effectuée à l’étape de l’incorporation, dans ce cas la superposition de LM-EM n’est pas si précise. La précision faible recouvrement est due aux différences dans la résolution axiale entre LM et EM, rétrécissement lors du traitement d’échantillon des EM et compression au cours de la section⁴². Néanmoins, des méthodes de suivi efficaces, telles que l’utilisation des points de repère, aident à isoler les cellules à l’arrière. Cela inclut la position d’une cellule à l’autre, ainsi que la forme des cellules et leur noyau. À cet égard, comme cela est expliqué dans le protocole, DIC images fournissent des informations « anatomique » des cellules qui sont essentiels pour améliorer la corrélation. Alternativement, les noyaux ou autres organites de la cellule bien reconnaissable (comme les mitochondries ou lipides gouttelettes) peuvent être colorées avant LM et utilisés comme points de repère.

Enfin, il convient de mentionner que, bien que ce manuscrit est axé sur l’utilisation de cette technique pour les études de la virologie, la portée de ce dispositif expérimental peut être étendue pour répondre à des questions biologiques plus générales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réticulant UV	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230 Vac, équipé d’ampoules UV de 254 nm, 8 Watts/chacune.
Disques saphir à motifs	Bureau d’études M. Wohlwend, Sennwald, Suisse	627	Ils ont un diamètre de 0,3 mm et une épaisseur de 0,16 mm, ainsi qu’un motif alphanumérique gravé pour permettre le déplacement des cellules. Ils ne peuvent être commandés que par e-mail : martin-wohlwend@bluewin.ch.
Pince à épiler fine et longue	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	« Style SS », pour la manipulation de disques en saphir.
Milieu de culture cellulaire	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	41965-062	Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 2 mM de L-glutamine, d’acides aminés non essentiels, 100 unités de pénicilline par ml, 100 & micro ; g de streptomycine par ml et 10 % de sérum de veau fœtal (DMEM complet, voir ci-dessous). Emballage contenant 10 bouteilles de 500 ml/chacune.
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Emballage contenant 20 bouteilles de 100 ml/chacune.
Acides aminés non essentiels	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Emballage contenant 20 bouteilles de 100 ml/chacune.
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	15140-163	Emballage contenant 20 bouteilles de 100 ml/chacune.
Sérum de veau fœtal	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Flacon de 50 mL
Microscope inversé	Olympus Deutschland, Hambourg, Allemagne	CKX41	Il s’agit d’un microscope inversé avec des options de tête trinoculaire et une capacité d’amélioration de la fluorescence.
Cellules Huh7-Lunet exprimant de manière stable l’ARN-polymérase T7	Disponible au laboratoire du Prof. Dr. Ralf Bartenschlager	Non disponible Contactez	Prof. Bartenschlager au : ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Réactif de transfection Mirus TransIT-LT1	Mirus Bio LLC, Madison, États-Unis	MIR 2304	Réactif de transfection d’ADN à large spectre, à faible toxicité. Flacon de 0,4 mL
Microscope à fluorescence inversée à grand champ	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Allemagne	Zeiss Observer.Z1	Microscope à fluorescence inversée pour les expériences impliquant des cultures de cellules vivantes.
1-hexadécène	Merck, Darmstadt, Allemagne	8220640100	Bouteille de 100 mL
Supports en aluminium « A » pour la friture à haute pression (HPF)	Bureau d’études M. Wohlwend, Sennwald, Suisse	241	Il s’agit du support qui a été utilisé pour ce protocole et qui a 2 profondeurs différentes de 0,1 et 0,2 mm. Il ne peut être commandé que par e-mail : martin-wohlwend@bluewin.ch.
Supports en aluminium « B » pour	le bureau d’ingénierie HPF M. Wohlwend, Sennwald, Suisse	242	C’est le support qui a été utilisé pour ce protocole. Il a une épaisseur de 0,3 mm. Ils ne peuvent être commandés que par e-mail : martin-wohlwend@bluewin.ch.
Support en aluminium « A » pour HPF (spécial pour travailler avec des disques de saphir à motifs)	Bureau d’études M. Wohlwend, Sennwald, Suisse	737	Il s’agit du support qui peut être utilisé seul avec le disque de saphir à motifs (comme alternative au protocole actuel), sans avoir besoin d’un support « B » ou de l’édition du support « A ». Il a une épaisseur de 0,84 mm. Il ne peut être commandé que par e-mail : martin-wohlwend@bluewin.ch.
Disques saphirs	Bureau d’études M. Wohlwend, Sennwald, Suisse	405	Ces disques saphirs sont les « classiques », avec un diamètre de 0,3 mm et une épaisseur de 0,05 mm. Ils peuvent également être utilisés pour CLEM comme alternative aux disques de saphir à motifs.
Electron	Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphie,	États-Unis LF135-Cu	Ces grilles de 135 mailles sont utilisées pour créer un motif alphanumérique sur des disques de saphir « conventionnels » (décrits ci-dessus) via un revêtement de carbone, de sorte qu’ils peuvent être utilisés pour CLEM. 100 grilles/flacon.
Appareil HPF	ABRA Fluid AG, Widnau, Suisse	HPM 010	Cet appareil HPF a été utilisé pour ce protocole.
Machine HPF	Leica Microsystems, Vienne, Autriche	EMPACT 2	« EMPACT 2 », comme alternative à l’utilisation de la machine HPM qui a été utilisée dans ce protocole (décrit ci-dessus).
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	Pour le stockage à long terme d’échantillons cryo-immobilisés dans de l’azote liquide. Emballage contenant 500 cryoflacons.
Dewar à l’azote liquide	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Allemagne	GZ-05094-60	Pour le stockage à long terme d’échantillons cryo-immobilisés dans de l’azote liquide, équipé de cryo-racks d’une capacité de 1600 cryo-tubes.
Machine de substitution automatique par congélation (AFS)	Leica Microsystems, Vienne, Autriche	EM AFS2	Cette machine effectue des techniques de substitution par congélation et d’abaissement progressif de la température (PLT) et permet l’enrobage et la polymérisation à basse température des résines.
Tétroxyde d’osmium (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, États-Unis	19150	Solution aqueuse à 4 %, une boîte contenant 10 ampoules de 2 ml.
Acétate d’uranyle (UA)	Serva, Heidelberg, Allemagne	77879.01	Flacon contenant 25 grs de (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Allemagne	329	"Sonorex Super RK 31 » est un bain de nettoyage par ultrasons de haute puissance pour solution de nettoyage aqueuse qui est utilisé dans ce protocole pour mélanger OsO4 et Ua lors de la préparation du milieu FS.
Acétone distillée en verre	Microscopie électronique Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Flacon de 100 mL
Stéréomicroscope	Leica Microsystems, Vienne, Autriche	Leica M80	Stéréomicroscope de routine pour les inspections quotidiennes, équipé d’une caméra pour la capture d’images.
Résine époxy	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 est un kit contenant plusieurs composants qui doivent être mélangés dans les proportions données par les fabricants.
Anneaux d’écoulement Leica	Microsystems, Vienne, Autriche	16707157	Emballage contenant 100 pièces.
Bains de réactifs	Leica Microsystems, Vienne, Autriche	16707154	Paquet de 100 pièces.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienne, Autriche	Leica EM UC7	Ultramicrotome pour la préparation de sections semi-minces et ultraminces à température ambiante.
Couteau diamant Ultra 35 ° ;	Diatome Ltd., Nidau Suisse	AGG339-735	Ce couteau a une longueur de tranchant de 3 mm.
Pince à épiler ultra fine	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X », pour la manipulation de grilles EM.
Grilles de fentes EM	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, États-Unis	G2010-Cu	100 grilles/flacon.
Boîte de stockage de grille EM	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	Il a une capacité de 100 grilles.