Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

Les triterpènes sont parmi les plus importantes et la plupart des structures diverses familles des produits naturels. Malgré leur immense diversité, tous les produits naturels de triterpène sont censés provenir de la même précurseur linéaire 2,3-oxidosqualene, un produit de la voie du mévalonate dans les plantes. La cyclisation des 2, 3-oxidosqualene est initiée et contrôlée par une famille d’enzymes appelées oxidosqualene cyclases (OSC). Cette étape de cyclisation représente le premier niveau de diversification, avec des centaines de triterpène différents échafaudages ayant été signalés dans la nature¹. Ces échafaudages sont plus diversifiés en adaptant les enzymes y compris, mais non limité à, cytochrome p450s (CYP450s)^1,2. Ces voies de biosynthèse peuvent conduire à immense complexité, entraînant parfois des produits finis qui sont à peine reconnaissables depuis le triterpène de parent. Par exemple, la structure complexe de la puissant insecticide et antiappétant limonoïde azadirachtin est censée provenir d’un triterpène tétracyclique des tirucallane type³.

Nombreux dérivés triterpéniques produits naturels, même ceux avec les échafaudages parent relativement non modifiés, ont démontré en médecine des activités biologiques^4,5,6,7. Toutefois, jusqu'à présent ce potentiel n’est pas traduite par une pléthore de médicaments dérivés triterpéniques à la clinique. Il s’agit sans aucun doute (au moins partiellement) une conséquence de l’accès limité de synthèse pratique pour cette classe de composés, un problème qui peut étouffer l’exploration des relations structure-activité et mise au point de conduire candidats par traditionnel médicinales workflows de chimie.

Expression transitoire des enzymes biosynthétiques triterpène d’autres espèces végétales dans les feuilles de N. benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène (Figure 1). Ce processus peut servir à caractériser sur le plan fonctionnel les enzymes candidat et reconstruire les voies de biosynthèse des métabolites naturels importants. De même, il peut également être exploitée dans des approches de biosynthèse combinatoires triterpène de nouveaux produits, une stratégie qui peut se traduire par des bibliothèques des analogues de structure apparentées, permettant une exploration systématique des relations structure-activité de plomb biologiquement actif composés de^8,9.

Agroinfiltration est un moyen simple et efficace de réaliser l’expression transitoire dans les feuilles de N. benthamiana . Le processus implique l’infiltration des feuilles avec une suspension de a. tumefaciens transportant les exigences d’une expression binaire d’intérêt. Ceci est réalisé via l’application d’une pression qui force le liquide à travers les stomates, déplacement de l’air dans l’espace intercellulaire et son remplacement par la suspension d’a. tumefaciens . Les bactéries transférer l’ADN-T respectifs à l’intérieur des cellules végétales, aboutissant à l’expression de la protéine passagères et localisée dans les tissus foliaires infiltrés.

Tout en n’importe quel vecteur binaire adapté pour générer des plantes transgéniques peut-être être employée pour l’expression transitoire, nous utilisons le niébé Mosaic Virus CPMV dérivé Hypertranslational (HT) protein expression système^{10, 11}. dans ce système, le gène d’intérêt est flanqué de régions non traduites (UTR) de l’ARN-2 CPMV. La 5' UTR contient des modifications entraînant des niveaux très élevés de la traduction des protéines avec aucun recours à la réplication virale,¹². Cette technique a été développée dans la série de vecteur binaire Easy-et-rapide (ÉPQL) qui comprend la recombinaison site-spécifique clonage Protocole compatible constructions (ÉPQL -HT- DEST)^10,11. La plupart des vecteurs pEAQ contiennent aussi une tomate bushy stunt virus dérivés P19 silencieux suppresseur gène¹³ dans la partie de l’ADN-T de la cassette d’expression, qui contourne qu’il fallait coinfiltrate une souche P19 porteurs distincte et offre très expression de la protéine de haut niveau chez l’hôte plant cell^10,11.

Utilisation de N. benthamiana comme un hôte d’expressions présente des avantages particuliers lorsqu’il travaille avec voies de biosynthèse de plante. L’architecture cellulaire intrinsèquement prend en charge que les ARNm approprié et transformation de la protéine et cloisonnement approprié, en plus de posséder les enzymes nécessaires de co, réductases (pour CYP450s) et précurseurs métaboliques. La source de carbone est la photosynthèse ; ainsi, les plantes peuvent simplement être cultivées dans le compost de bonne qualité, nécessitant uniquement eau, CO₂ (à partir de l’air) et le soleil comme entrées. La plateforme est également très pratique pour la co-expression de différentes combinaisons de protéines, comme cela peut se faire simpliste par l’infiltration Co de différentes souches de a. tumefaciens, niant la nécessité de construire la grande expression multigénique cassettes. En outre, le processus peut linéairement et sûrement évoluer simplement en augmentant le nombre de plantes utilisées pour l’expérience.

Des travaux précédents dans notre laboratoire a démontré l’utilité de cette plateforme pour des expériences à échelle préparative. Ceci inclus la préparation de nouveaux triterpènes pour essais de bioactivité et échelle vers le haut pour atteindre les quantités de gramme de produit isolé. En outre, l’accumulation de produits hétérogènes triterpène peut être augmentée plusieurs fois par la co-expression de forme N-terminal-tronqué, indépendante de la rétroaction de l’hydroxy-3, 3-methyglutary-coenzyme A réductase (tHMGR), une limitation de vitesse en amont enzyme dans la voie de mevalonate⁸.

Clé de telles expériences échelle préparative est la capacité de bien haut de gamme le processus d’infiltration. Dans une expérience typique, des dizaines ou des centaines de plantes peuvent être nécessaire pour atteindre la quantité cible de produit isolé. S’infiltrer dans des feuilles individuelles à la main (à l’aide d’une seringue inutile) est exigeante sur le plan opérationnel et souvent trop longues, rendant cette méthode impraticable pour l’intensification systématique. Infiltration sous vide offre des avantages par infiltration de la main, car il ne dépend pas du niveau de compétence de l’opérateur et permet l’infiltration d’une surface plus grande de la surface foliaire. Cette procédure est utilisée commercialement pour la production à grande échelle des protéines pharmaceutiques¹⁴. Ce protocole utilise un appareil facile à reproduire infiltration sous vide, qui peut être construit à partir des pièces disponibles dans le commerce. Cela permet l’infiltration simultanée de jusqu'à 4 plantes, offrant rapide et pratique avec infiltration de centaines de plantes dans un court laps de temps (Figure 2 a -2 b). L’appareil d’infiltration sous vide est constitué d’un four sous vide qui constitue la chambre de l’infiltration (Figure 2f). Le four est relié à une pompe via un réservoir vide. Ceci réduit considérablement le temps nécessaire pour atteindre le vide désiré dans la chambre de l’infiltration. Plantes sont sécurisés dans un support sur mesure et inversés dans un bain d’eau en acier inoxydable de 10 L rempli d’a. tumefaciens suspension (Figure 2 a -2C). Immersion complète des parties aériennes des plantes est importante pour l’infiltration efficace. L’eau du bain est alors placé dans la chambre de l’infiltration (Figure 2d -2e) et le vide appliqué pour dessiner l’air dans les espaces interstitiels de la feuille. Une fois que la pression a été réduite de 880 mbar (un processus qui prend environ 1 min) la chambre de l’infiltration est ramenée rapidement à la pression atmosphérique 20-30 s en ouvrant la vanne d’entrée du four, après quoi l’infiltration est terminée.

Cinq jours après l’infiltration le matériel végétal est prêt pour l’extraction ultérieure et de récolte et d’isolation du produit désiré. De ce point, le processus est tout simplement un des produit naturel extraction et purification de matériel foliaire, un flux de travail qui est familière à un chimiste de produit naturel. ¹⁵il existe différentes méthodes pour l’extraction initiale et purification ultérieure. Le choix le plus approprié des méthodes et les conditions exactes utilisées dépend fortement les propriétés chimiques particulières du composé d’intérêt, en plus de la disponibilité de compétences et/ou de matériel. Il n’est pas possible d’inclure dans le présent protocole, une méthode totalement généralisable, étape par étape pour la transformation en aval de matériel foliaire des plantes récoltées au produit isolé qui pourrait être suivi aveuglément pour n’importe quel produit de triterpène d’intérêt, ne serait pas approprié tenter de le faire. Toutefois, ce protocole donnera un aperçu du flux de base utilisé dans notre laboratoire et certaines méthodes pour les premiers stades du processus, qui, selon notre expérience, sont sont avérés généralisables pour produits de triterpène aglycone plus oxygénés. Cela inclut deux techniques relativement rares, nommément Pressurized Solvent Extraction (PSE) et une méthode en phase hétérogène commode pour l’enlèvement de la chlorophylle à l’aide d’une résine échangeuse d’ions fortement basiques.

PSE est une technique très efficace pour l’extraction de petites molécules organiques des matrices solides. Les extractions sont effectuées sous pression (env. 100-200 bar), le principal avantage est la possibilité d’utiliser allégé des températures excédant l’ébullition point du solvant d’extraction. Cela peut réduire considérablement le temps et la quantité de solvant nécessaire pour obtenir une extraction exhaustive, par rapport aux autres techniques de solvants chauds comme simple reflux ou Soxhlet extractions¹⁶. Instruments de PSE-comptoir commerciales sont disponibles, qui utilisent des cellules interchangeables extraction et solvant automatisé de manipulation, de chauffage et surveillance. Ce qui rend cette technique extrêmement pratique. C’est aussi sans doute moins dangereux, en particulier pour les opérateurs ayant une expérience de chimie pratique limitée.

Saponification des extraits de feuilles brutes sous reflux suivie de séparation liquide/liquide est une technique courante pour les prélèvements massifs des chlorophylles avant purification ultérieure ou d’analyse. Toutefois, cela peut souvent être opérationnel exigeant sur plus grandes échelles. En outre, la détection de l’interface, ou la perte de produit dû à la formation d’émulsions peut être problématique. L’utilisation de résines échangeuses d’ions fortement basiques pour effectuer l’hydrolyse phase hétérogène peut constituer une alternative commode. La partie pigmentée de la chlorophylle hydrolysée reste collée à la résine et peut être simplement éliminée par filtration. Ce protocole utilise une adaptation de l’échelle préparative d’une procédure analytique précédemment rapporté¹⁷ qui utilise une résine échangeuse d’ions base disponible dans le commerce.

Ci-dessous, nous décrivons un protocole détaillé et rapid pour la production de l’échelle préparative de triterpènes utilisant cette plate-forme à base de plantes. Ce protocole est utilisé régulièrement dans notre laboratoire pour préparer des dizaines ou des centaines de milligrammes de produit triterpéniques isolés pour applications une telle caractérisation par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), et/ou approfondir dans fonctionnel dosages.

Remarque : Avant de suivre ce protocole, se familiariser avec la signalétique pour toutes les matières utilisées et prendre des précautions de sécurité appropriées. Ceux-ci incluent mais ne se limitent pas à : porter des lunettes de protection lorsque vous travaillez avec le verre sous vide et manipulation en gel de silice sec dans une hotte. Il est également essentiel que la législation locale concernant des matières transgéniques est vérifiée et constatée, suivant y compris échéant procédures de confinement.

1. générer des souches d’a. tumefaciens d’Infiltration

Remarque : Nous fournissons ici une description simplifiée des étapes requises pour générer adapté a. tumefaciens souches pour expression transitoire. Plus de détails de ces étapes sont décrites par Sainsbury et al. ⁸.

1. Amplification par PCR ou synthétiser la protéine codage région du gène d’intérêt flanqué de 5' et 3' attB séquences appropriés pour la génération d’un clone d’entrée pour une utilisation avec une recombinaison site-spécifique clonage Protocole^18,19.
   1. Utiliser avant apprêt : GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, Reverse primer : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = séquence spécifique de séquence).
   2. Utiliser des conditions PCR (représentante) : réaction mélange (25 µL, total), de tampon (x 5, 5 µL, voir Table des matières), dNTPs (10 mM, 0,5 µL), amorce vers l’avant (10 µM, 1,25 ml), Reverse primer (10 µM, 1,25 ml), modèle ADN (concentration variable, 50 – 250 ng, 0,5 µL ), ADN polymérase (2000 U/mL, 0,25 µL, voir Table des matières), une eau exempte de nucléase (à 25 µL). Exécutez le thermocycleur comme suit : dénaturation initiale (98 ° C, 30 s) ; démarrer le cycle (98 ° C, 30 s ; 45 à 72 ° C, 20 s ; 72 ° C, 30 s/kb) fin de cycle ; 35 cycles ; extension finale (72 ° C, 10 min).
   3. Suivez une recombinaison site-spécifique standard clonage Protocole^18,19 pour générer un clone d’entrée à l’aide de n’importe quel vecteur d’entrée non dotés kanamycine (nous utilisons pDONR207, qui est disponible dans le commerce).
      Remarque : L’intégrité du clone entrée doit être confirmée par le séquençage, avant de l’utiliser pour générer le pEAQ -HT-construct expression DEST1. Le pEAQ -HT-DEST1 est disponible sur demande auprès du laboratoire Lomonossoff du John Innes Centre à Norwich, Royaume-Uni.
   4. Isoler le pEAQ -HT-DEST1 vecteur du clone d’expression générée en étape 1.1.3 et conserver à-20 ° C avant de l’utiliser à l’étape 1.3.
      Remarque : N’importe quel kit de purification de plasmide basée sur les colonnes spin pratique disponible dans le commerce conçu pour extraire les plasmides de clonage des souches d’Escherichia coli est adapté. Suivez les instructions spécifiques de la purification de plasmide choisie nécessaire (voir la Table des matières).
2. Préparer chimiquement compétent a. tumefaciens transformation.
   1. Ensemencer une LB sélective (Luria-Bertani moyenne : 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/L de NaCl et extrait de levure 5 g/L, agar 10 g/L pH 7,0) Gélose (50 μg/mL que la rifampicine, 100 μg/mL de streptomycine), par a. tumefaciens LBA4404 des stries d’une culture de stock de glycérol. Incuber pendant la nuit à 28 ° C dans une étuve à debout.
   2. Inoculer 50 mL de milieux sélectifs de LB liquides (50 μg/mL rifampicine, 100 μg/mL de streptomycine) auprès d’un échantillon de cellules d’a. tumefaciens LBA4404 d’étape 1.2.1. Incuber une nuit à 28 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
   3. Refroidir la culture de l’étape 1.2.2 sur glace pendant 10 min et puis pellet les cellules a. tumefaciens par centrifugation à 4 ° C et 4500 x g pendant 5 min (jeter le surnageant).
   4. Resuspendre le culot d’étape 1.2.3 dans 1 mL de CaCl₂ soluté de glacé 20 mM et répétez l’étape de centrifugation de l’étape 1.2.3 (jeter le surnageant).
   5. Resuspendre le culot d’étape 1.2.4 dans 1 mL de glacé 20 mM en solution aqueuse CaCl₂ et partie aliquote de la suspension qui en résulte dans 50 lots µL. Flash gel les aliquotes dans liquide N₂ et conserver à-80 ° C avant de les utiliser.
3. Transformer le prêt LBA4404 a. tumefaciens avec l’isolé pEAQ -HT-DEST1 vecteur généré à l’étape 1.2.
   1. 50 µL de suspension a. tumefaciens générée à l’étape 1.2 sur la glace de fondre et incuber avec 100 \u2012 200 ng d’isolé pEAQ -HT-DEST1 vector, généré à l’étape 1.1, à 0 ° C pendant 5 min.
   2. Froid de choc la suspension incubée à l’étape 1.3.1 de liquide N₂ pour 30 s, puis laisser se pour réchauffer à température ambiante.
   3. Ajouter 200 μl de milieu SOC (SOC : 20 g/L bacto-tryptone, extrait de levure 5 g/L, 0,58 g/L de NaCl, 0,19 g/L de KCl, 2,03 g/L de MgCl₂, 2,46 g/L de sulfate de magnésium 7-hydrate, 3,6 g/L de glucose) de la suspension froide choquée d’étape 1.3.2 et incuber pendant 4 heures à 28 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
   4. Ensemencer une gélose sélective de gélose LB (50 μg/mL rifampicine, 50 kanamycine μg/mL, 100 μg/mL de streptomycine) avec la culture SOC de l’étape 1.3.3. Étendre complètement et incuber pendant 3 jours à 28 ° C dans une étuve à debout.
   5. Inoculer 5 mL de milieux sélectifs de LB (50 μg/mL rifampicine, 50 kanamycine μg/mL, 100 μg/mL de streptomycine) avec une seule colonie de l’étape 1.3.4. Incuber une nuit à 28 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
   6. Ajouter 200 μl de glycérol à 1 mL de la culture liquide de l’étape 1.3.5, bien mélanger et conserver à-80 ° C.
      Remarque : Cette culture peut être relancée pour de futures expériences par l’ensemencement sur gélose LB avec des antibiotiques appropriés (décrits ci-dessous).

2. préparer la Suspension de l’Infiltration

1. Ensemencer une gélose sélective de LB avec des stries de la désirée a. tumefaciens souches provenant du glycérol stock cultures générés à l’étape 1. Incuber pendant la nuit à 28 ° C dans une étuve à debout.
   Remarque : Une souche porteuse de tHMGR dans un pEAQ -HT-DEST1 vecteur peut-être également être inclus.
   1. Individuellement, inoculer 50 mL de milieux sélectifs de LB auprès d’un échantillon de chaque souche a. tumefaciens cultivé à l’étape 2.1 et incuber une nuit à 28 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
   2. Individuellement, les cultures de 50 mL de transfert de l’étape 2.1.1 à 1000 mL de milieux sélectifs de LB (rifampicine 50 μg/mL, kanamycine, 50 μg/mL streptomycine 100 μg/mL) et incuber une nuit à 28 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
   3. Individuellement a granulé le a. tumefaciens par centrifugation (4 000 x g), de la culture liquide générée à l’étape 2.1.2 (jeter le surnageant).
   4. Resuspendre individuellement les boulettes d’étape 2.1.3 dans 50 mL de tampon MMA fraîchement préparée (tampon de MMA : 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic d’acide à pH 5,6 (KOH), 10 mM MgCl₂, 150 μM 3'5 '-dimethoxy-4'-acétophénone) et incuber à température ambiante en l’obscurité pendant 1 h.
   5. Combiner le volume approprié de chaque suspension MMA a. tumefaciens (généré en étape 2.1.4) pour produire un final de l’OD₆₀₀ d’au moins 0,2 pour chaque souche dans un volume final total de 10 L.
   6. Tampon MMA supplémentaire s’ajoute les suspensions combinées générées à l’étape 2.1.5 pour un volume final de 1 L (utilisation immédiatement à l’étape 3).
      Remarque : Il est conseillé de préparer un 2 L supplémentaire de suspension d’infiltration pour maintenir le niveau de liquid au cours du processus d’infiltration.
   7. Préparer 1 L de tampon de MMA 10 x force.

3. Exécutez l’Infiltration sous vide

Remarque : Voir la Figure 2 pour obtenir une description de la construction d’appareils infiltration sous vide. Utilisez 5 semaines N. benthamiana plants dans des pots de 9 cm x 9 cm pour les étapes de la procédure. Les plantes doivent être semées en F1 compost (p. ex. de Levington) et pendant 2 semaines avant d’être transféré dans des pots individuels contenant compost F2. Plantes doivent être cultivées dans une serre à 25 ° C, avec 16 h par jour de lumière (utilisation complémentaire au besoin de l’éclairage), eau tous les jours, une densité maximale de 100 plantes/m².

1. Transférer le 1 L de la suspension d’infiltration générée à l’étape 2 et le 1 L de 10 x tampon de MMA de force à la baignoire de l’infiltration, suivie d’une supplémentaire 8 L d’eau.
   1. Enlevez les ailes détachables du porte-plante sur mesure, insérez 4 plantes (plantes 5 semaines voir note précédente) et rattacher les ailes. Inverser le titulaire et le placer sur le dessus de la baignoire infiltration afin d’immerger les feuilles dans la suspension d’infiltration.
      Remarque : S’assurer que le niveau de suspension atteint la surface supérieure du titulaire de la plante. Élever le niveau avec l’ajout de suspension infiltration supplémentaire si nécessaire.
   2. Le bain d’infiltration avec plantes submergées de transfert à la chambre de l’infiltration et fermer la porte. Vérifier que la valve d’admission d’air est fermée sur l’Infiltrateur. Mettre en marche la pompe à vide et ouvrir le robinet de la conduite vers le réservoir vide, suivi par la soupape d’aspiration sur la chambre de l’infiltration.
   3. Une fois que la pression dans la chambre d’infiltration a réduit de 880 mbar, fermer la soupape d’admission sous vide et ouvrir la valve d’admission d’air. Une fois que la chambre de l’infiltration est revenue à la pression atmosphérique, ouvrez la porte et retirer la baignoire de l’infiltration.
   4. Soulever le titulaire de la plante jusqu'à ce que les plantes sont submergées n’est plus dans la suspension de l’infiltration, puis secouez légèrement la porte pour laisser s’écouler les feuilles dans le bain d’infiltration la suspension excédentaire.
   5. Retourner le support en position verticale, de supprimer les ailes détachables et enlever les plantes.
   6. Répétez les étapes 3.1.1 à 3.1.5 jusqu'à ce que le nombre désiré de plantes ont été infiltré.
   7. Autoclaver la suspension d’infiltration utilisée avant l’élimination.
   8. Autoclave l’infiltration bain avant réutilisation dans des expériences ultérieures.
   9. Stériliser l’intérieur de la chambre de l’infiltration en le nettoyant avec l’éthanol à 70 % et laisser à l’air sec avant d’être réutilisés dans des expériences ultérieures.

4. cultiver les plantes infiltrés

1. Arranger les plantes infiltrés de l’étape 3 à une densité maximale de 100 plantes/m² dans une serre.
2. Croître durant 5 jours à 25 ° C et 16 h par jour de la lumière (utilisation complémentaire au besoin de l’éclairage) et l’eau tous les jours.

5. récolte les feuilles infiltrés

1. Après 5 jours de croissance, récolter les feuilles.
2. Autoclave de déchets végétaux, pots et le sol avant l’élimination.

6. séchez les feuilles récoltées

Remarque : La procédure exacte de lyophilisation décrite ci-dessous dépend de la nature de l’appareil de lyophilisation disponible disponible.

1. Lyophiliser les feuilles récoltées jusqu’au sec.
   1. Placer les feuilles récoltées dans un sac en polypropylène de 2 mm d’épaisseur. Congeler les feuilles récoltées en le stockant dans un congélateur à-80 ° C pendant 30 min.
   2. Perforer le sac avec beaucoup de petits trous à l’aide d’une épingle. Place les sac congelés laisse dans la chambre centrale de l’entrant. S’assurer que tous les robinets de fixation ballon sont fermés et allumez ensuite le lyophilisateur. S’assurer que le condensateur atteigne au moins-50 ° C et la pression diminue d’au moins 0,15 mbar et puis laisser une nuit.
   3. Éteignez le lyophilisateur et ventiler le vide en ouvrant un robinet d’attachement de fiole. Retirer les feuilles séchées de la chambre centrale et passez à l’étape 7.

7. pression d’Extraction par solvant

Remarque : Les étapes de l’instance se réfèrent à l’usage d’un instrument PSE disponible dans le commerce (voir Table des matières). Veuillez vous reporter à la documentation du fabricant pour plus d’informations sur l’opération. L’instrument effectue 4 extractions en parallèle.

1. Broyer les feuilles séchées en poudre cours via une méthode pratique (par exemple, pour la plupart des composés triterpéniques d’intérêt utiliser un robot de cuisine domestique, ou manuellement écraser les feuilles tandis que les contenus dans un sac).
   Remarque : Il n’est pas habituellement nécessaire de broyer avec un pilon et un mortier sous azote liquide.
   1. Mélanger la poudre de feuille avec du sable de quartz (0,3 \u2012 0,9 mm, 20 % en volume) dans un récipient adapté ; Cela agit comme un agent dispersant et améliore l’efficacité des procédés d’extraction.
2. Préparer 4 cellules d’extraction (120 mL) pour le remplissage. Pour ce faire, inverser les cellules extraction et insérez le filtre en fibre de verre, suivi par le métal fritté et tenant la fiche. Retourner les cellules de l’extraction à la verticale la position et ajoutent une couche profonde de 1 cm de sable de quartz (0,3 \u2012 0,9 mm).
3. Remplir les cellules de l’extraction.
   1. Remplir les cellules de l’extraction de la poudre de feuilles préparé généré à l’étape 7.1 jusqu'à la ligne de remplissage. Si nécessaire, compressez doucement la poudre au cours de ce processus afin de faciliter l’ajout d’une plus grande quantité dans chaque cellule de l’extraction.
   2. Ajouter une petite couche de sable de quartz (0,3 \u2012 0,9 mm) jusqu’au sommet de la poudre tassée et insérer le filtre cellulose haut de la page.
   3. Insérer les cellules extraction emballés dans l’instrument de PSE et exécuter la méthode souhaitée. Utilisez les paramètres suivants et le matériel ; Solvant : 100 % acétate d’éthyle ; température : 100 ° C, pression : 130 bar. Effectuez des cycles de 3 comme suit : cycle 1 : 0 min temps de maintien, cycle 2 et 3 : 5 min temps de maintien, se terminent par un éclat de solvant de 2 min et 12 min azote gaz RAS.
      Remarque : Il est recommandé d’optimiser tout d’abord la méthode d’extraction à petite échelle. Cependant, la méthode suivante est souvent suffisante pour plus oxydé triterpène aglycones. La liqueur de chaque cellule d’extraction peut être combinée dans le même récipient externe en spécifiant la conduite comme la destination de l’extraction, au lieu des lignes de collecte individuelle standard. Sachez que la quantité de solvants utilisée dépend de l’emballage des cellules de l’extraction et la température et la pression. La méthode ci-dessus génère généralement environ 800 mL de liqueur d’extraction pour 4 extractions parallèles.
   4. Répétez les étapes 7.2 à 7.3.3 jusqu'à ce que toute la poudre de feuille a été traitée.
   5. Concentrer l’alcool combiné extraction à sec, par l’intermédiaire de l’évaporateur rotatif sous vide. Recherchez les résultats escomptés (c.-à-d., coulis vert foncé).
      Remarque : La procédure exacte peut varier selon l’ensemble vers le haut de l’évaporateur rotatif disponible. Toujours porter une protection oculaire lors de l’exécution d’évaporateur rotatif et vérifier la verrerie des dommages avant de le soumettre à des conditions de vide.
      1. Allumez le recycleur de refroidisseur et laisser le liquide de transfert de chaleur refroidir jusqu'à au moins 5 ° C. Allumez le bain-marie et régler la température à 35 ° C.
      2. Transférer la liqueur d’extraction dans une fiole d’évaporation (ne pas remplir plus de la moitié du volume du ballon). Concentrer l’alcool batch-wise (dans le même ballon) si le volume total est supérieur à cela. Fixer le ballon rempli d’évaporation à la vapeur-conduit de l’évaporateur rotatif (sécurisé avec un clip mixte).
      3. Ajuster la position de levage de fiole et l’angle, afin de plonger au fond troisième de la fiole d’évaporation dans le bain d’eau à un angle de 45 ° environ. Lancer le ballon filer à une vitesse qui commence à se répandre de la liqueur d’extraction sur les murs de la fiole.
      4. Vérifier que le robinet d’évacuation est fermé et de commencer à réduire la pression (en utilisant le contrôleur de la pompe à vide) jusqu'à ce qu’une goutte à goutte modérée est observée entre la fiole du condenseur et le récepteur.
         Remarque : Ne pas laisser la liqueur d’extraction commencer à bouillir. Dans ce cas réduire la puissance de l’aspirateur pour apporter la distillation sous contrôle.
      5. Surveiller et régler la vitesse de force et un essorage sous vide selon le cas jusqu'à ce que tout le solvant s’évapore.

8. traitement de résine échangeuse d’ions base pour l’enlèvement des chlorophylles

Remarque : Les quantités citées dans les étapes suivantes supposent une échelle originale de travail de 100 \u2012 150 plantes. Étape 8 n’est pas adapté aux produits contenant de l’acide carboxylique groupes ou groupes fonctionnels qui serait être hydrolysés dans des conditions basiques tels que les esters.

1. Dissoudre l’extrait brut généré à l’étape 7 dans un volume minimal d’éthanol.
2. Ajouter 50 mL de perles de résine échangeuse d’ions base (voir la Table des matières) à la sortie de l’étape 7.1.1 et agiter à température ambiante pendant 30 min.
   Remarque : Ne substituez pas agité pour l’utilisation des appareils. Tableau magnétique ou mécanique en remuant peut compromettre l’intégrité des perles de résine. Agitation convenable peut également être idéalement réalisée par rotation lente du ballon à réaction sur un évaporateur rotatif avec l’aspirateur réglé à la pression atmosphérique ou déconnecté.
3. Ajouter 50 mL supplémentaire de perles de résine échangeuse d’ions base toutes les 30 minutes jusqu'à ce que la réaction est allé jusqu'à la fin ; les perles de résine échangeuse d’ions base passe du rose au vert en couleur, et la phase liquide passe du vert à l’orange ou une couleur brun sombre selon l’échelle.
   1. En cas de doute que la réaction est allé jusqu'à la fin, l’échantillon 0,5 mL du liquide. Filtrer l’échantillon à travers une petite colonne de la terre de diatomées et d’observer la couleur du filtrat ; la réaction est généralement complète au sein de 1,5 h.
4. Filtrer le mélange réactionnel dans une colonne courte de la terre de diatomées.
   1. Exécutez cette fonction via la filtration sous vide ou par une colonne de chromatographie flash de verre à l’aide de soufflets de main à appliquer une pression. Si le taux de filtration ralentit, perturber la partie supérieure de la garniture de la terre de diatomées avec un agitateur. Recueillir le filtrat.
5. Rincer les billes de résines recueillies avec l’éthanol, suivie de 1:1 éthanol : hexane et enfin l’hexane. Utiliser un volume de rinçage suffisant pour remettre en suspension les perles sur le dessus de la colonne de la terre de diatomées.
6. Combiner le filtrat de l’étape 8.4 et les rinçages à l’étape 8,5 et concentré à sec par un évaporateur rotatif sous vide.

9. premier fractionnement rugueux

Remarque : La méthode suivante convient habituellement aux aglycones typique triterpène oxydé et emploie un instrument automatisé de chromatographie flash. Reportez-vous à la documentation du fabricant pour plus de détails sur l’opération.

1. Absorber le produit brut généré à l’étape 8 sur gel de silice flash grade (taille des pores : 60 Å, taille des particules : 35 \u2012 75 μm) pour l’application sur une cartouche de chromatographie flash via la méthode de chargement sec.
   1. Dissoudre le produit brut généré à l’étape 8, dans un volume minimal de solvant organique. Assurer une dissolution complète.
      Remarque : Dichlorométhane additionnée de quelques gouttes de méthanol est habituellement un choix approprié de solvant.
   2. Dévisser la partie supérieure d’une cartouche de chromatographie flash préremplie de 100 g (voir Table des matières) et enlever l’insert pour révéler l’espace de tête de chargement sec. Utilisez l’espace de tête pour mesurer le volume approprié de gel de silice pour chargement sec.
   3. Transférer le volume mesuré de gel de silice pour chargement sec sur la solution du produit brut, puis enlever le solvant évaporateur rotatif sous vide.
      Remarque : Le gel de silice doit retourner à une poudre libre. Vers la fin de l’évaporation processus léger grattage peut être nécessaire pour libérer le gel de silice du côté de la fiole d’évaporation.
   4. Equilibrer la cartouche de chromatographie flash 100 g à 100 mL/min, au moins 5 volumes de colonne d’hexane de 100 %, mais idéalement jusqu'à ce que le contenu de la cartouche soit complètement et uniformément humidifié.
   5. Transférer le gel de silice de chargement sec préparé généré à l’étape 9.1.3 à l’espace de tête sec de chargement de la cartouche de chromatographie flash g 100 équilibré, en versant. Suspension dans l’hexane et une large bouche pipette peut être utilisée pour faciliter le transfert de tout gel de silice sec chargement restant.
   6. Le gel de silice de chargement sec transféré lit avec 100 % hexane pour chasser l’air de l’espace de chargement sec humide.
   7. Exécuter la méthode de chromatographie en phase suivante : solvant [A] : hexane, solvant [B] : acétate d’éthyle, débit : 100 mL/min, pente : 0 % [B] à 100 % [B] plus de 3000 mL, Collection : recueillir tous, taille de Fraction : 250 mL.
   8. Analyser les fractions par couche mince chromatographie (TLC)⁸ ou⁸de la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et la concentration à sec le procède contenant le composé d’intérêt via l’évaporateur rotatif sous vide.
2. Effectuer purification fine en aval jusqu'à ce que le niveau de pureté désiré est atteint.
   Remarque : Purification de fine en aval est entièrement composé spécifique et il n’est pas possible de fournir des mesures normalisées (voir la section « discussion »).

Les rendements isolés typiques dépendent de la combinaison d’enzyme/enzymes sous enquête, la stabilité chimique du composé cible et comment contester le processus de purification a été. Nous avons déjà rapporté des rendements isolés de β-amyrine dérivés de nos expériences de biosynthèse combinatoire variant de 0,12 à 3,87 mg par gramme de poudre de feuilles de N. benthamiana à sec. Ces composés variaient grandement dans le niveau d’oxydation et inclus des combinaisons non naturels d’enzymes (Figure 3)8. Ce protocole est utilisé régulièrement dans notre laboratoire pour produire des dizaines ou des centaines de milligrammes de produit purifié pour la caractérisation par spectroscopie RMN et essais fonctionnels en aval. Nous avons aussi démontré l’utilité préparative de cette plate-forme de production de 0,8 g de l’échafaudage de triterpène β-amyrine à une pureté supérieure à 98 %. Cette expérience utilisé 459 plantes et représente un rendement isolé de 3,3 mg par gramme de sec N. benthamiana feuille poudre8.

Figure 1 : Résumé schématique. Représentation schématique du processus exploitant l’expression transitoire des enzymes biosynthétiques dans N. benthamiana feuille de détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production préparative de nouveaux produits de haute valeur triterpène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : vide construction infiltré et processus. un) Ad hoc plante porte une aile détachée. b) Bespoke plante porte aile. c) Inversion et la submersion des plantes. d) d’Insertion de la baignoire de l’infiltration. e) Infiltration bain en place au sein de la chambre de l’infiltration. f) Complete infiltré sous vide : pompe à vide (1) (2) raccordement de pompe à vide à vanne aspiration réservoir vide (3) réservoir (4) la connexion entre le réservoir vide et la soupape d’admission infiltration chambre Air (5) Manomètre (6) (7) Réservoir de vide infiltration chambre (8). g) représentant les feuilles d’une plante infiltrée par une construction de l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) après cinq jours après l’infiltration de croissance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : signalé auparavant des résultats représentatifs pour la production préparative de β-amyrine dérivés utilisant ce protocole8. Ce tableau est trié par rendements isolés. Les colonnes sont conditionnellement formatés avec indication de la couleur de la valeur relative. Rouge = haut, vert = low (jaune bien intermédiaire). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.