Method Article

Synthèse, caractérisation et application de nanosons à oxyde de fer superparamagnetic pour la détection de la tuberculose extrapulmonaire

DOI:

10.3791/58227

⸱

February 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, 2Department of Research and Department of Dentistry, Taipei Medical University / Shuang-Ho Hospital, 3Department of Pathology, Taipei Medical University, 4Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 5McLean Imaging Center, McLean Hospital/Harvard Medical School, 6Department of Physical Medicine and Rehabilitation, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Department of Medicine, Mackay Medical College, 8Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, 9Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

In This Article

Summary

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Pour améliorer les tests de diagnostic sérologiques pour les antigènes de mycobacterium tuberculosis, nous avons développé des nanosondes d’oxyde de fer superparamagnetic pour détecter la tuberculose extrapulmonaire.

Abstract

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Une sonde d’imagerie moléculaire comprenant des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnetic (SPIO) et un anticorps de surface De mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) a été synthétisée pour améliorer la sensibilité d’imagerie pour la tuberculose extrapulmonaire (ETB). Une nanosonde SPIO a été synthétisée et conjuguée avec MtbsAb. La nanoprobe purifiée de SPIO-MtbsAb a été caractérisée utilisant TEM et NMR. Pour déterminer la capacité de ciblage de la sonde, les nanosondes SPIO-MtbsAb ont été incubées avec Mtb pour des essais d’imagerie in vitro et injectées dans des souris inoculées par Mtb pour une recherche in vivo avec résonance magnétique (MR). La réduction d’amélioration de contraste sur la formation image de résonance magnétique (MRI) des cellules de Mtb et de THP1 a montré proportionnelle à la concentration de nanoprobe de SPIO-MtbsAb. Après 30 min d’injection intraveineuse de nanoprobe de SPIO-MtbsAb dans les souris Mtb-infectées, l’intensité de signal du site granulomatous a été augmentée par 14 fois dans les images de MR T2-weighted comparées à cela dans les souris recevant l’injection de PBS. Les nanosondes MtbsAb peuvent être utilisées comme une modalité nouvelle pour la détection ETB.

Introduction

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À l’échelle mondiale, la tuberculose extrapulmonaire (ETB) représente une proportion importante des cas de tuberculose. Néanmoins, le diagnostic d’ETB est souvent manqué ou retardé en raison de sa présentation clinique insidieuse et de la performance pauvre sur des essais diagnostiques ; les faux résultats incluent des frottis de sputum négatifs pour les bacilles acide-rapide, le manque de tissu granulomatous sur l’histopathologie, ou l’échec à la culture Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Par rapport aux cas typiques, etB se produit moins fréquemment et implique peu de libération du bacille de Mtb. En outre, il est généralement localisé à des sites difficiles d’accès, tels que les ganglions lymphatiques, pleura, et les zones ostéo-articulaires1. Ainsi, les procédures invasives pour l’obtention de spécimens cliniques adéquats, ce qui rend la confirmation bactériologique risquée et difficile, sont essentielles2,3,4.

Les tests de détection d’anticorps disponibles dans le commerce pour etb ne sont pas fiables pour la détection clinique en raison de leur large gamme de sensibilité (0,00-1,00) et de leur spécificité (0,59-1,00) pour tous les sites extrapulmonaires combinés5. Des tests immunospot liés à l’enzyme (ELISPOT) pour l’interféron, la protéine de filtrate de culture (CFP) et la cible antigénique de sécrétion précoce (ESAT) ont été utilisés pour diagnostiquer la tuberculose latente et active. Cependant, les résultats varient entre les différents sites de la maladie pour diagnostiquer ETB6,7,8. En outre, la PPD de peau (dérivé purifié de protéine) et QuantiFERON-TB ont fréquemment fourni de faux résultats négatifs9. QuantiFERON-TB-2G est un test de réactivité immunitaire du sang entier, qui ne nécessite pas un spécimen de l’organe affecté et cela peut être un outil de diagnostic alternatif6,10,11. D’autres méthodes diagnostiques généralement utilisées pour la méningite tuberculeuse, comme la réaction en chaîne de polymérase, sont encore trop insensibles pour exclure en toute confiance le diagnostic clinique12,13. Ces tests conventionnels démontrent l’information diagnostique insuffisante pour découvrir le site d’infection extrapulmonaire. Ainsi, de nouvelles modalités diagnostiques sont cliniquement requises.

L’imagerie moléculaire vise à concevoir de nouveaux outils qui peuvent examiner directement les cibles moléculaires spécifiques des processus de la maladie in vivo14,15. L’oxyde de fer superparamagnetic (SPIO), un agent de contraste RmN pondéré par T2, peut augmenter de manière significative la spécificité et la sensibilité de l’imagerie par résonance magnétique (IRM)16,17. Cette nouvelle modalité d’imagerie fonctionnelle peut esquisser avec précision les changements tissulaires au niveau moléculaire par le biais d’interactions ligand-récepteur. Dans cette étude, une nouvelle sonde d’imagerie moléculaire, comprenant des nanoparticules DePIO, a été synthétisée pour conjuguer avec l’anticorps de surface DeMtb (MtbsAb) pour le diagnostic ETB. Les nanosondes SPIO sont peu invasives pour les tissus et les corps soumis à l’examen18,19. En outre, ces nanosondes peuvent démontrer des images précises de M. à de faibles concentrations en raison de leurs propriétés paramagnétiques. En outre, les nanosondes SPIO semblent susciter les réactions allergiques les moins graves parce que la présence d’ions de fer fait partie de la physiologie normale. Ici, la sensibilité et la spécificité des nanosondes SPIO-MtbsAb ciblant ETB ont été évaluées dans les modèles cellulaires et animaux. Les résultats ont démontré que les nanoprobes étaient applicables en tant qu’agents d’imagerie ultrasensibles pour le diagnostic d’ETB.

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Protocol

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Tout protocole concernant l’expérimentation animale suit les procédures d’exploitation standard pour l’élevage d’animaux de laboratoire conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (8e édition, 2011) et est approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

1. Synthèse des nanoparticules SPIO

  1. Préparer des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer recouvertes de dextran en remuant vigoureusement un mélange de dextran T-40 (5 ml; 50 % w/w) et de FeCl aqueuse3x 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) et de FeCl2x 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) à température ambiante.
  2. Ajouter NH4OH (10 mL; 7,5% v/v) rapidement.
  3. Remuer encore la suspension noire pendant 1 h; par la suite, centrifugeuse à 17 300 x g pendant 10 min, puis retirer les agrégats.
  4. Séparer les produits SPIO finals de dextran T-40 non lié par la chromatographie de filtration de gel20.
  5. Chargez le mélange de réaction (volume total de 5 ml) dans une colonne de 2,5 cm à 33 cm et élichez-vous à l’abri d’une solution tampon contenant 0,1 M d’acétate Na et 0,15 M NaCl au pH 7,0.
  6. Recueillir les nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer purifiés enduits de dextran dans le volume vide et d’analyse de la colonne élute pour le fer et le dextran à 330 et 490 nm en utilisant l’acide chlorhydrique et les méthodes de phénol/acide sulfurique20, respectivement.

2. Synthèse SPIO-MtbsAb

  1. Synthétiser l’EDBE conjugué à SPIO à l’aide de méthodes précédemment signalées21,22.
  2. Synthétiser l’anhydride SPIO-EDBE-succinic (SA).
    1. Remuer une solution alcaline (5 M NaOH; 10 ml)) de SPIO-EDBE et SA (1 g; 10 'mol) à température ambiante pendant 24 h.
    2. Dialyser la solution avec 20 changements de 2 L d’eau distillée à l’aide d’un tube à membrane poreux moléculaire (coupure de 12 000 à 14 000 MW). 6 h pour chaque changement.
  3. Enfin, ajouter 100 oL de SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml de Fe) à 400 oL de MtbsAb de 4,5 mg/mL pour synthétiser SPIO-MtbsAb en utilisant 1-hydroxybenzotriazole et (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate comme catalyseurs et remuer la solution à température ambiante pendant 24 h.
  4. Enfin, séparer les solutions de l’anticorps non lié par la chromatographie de filtration de gel.
  5. Chargez le mélange de réaction (5 ml) sur une colonne de 2,5 cm à 33 cm et élichez-vous à l’aide d’un tampon PBS. Confirmer le complexe d’Ab-nanoparticules (c.-à-d. nanoprobe) à l’aide d’un kit d’analyse de protéines d’acide bicinchoninique23.

3. Observation de morphologie de particules et mesure de niveau de relaxation

  1. Examiner la taille moyenne des particules, la morphologie et la distribution de la taille à l’aide d’un microscope électronique de transmission à une tension de 100 kV.
    1. Déposer la dispersion composite sur une grille de cuivre de 200 mailles et sécher à l’air à température ambiante avant de la charger sur le microscope.
  2. Mesurer les valeurs de temps de relaxation (T1 et T2) des nanoprobes à l’aide du relaxomètre RMN à 20 MHz et 37,0 oC et 0,1 oC.
    1. Calibrer le relaxomètre avant chaque mesure.
    2. Enregistrez les valeurs r1 et r2 des huit points de données générés par l’inversion-récupération et la séquence d’impulsion Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivement, pour déterminer r1 et r2 relaxivités20.

4. Imagerie cellulaire

  1. Cultiver les monocytes humains THP-1 dans RPMI 1640 avec 10 % de sérum bovin fœtal, 50 g/mL de sulfate de gentamycine, 100 unités/mL de pénicilline G sodium, 100 g de sulfate de streptomycine et 0,25 g/mL de fongicides dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC.
  2. Incuber les nanosons SPIO-MtbsAb (2 mM) avec 106 unités de formation de colonies (CFU) de Mycobacterium bovis BCG préincubtées avec 1 à 107 monocytes activés dans des tubes microcentrifuges (1 ml) dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC pour 1 h.
  3. Tubes centrifugeà à 200 x g et jetez le supernatant. Redissoudrez les granulés dans le milieu (200 l).
  4. Scanner les échantillons à l’aide d’une séquence d’impulsion d’écho à gradient rapide (temps de répétition (TR) 500; Temps d’écho (TE) 20; Angle de basculement à 10 degrés) par IRM 3.0-T pour déterminer la spécificité et la sensibilité de la nanoprobe21,22.

5. Vaccination BCG (Bacillus Calmette-Guérin)

  1. Reconstituer le vaccin lyophilisé ou le stock bactérien dans le milieu de Sauton, puis diluer le stock avec salin jusqu’à ce qu’il soit correctement dispersé comme décrit précédemment24.
  2. Inoculer une souche vivante atténuée de M. bovis BCG, obtenue à partir d’ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (souche Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) à un volume de 0,1 ml/souris (c.-à-d., 107 CFU) intraderdement dans la peau scapulaire dorsal gauche ou droite de souris, comme décrit précédemment23. Injecter de la salin dans les souris comme contrôle négatif. Surveillez les animaux tous les jours après l’inoculation du BCG.
  3. Sacrifiez les animaux 1 mois après l’inoculation de bactéries utilisant l’euthanasie de dioxyde de carbone. Récoltez le tissu du site d’inoculation intradermique. Fixer le tissu en formaline à 10 % et incorporer dans la paraffine pour les sections de série à 5-10 m. Les sections de tissu de tache avec l’hématoxylin/eosin et les taches de Ziehl-Neelsen pour les bactéries acide-rapide24 et avec le bleu de Berlin pour le fer ferrique25.

6. IRM in vivo

  1. Injecter de la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) et de la xylazine (12 mg/kg de poids corporel) sous-cutanée chez les souris pour l’anesthésie animale.
  2. Injecter des sondes SPIO-TbsAb (2 nmol/200 l) dans les veines de la queue des souris. Souris d’image de M. avant et immédiatement après l’injection de sonde et puis toutes les 5 minutes pendant 30 min pour acquérir des images d’écho rapide de spin-écho T2 -(TR - 3000 ; TE 90; champ de vision no 8).
  3. Analyser quantitativement toutes les images MR à l’aide de l’intensité du signal (SI), une mesure des régions définies d’intérêt dans des endroits comparables d’un centre de granulome Mtb et le muscle arrière adjacent à une zone granulomateuse.
  4. Calculer les améliorations relatives du signal à l’aide de la mesure SI avant (SIpre; contrôle) et 0-3 h après l’injection (SIpost) des agents de contraste à l’aide de la formule

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] 100

    où SIpre est le SI de la lésion sur le scan pré-amélioré et SIpost est le SI de la lésion sur le scan post-amélioré21,22.

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Results

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Synthèse et caractérisation des nanosons SPIO-MtbsAb
Les nanoparticules SPIO ont été conçues pour se conjuguer avec MtbsAb. Le dextran stabilisé à la surface des nanoparticules SPIO a été relié par l’épichlorohydin. Les nanoparticules SPIO ont ensuite été incorporées avec EDBE pour activer les groupes fonctionnels primaires d’amine aux extrémités dextran. SA a ensuite été conjugué pour former SPIO-EDBE-SA. Les nanosondes SPIO-MtbsAb se sont formées dans la dernière étape par la conjugaison de MtbsAb a...

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Discussion

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Semblable aux études pertinentes, nos résultats concernant les nanoprobes de SPIO-MtbsAb ont démontré une spécificité significative pour Mtb27,28. Le granulome sous-cutané de Mtb a été trouvé 1 mois après injection de tb dans les modèles de souris. Les résultats typiques d’histologie granulomatetous de TB ont inclus l’infiltration de lymphocyte, la présence des macrophages épithélioïdes, et la néovascularization. Des bacilles acide-rapides ont été dispersés dans ...

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Disclosures

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Aucun des auteurs n’a d’intérêt exclusif dans les documents examinés dans cette étude.

Acknowledgements

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Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du ministère de l’Économie taiwanais (subventions NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) pour effectuer ce travail de recherche. Ce manuscrit a été édité par Wallace Academic Editing.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphateSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazoleSigma-Aldrich
dextran(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
épichlorhydrine, 2,2'-(éthylènedioxy)bis(éthylamine)Sigma-Aldrich
chlorure ferrique hexahydratéFluka
chlorure ferreux tétrahydratéFluka
Monocytaire humain THP-1
M. bovis BCGPasteur Mé ; rieuxConnaught souche ; ImmuCyst Aventis
MRIGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR relaxomètreBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
Tube à membrane poreuse moléculaire SPECTRUM, 12 000 -14 000 MW coupé SpectrumLaboratories Inc
Anticorps de surface TB - Anticorps polyclonal à MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
microscope électronique à transmissionJEOLJEM-2000 EX II

References

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